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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610945616.5 (22)申请日 2016.10.26 (71)申请人 四川大学华西第二医院 地址 610000 四川省成都市武侯区人民南 路3段20号 (72)发明人 周容 刘希婧 周盛萍 龚云辉 王艳云 代莉 贾瑾 (74)专利代理机构 成都天嘉专利事务所(普通 合伙) 51211 代理人 史姣姣 (51)Int.Cl. A61K 38/45(2006.01) (54)发明名称 Ad-sAxl在子痫前期大鼠模型的建立中的应 用及子痫前期大鼠模型的建立方法 (57)。
2、摘要 本发明提供一种Ad-sAxl在子痫前期大鼠模 型的建立中的应用及子痫前期大鼠模型的建立 方法， 通过尾静脉注射Ad-sAxl至孕母鼠体内构 建子痫前期的大鼠模型该子痫前期的大鼠模型 具有血压升高、 蛋白尿及心、 肝、 肾等重要脏器损 害等子痫前期的特征性症状和体征改变， 与人类 子痫前期的症状体征及病理过程相符， 并能反应 疾病的系统性和严重程度， 操作可控性好、 稳定 性佳。 可用于研究子痫前期的发生发展机制及防 治措施。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 106310238 A 2017.01.11 CN 106310238 A 1.一种Ad-sAxl在子痫前期大鼠模型的建。
3、立中的应用。 2.一种如权利要求1所述的子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 包括下述步 骤： （1） 选择清洁级SD大鼠， 雌雄合笼比例1:3， 当同时观察到阴栓及精子确定妊娠并定为 妊娠0天； （2） 在大鼠孕第8天经尾静脉注射Ad-sAxl； （3） 通过监测其血压、 尿蛋白、 生化指标和观察主要脏器病理改变来确定模型构建是否 成功。 3.根据权利要求2所述的一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 在步骤 （1） 中， 所述的SD大鼠体重250-280g， 周龄8周。 4.根据权利要求2所述的一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 在步骤 （2） 中， 所述Ad-s。
4、Axl的剂量为2109 pfu。 5.根据权利要求2所述的一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 所述方法还 包括通过检测孕0天体重确定大鼠体重基线值， 通过检测孕前及孕1、 3、 5、 7天血压确定血压 基线值， 通过检测孕前及孕4天的24小时尿蛋白确定尿蛋白的基线值。 6.根据权利要求2所述的一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 确定子痫前 期大鼠模型建立是否成功的方法包括检测注射Ad-sAxl后大鼠的无创血压、 有创血压、 24小 时尿蛋白； 孕19天孕鼠体重、 外周血血常规、 生化指标； 孕19天行剖宫产取出仔鼠计数并测 顶臀长、 体重、 胎盘称重及通过组织病理学观察。
5、大鼠主要脏器的病理改变。 7.根据权利要求6所述的一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 在孕9、 11、 13、 15、 17天用无创血压检测仪监测大鼠血压， 孕12、 16天监测24小时尿蛋白； 孕19天测孕鼠 有创血压。 8.根据权利要求2所述的一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 其特征在于： 所述主要脏 器包括心脏、 肝脏、 肾脏、 胎盘。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106310238 A 2 Ad-sAxl在子痫前期大鼠模型的建立中的应用及子痫前期大 鼠模型的建立方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学领域， 具体涉及Ad-sAxl在子痫前期大鼠模型的建立中。
