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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510036580.4 (22)申请日 2015.01.23 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 9703 2014.09.22 (71)申请人 谱赛科美国公司 地址 美国伊利诺斯州 (72)发明人 奥维迪玛珂善 李善汪 卜宇成 (74)专利代理机构 北京金信知识产权代理有限 公司 11225 代理人 朱梅 徐琳 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) C07H 15/256(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (54)发明名。
2、称 甜叶菊新品种 817096 谱星 5 号及高 RD 含量甜菊糖苷的制备 (57)摘要 本发明提供了一种甜叶菊变种植物， 所述变 种植物为817096谱星5号， 其愈伤组织由中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保 藏， 保藏号为CGMCC No.9703。 本发明同时提供了 一种高RD含量的甜菊糖苷产品， 其中RD/TSG大于 0.28。 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 CN 105850709 A 2016.08.17 CN 105850709 A 1/1 页 2 1.一种甜叶菊变种植物， 其特征在于， 所述变种植物为817096谱星5号， 其愈伤组织由 中国微生物。
3、菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703， 其所 述 817096 谱星 5 号的植物及干叶中 RD/TSG 大于 0.28。 2.一种甜叶菊变种植物， 其特征在于， 所述变种植物通过以 AKH L1 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交 , 得到 F1 代， 并从所述 F1 代优选出性状优良且稳定的单株 YF002， 然后以 YF002 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F2 代， 其中所述 F2 代表达由权利要求 1 所 描述的 817096 谱星 5 号的所有生理和形态特征， 其 817096 谱星 5 号的愈。
4、伤组织由中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。 3.一种甜叶菊变种植物或其一部分， 其特征在于， 所述变种植物或其一部分表达由权 利要求 1 所描述的 817096 谱星 5 号所有的生理和形态特征， 其 817096 谱星 5 号的愈伤组 织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。 4.愈伤组织， 其特征在于， 所述愈伤组织产生由权利要求1、 2或3所描述的甜叶菊变种 植物或其一部分。 5.再生细胞， 其特征在于， 所述再生细胞来自由权利要求1、 2或3所描述的甜。
5、叶菊变种 植物。 6.再生细胞的组织培养， 其特征在于， 所述再生细胞根据权利要求 5 所描述。 7.产生甜叶菊变种植物的方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： 以 AKH L1 为父本， AKH/ G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F1 代， 并从所述 F1 代优选出性状优良且稳定的单株 YF002， 然 后以 YF002 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F2 代， 其中所述 F2 代表达由权利要 求 1 所描述的 817096 谱星 5 号的所有生理和形态特征， 其 817096 谱星 5 号的愈伤组织由 中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏。
6、， 保藏号为 CGMCC No.9703。 8.一种高 RD 含量甜菊糖苷的制备方法， 其特征在于 , 所述制备方法包括 ： 提供用于制 备高 RD 含量甜菊糖苷的原料， 其原料为由权利要求 1-3 所描述的甜叶菊植物或干叶， 其植 物及干叶中 RD/TSG 大于 0.28 ； 粉碎所述原料 ； 用水或水溶剂提取所述粉碎原料， 获得甜菊糖苷产品， 其中 RD/TSG 大于 0.28。 9.一种高RD含量的甜菊糖苷产品， 其特征在于， 该产品通过权利要求8的方法获得， 其 中 RD/TSG 大于 0.28。 10.一种高 RD 含量甜菊糖苷的制备方法， 其特征在于 , 所述制备方法包括 ： 提供。
7、用于 制备高 RD 含量甜菊糖苷的甜叶菊植物或干叶， 其植物及干叶中 RD/TSG 大于 0.28 ； 所述甜 叶菊植物或干叶通过愈伤组织再生或扦插由权利要求 1-3 所描述的甜叶菊植物而得到 ； 粉碎所述甜叶菊植物或干叶 ； 用水或水溶剂提取所述粉碎甜叶菊植物或干叶， 获得甜菊糖苷产品， 其中 RD/TSG 大于 0.28。 11.一种高RD含量的甜菊糖苷产品， 其特征在于， 该产品通过权利要求10的方法获得， 其中 RD/TSG 大于 0.28。 12.一种甜叶菊变种植物或其一部分 , 源自 817096 谱星 5 号的任何一代的后代， 其所 述 817096 谱星 5 号的愈伤组织由中国。
8、微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保 藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。 权 利 要 求 书 CN 105850709 A 2 1/9 页 3 甜叶菊新品种 817096 谱星 5 号及高 RD 含量甜菊糖苷的制 备 技术领域 0001 本发明涉及一种甜叶菊新品种， 所述甜叶菊品种含有高含量的 RD， 并可由保藏的 愈伤组织连续培育产生 ； 涉及从该品种的甜叶菊干叶制备高 RD 含量甜菊糖苷的方法。 背景技术 0002 甜叶菊(Stevia)， 学名为Stevia Rebaudiana Bertoni， 是一种多年生菊科草本植 物， 原产于南美巴拉圭， 其叶片中含有。
9、甜菊糖苷， 其甜度为蔗糖的150300倍， 是一种高甜 度、 低热能、 味质好、 安全无毒的新型天然甜味剂， 可广泛应用于食品、 饮料、 医药、 日化工业 等行业。 0003 甜菊糖苷是多组分糖苷混合物， 糖苷组分及含量决定混合物的甜度和口感。甜叶 菊中的甜菊糖苷含有13种组分， 即甜叶菊苷A(Rebaudioside A， 简称RebA或RA)， 甜叶菊苷 B(Rebaudioside B， 简称 RebB 或 RB)， 甜叶菊苷 C(Rebaudioside C， 简称 RebC 或 RC)， 甜叶 菊苷 D(Rebaudioside D， 简称 RebD 或 RD)， 甜叶菊苷 E(Re。
10、baudioside E， 简称 RebE 或 RE)， 甜叶菊苷 F(Rebaudioside F， 简称 RebF 或 RF)， 甜叶菊苷 M(Rebaudioside M， 简称 RebM 或 RM)， 甜叶菊苷N(Rebaudioside N， 简称RebN或RN)， 甜叶菊苷O(Rebaudioside O， 简称RebO 或 RO)， 甜苷 A(Dulcoside A， 简称 DulA 或 DA)， 甜茶苷 (Rubusoside， 简称 Rub 或 RU) ； 甜菊 双糖苷 (Steviolbioside， 简称 Sbio 或 SB)， 甜菊糖 (Stevioside， 简称 S。
11、tev 或 ST) ； 这十三 种甜菊糖苷的总和成为总甜菊糖苷 (Total Steviol glycosides， TSG) ； 其中 RD 相对含量 较少， 约占总甜菊糖苷的 0.15 -0.2。但是 RD 的甜度最高约为蔗糖的 450 倍 ； 而且 RD 味质最好， 接近于蔗糖的口感， 不含任何不良余味， 售价也是其他糖苷的35倍， 是一种最 为理想的天然甜味剂。因此， 制取 RD 含量高的甜菊糖苷产品具有广阔的市场前景。 0004 由于 RD 在甜叶菊中含量低， 过去， 获得高纯度 RD 的唯一方法是反复重结晶， 反复 重结晶的劣势在于产品得率低， 不利于成本控制 ； 另外由于在甜叶菊。
12、中含量低， 无法大规模 生产， 不能满足客户的需求。因此有必要开发一种高 RD 含量的甜叶菊新品种， 以便降低高 RD 含量甜菊糖苷产品生产成本并保持其稳定的得率。 发明内容 0005 本发明提供了一种甜叶菊变种植物。在一个实施例中， 变种植物为 817096 谱星 5 号， 其 817096 谱星 5 号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为CGMCC No.9703， 其所述817096谱星5号的植物及干叶中RD/TSG大于0.28。 在另一个实施例中， 变种植物通过以 AKH L1 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F1 。