6、的应 用及子痫前期大鼠模型的建立方法。 背景技术 0002 子痫前期是以妊娠20周后出现血压升高和蛋白尿为主要特征的妊娠期特有疾病， 可累及全身多个器官， 严重威胁母胎健康。 子痫前期发病机制尚不明确， 但目前研究认为其 发生与早期滋养细胞侵袭障碍及螺旋动脉重铸障碍密切相关， 而机体广泛的血管内皮损伤 是该疾病进一步发展并呈现出多种程度不一临床表现的关键环节。 其中促血管生成与抗血 管生成的失衡不仅在局部影响滋养细胞侵袭及螺旋动脉重铸， 还能引起机体广泛的血管内 皮损伤， 是子痫前期发生发展的中心环节。 0003 由于人体实验的医学伦理学制约， 动物模型成为研究子痫前期发生发展及探索防 治措施。
7、的重要工具， 然而目前并没有能很好反应子痫前期这种疾病严重程度的动物模型。 锯齿类动物胎盘形成方式与滋养细胞侵袭程度与人类接近， 母体有子宫小血管重塑的表 现， 造模成功后， 可部分或全部出现子痫前期的关键表型。 既往采用的子痫前期大鼠模型为 通过大鼠尾静脉注射腺病毒构建的sFlt-1， 但此模型一般不会出现多器官脏器的损害， 不 能很好的反应该疾病的严重程度。 0004 Axl为受体酪氨酸激酶亚家族成员， 与其受体Gas6结合后具有促血管生成、 维持血 管通透性和完整性的作用。 sAxl为Axl的可溶性成分， 研究证实sAxl可与Gas6竞争性结合， 从而阻断Axl与Gas6的结合， 抑制G。
8、as6-Axl介导的信号通路， 最终导致血管生成异常、 动脉 重铸障碍、 血管内皮细胞损伤以及血管通透性改变。 我们前期研究表明sAxl在子痫前期患 者血浆中显著升高并可反映该疾病的严重程度， 这为建立sAxl的子痫前期动物模型奠定了 科学基础。 发明内容 0005 本发明旨在解决现有技术通过大鼠尾静脉注射腺病毒构建的sFlt-1建立的子痫 前期大鼠模型不会出现多器官脏器的损害， 不能很好的反应该疾病的严重程度的问题， 提 供一种通过尾静脉注射Ad-sAxl至孕母鼠体内构建子痫前期的大鼠模型及子痫前期的大鼠 模型具体建立方法， 该子痫前期的大鼠模型具有血压升高、 蛋白尿及心、 肝、 肾等重要脏。
9、器 损害等子痫前期的特征性症状和体征改变， 与人类子痫前期的症状体征及病理过程相符， 并能反应疾病的系统性和严重程度， 操作可控性好、 稳定性佳。 可用于研究子痫前期的发生 发展机制及防治措施。 0006 为解决上述技术问题， 本发明通过以下技术方案实现： 一种Ad-sAxl在子痫前期大鼠模型的建立中的应用。 本发明首次将Ad-sAxl应用于子痫 前期大鼠模型的建立中。 说 明 书 1/4 页 3 CN 106310238 A 3 0007 一种子痫前期大鼠模型的建立方法， 包括如下步骤： （1） 选择清洁级SD大鼠， 雌雄合笼比例1:3， 当同时观察到阴栓及精子确定妊娠并定为 妊娠0天； （。
10、2） 在大鼠孕第8天经尾静脉注射Ad-sAxl； （3） 监测其血压、 尿蛋白、 生化指标， 观察主要脏器病理改变来确定模型构建 是否成功。 0008 优选的， 在步骤 （1） 中， 所述的SD大鼠体重为250-280g， 周龄8周。 0009 优选的， 在步骤 （2） ， 所述Ad-sAxl的剂量为2109 pfu。 0010 所述方法还包括通过检测孕0天体重确定大鼠体重基线值， 通过检测孕前及孕1、 3、 5、 7天血压确定血压基线值， 通过检测孕前及孕4天的24小时尿蛋白确定尿蛋白的基线 值。 0011 本发明中， 确定子痫前期大鼠模型建立是否成功的方法包括检测注射Ad-sAxl后 大鼠。