13、代， 并从所述 F1 代优选出性状优良且稳定的单株 YF002， 然后以 YF002 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F2 代， 其中所述 F2 代表达由权利要求 1 所描述的 817096 谱星 5 号 的所有生理和形态特征， 其 817096 谱星 5 号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普 通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。在另一个实施例中， 变种植物或其 说 明 书 CN 105850709 A 3 2/9 页 4 一部分表达由权利要求 1 所描述的 817096 谱星 5 号所有的生理和形态特征， 其 817096 谱。
14、 星 5 号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。 0006 本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物或其一部分的愈伤组织， 甜叶菊变种植物 的再生细胞及其再生细胞的组织培养。 0007 本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物的方法。 在一个实施例中， 所述方法包括 ： 以 AKH L1 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F1 代， 并从所述 F1 代优选出性状优良 且稳定的单株 YF002， 然后以 YF002 为父本， AKH/G.8.D 为母本进行杂交， 得到 F2 代， 其中所 述 F2 代表达由权利。
15、要求 1 所描述的 817096 谱星 5 号的所有生理和形态特征， 其 817096 谱 星 5 号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。 0008 本发明同时提供了一种高 RD 含量甜菊糖苷的制备方法。在一个实施例中， 所述制 备方法包括 ： 提供用于制备高 RD 含量甜菊糖苷的原料， 其原料为由权利要求 1-3 所描述的 甜叶菊植物或干叶， 其植物及干叶中 RD/TSG 大于 0.28 ； 粉碎所述原料 ； 用水或水溶剂提取 所述粉碎原料， 获得甜菊糖苷产品， 其中 RD/TSG 大于 0.28。在另一个实施例中。
16、， 所述制备 方法包括 ： 提供用于制备高 RD 含量甜菊糖苷的甜叶菊植物或干叶， 其植物及干叶中 RD/TSG 大于 0.28 ； 所述甜叶菊植物或干叶通过愈伤组织再生或扦插由权利要求 1-3 所描述的甜叶 菊植物而得到 ； 粉碎所述甜叶菊植物或干叶 ； 用水或水溶剂提取所述粉碎甜叶菊植物或干 叶， 获得甜菊糖苷产品， 其中 RD/TSG 大于 0.28。 0009 本发明同时提供了一种高 RM 含量的甜菊糖苷产品， 其中 RD/TSG 大于 0.28。 0010 本发明同时提供了一种甜叶菊变种植物或其一部分 , 源自 817096 谱星 5 号的任 何一代的后代， 其所述817096谱星5。
17、号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生 物中心 (CGMCC) 保藏， 保藏号为 CGMCC No.9703。 0011 通过如下结合附图对优选实施例的详细描述， 本发明的目的和优点是显而易见 的。 附图说明 0012 本发明的优选实施方式现在将参考附图进行说明， 其中类似的附图标记表示相同 的元件。 0013 图 1、 杂交选育甜叶菊植物的示意图。 具体实施方式 0014 1、 高 RD 含量甜叶菊品种育种方法 0015 技术路线如图 1 所示。 0016 采用回交育苗方法， 选择AKH/G.8.D为母本， 先以AKH L1为父本进行一次杂交， 再 以优选单株 YF002 为父本进行。
18、一次回交， 采收种子， 育苗， 移栽大田种植。以单株选择育种 方式选择优良单株， 经过种植观察其农艺性状和分析检测糖苷含量， 性状稳定后， 再用组织 培养法和无性扦插繁殖方式固定其优良性状， 经示范性种植后， 成为新品种。 0017 A、 选育 YF002 说 明 书 CN 105850709 A 4 3/9 页 5 0018 通过杂交育种的方法进行选育。首先， 将母本 AKH/G.8.D 和父本 AKH L1 种植于同 一大棚中， 通过蜜蜂封闭式授粉的方法进行杂交， 收其亲本的种子进行播种、 育苗、 种植， 根 据农艺性状及色谱分析， 从 F1 代中选出性状优良且稳定的单株， 经无性扦插繁殖。