11、的无创血压、 有创血压、 24小时尿蛋白； 孕19天孕鼠体重、 外周血血常规、 生化指标； 孕 19天行剖宫产取出仔鼠计数并测顶臀长、 体重、 胎盘称重及通过组织病理学观察大鼠主要 脏器的病理改变。 0012 在孕9、 11、 13、 15、 17天用无创血压检测仪监测大鼠无创血压， 孕12、 16天监测24小 时尿蛋白； 孕19天测孕鼠有创血压。 0013 所述主要脏器包括心脏、 肝脏、 肾脏、 胎盘。 0014 本发明具有以下有益效果： 1、 本发明通过尾静脉注射Ad-sAxl至孕母鼠体内， 构建子痫前期的大鼠模型， 建立的子 痫前期大鼠模型具有血压升高、 蛋白尿及心、 肝、 肾等重要脏器。
12、损害等子痫前期的特征性症 状和体征改变， 与人类子痫前期的症状体征及病理过程相符， 并能反应疾病的系统性和严 重程度， 操作可控性好、 稳定性佳。 可用于研究子痫前期的发生发展机制及防治措施。 0015 本发明的雌雄合笼比例控制为1:3， 能最大程度保障交配成功率， 从而保证模型建 立实验的有序进行， 避免实验过程长时间不能交配成功导致实验周期加长的问题。 0016 大鼠妊娠分为妊娠早期 （孕0-7天)， 妊娠中期 （孕8-14天） 和妊娠晚期 （孕15-21 天） ， 而人类子痫前期的发病是在妊娠20周及以后 （相当于妊娠中期的早期） 本发明经过大 量实践研究， 选择在大鼠孕第8天经尾静脉注。
13、射Ad-sAxl， 相当于大鼠的妊娠中期 （8-14） ， 另 经尾静脉注射Ad-sAxl能保证血液中维持恒定浓度的Ad-sAxl， 因此， 在大鼠孕第8天经尾静 脉注射Ad-sAxl能最大程度模拟人类子痫前期的发病， 保证模型的可靠性。 0017 2、 大量实践研究证明， 本发明选用体重为250-280g， 周龄8周的SD大鼠， 这一体重 和周龄的大鼠具有最强的生殖能力， 充分满足实验的需要。 0018 3、 Ad-sAxl剂量过小会出现实验孕鼠不能出现所有的血压升高、 24小时尿蛋白增 加及机体重要脏器病理改变， 影响建立得到的大鼠模型的可靠性； 又因为Ad-sAxl成本昂 贵， 如果剂量。
14、过大， 则会大幅度增加建立模型的成本， 不利于后期推广使用， 本发明经过大 量实践研究， 发现在Ad-sAxl的剂量为2109 pfu的情况下， 既能使实验孕鼠出现血压升 高、 24小时尿蛋白增加及机体重要脏器的病理改变， 符合子痫前期的病理改变； Ad-sAxl的 成本又得到了有效的控制。 0019 4、 本发明在孕9、 11、 13、 15、 17天用无创血压检测仪监测大鼠血压， 孕12、 16天监测 说 明 书 2/4 页 4 CN 106310238 A 4 24小时尿蛋白； 孕19天测孕鼠有创血压， 能客观反映干预后实验孕鼠的动态血压变化情况 及24小时尿蛋白的动态变化情况从而使得实。
15、验结果真实、 可信， 更有说服力。 附图说明 0020 图1为SD大鼠收缩压测定值变化图； 图2为SD大鼠舒张压测定值变化图； 图3为SD大鼠24小时尿蛋白测定值变化图； 图4为Ad-sAxl组SD大鼠肾脏HE染色病理变化图； 图5为Ad-Fc组SD大鼠肾脏HE染色病理变化图； 图6为生理盐水组SD大鼠肾脏HE染色病理变化图； 图7为Ad-sAxl组SD大鼠肾脏CD31免疫荧光染色病理变化图； 图8为Ad-Fc组SD大鼠肾脏CD31免疫荧光染色病理变化图； 图9为生理盐水组SD大鼠肾脏CD31免疫荧光染色病理变化图。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例详细说明本发明。 0022 主要试。
16、剂及材料： 清洁级SD大鼠 （成都达硕生物科技有限公司） 、 重组腺病毒载体 （Ad-sAxl） 由上海吉凯基因公司合成、 尿蛋白测定 （美国Sigma公司） 。 0023 主要仪器： BP-98A型智能无创血压-鼠仪 （北京软隆生物科技有限公司） 、 BL-420S 生物机能实验系统 （BL系列生物机能实验系统， 成都泰盟科技有限公司） 、 大鼠代谢笼 （四川 大学华西医院动物实验中心） 、 全自动血液细胞分析仪BC-3000 （深圳迈瑞生物医疗公司） 、 全自动生化分析仪BS-200 （深圳迈瑞生物医疗公司） 、 扫描电子显微镜 （日本Olympus公司） 。 0024 子痫前期大鼠模型的。
17、建立和鉴定： （1） 选取周龄8周的SD大鼠， 体重250-280g， 按雌雄合笼比例1:3， 确定妊娠后将雌鼠随 机分为3组， 每组6只雌鼠， 孕0天行体重测量， 孕前及孕1、 3、 5、 7天监测血压， 孕前及孕4天监 测24小时尿蛋白； （2） 在大鼠孕第8天经尾静脉分别注射2109 pfu的Ad-sAxl （实验组） 、 Ad-Fc （载体对 照组） 及生理盐水 （空白对照组） ； （3） 在孕9、 11、 13、 15、 17天用无创血压检测仪监测大鼠血压， 孕12、 16天监测24小时尿 蛋白； 孕19天测孕鼠有创血压、 称重， 并取孕鼠外周血行血常规、 生化指标测定； 孕19天行。
18、剖 宫产取出仔鼠计数并测顶臀长、 体重、 胎盘称重， 同时通过组织病理学观察机体主要脏器的 病理改变。 0025 结果分析： 1、 血压测定值变化 将如图1、 图2所示的血压测定值计算， *： P 0.05， Ad-sAxl组与Ad-Fc组比较；#： P 0.05 ， Ad-sAxl组与生理盐水组比较。 0026 2、 大鼠尿蛋白测定值变化 如图3所示并计算， *： P 0.05， Ad-sAxl组与Ad-Fc组比较；#： P 0.05， Ad-sAxl组与生 理盐水组比较。 说 明 书 3/4 页 5 CN 106310238 A 5 0027 3、 大鼠肾脏病理变化 在孕19天分别做大鼠肾。
19、脏HE染色及大鼠肾脏CD31免疫荧光染色， 40倍显微镜下观察。 如图4-6所示， Ad-sAxl组大鼠肾脏可见系膜区细胞数目增多， 肾小球轻微肿胀， Ad-Fc组和 生理盐水组大鼠肾脏未见明显异常。 如图7-9所示， Ad-sAxl组肾小球血管未见有明显的荧 光表达， Ad-Fc组和生理盐水组中箭头所示处肾小球血管有CD31荧光表达。 0028 4、 大鼠胎盘结果分析 孕19天行剖宫产取出的胎盘计数称重， Ad-sAxl实验组、 Ad-Fc载体对照组和生理盐水 组之间大鼠胎盘数目无明显差异 （P0.05） ， 而Ad-sAxl实验组大鼠的胎盘重量 （0.32 0.06g） 显著低于Ad-Fc。
20、阴性对照组 （0.520.08g） 和生理盐水组 （0.540.07 g） ， 差异有统 计学意义 （P均0.05） 。 0029 5、 将各组检测得到的孕19天行剖宫产取出仔鼠计数并测顶臀长、 体重、 仔鼠重量 并统计在下表1中； 表1 仔鼠个数、 重量及顶臀长比较 （n=6， SD） 经计算， *： P 0.05， Ad-sAxl组与Ad-Fc组比较； #： P 0.05， Ad-sAxl组与生理盐水组比较。 0030 6、 孕19天生化指标值、 血常规比较 将孕19天检测到的生化指标值、 血常规统计在下表2中； 表2 生化指标值、 血常规比较 （n=6， SD） 计算知： *： P 0.05， Ad-sAxl组与Ad-Fc组比较； #： P 0.05， Ad-sAxl组与生理盐水组比较。 0031 ALT： 谷丙转氨酶； AST： 谷草转氨酶； LDH： 乳酸脱氢酶； Cr： 肌酐； UA:尿素氮； HGB： 血 红蛋白浓度； PLT： 血小板数。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106310238 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 106310238 A 7 图3 图4图5图6 图7图8图9 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 106310238 A 8 。