19、固定后的 新品系， 即 YF002 号单株。通过父本 AKH L1 与母本 AKH/G.8.D 杂交得到的 YF002， 相对于父 本其 RA 含量明显下降， 相对于母本其 St 含量也明显下降， 而 RD 的含量明显增加。 0019 B、 选育 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 0020 以 AKH/G.8.D 为母本， YF002 为父本， 同样通过蜜蜂封闭式授粉进行回交选育， 收 其亲本的种子进行播种、 育苗、 种植， 根据农艺性状及色谱分析， 从 F2 代中选出性状优良且 稳定的单株 817096， 经组织培养及无性扦插繁殖固定其优良性状， 获得高 RD 。
20、糖苷含量的无 性繁育新品种， 并命名为 ： 谱星5号， 英文名PCstar5。 通过父本YF002和母本AKH/G.8.D杂 交得到的 817096， 其 RD 含量有明显的增加。 0021 对杂交种进行检测确认的方法为薄层色谱分析和高效液相分析， 分析采自所述植 株 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 的干燥叶， 证实其中 RD/TSG 大于 0.28。然后对选 育出的优良品种 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 进行扩繁。扩繁主要采用两种方法 ： 愈伤组织培养和扦插， 其中又以愈伤组织培养为主。 0022 甜叶菊新品种 817096 。
21、谱星 5 号 (817096PC Star 5) 愈伤组织由中国微生物菌种 保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏， 保藏号为CGMCC No.9703。 本发明的所涉及的植 物可由 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 品种的保藏愈伤组织再生得到。 0023 2、 高 RD 含量甜菊糖苷产品的制备 0024 (a) 预处理 ： 将粉碎的 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 甜叶菊干叶于热水 中萃取， 制成甜菊糖苷萃取液， 萃取液经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序后， 进入下一道工 序 ； 0025 (b) 一次吸附及解吸 ： 采用树脂吸附。
22、上述萃取液中甜菊糖苷有效成分， 到树脂出 甜时止 ； 用氢氧化钠稀溶液、 盐酸稀溶液、 纯水洗树脂、 至流出液 pH 值达到 7 时止 ； 用乙醇 溶液对树脂进行分柱解吸， 得含 RD 为 22 25、 含糖苷量为 78 86的解吸液， 解吸液 进入下一道工序 ； 0026 (c) 一次离子交换 ： 解析液依次通过一次离子交换除杂后， 蒸发浓缩， 得含 RD 为 23 26、 含苷量在 82 88的浓缩液， 浓缩液进入下一道工序 ； 0027 (d) 二次离子交换 ： 将流出液再通过二次离子交换树脂进行深度除杂， 浓缩得到 含 RD 为 24 26、 含苷量 85 88的浓缩液， 再除菌过滤，。
23、 浓缩液进入下一道工序 ； 0028 (e) 喷雾干燥 ： 将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥， 得到 RD/TSG 大于 0.28、 TSG 85的甜菊糖苷产品。 0029 如需要制备更高纯度的产品， 则在步骤 (C) 后按以下步骤进行 ： 0030 (d) 二次吸附提纯 ： 用二次吸附树脂三柱串联过饱和吸附上述浓缩液除杂， 得到 含苷量 95的甜菊糖苷提纯液， 提纯液进入下一道工序 ； 0031 (e) 二次离子交换 ： 将提纯液通过二次离子交换树脂进行深度除杂， 浓缩得到含 苷量 95的浓缩液， 再经过除菌滤膜除菌过滤， 浓缩液进入下一道工序 ； 0032 (f) 喷雾干燥 ： 将除菌过滤后的。
24、浓缩液喷雾干燥， 得到 RD/TSG 大于 0.28、 TSG 95的甜菊糖苷产品。 说 明 书 CN 105850709 A 5 4/9 页 6 0033 下面结合实施例对本发明做做进一步详细描述。 0034 实施例 1 0035 用于杂交育种的父母本性状 ： 0036 母本一 AKH/G.8.D ： 2010 年从巴拉圭引进的高 Stev 含量甜菊新品种。株高 50 55cm， 叶子成椭圆状， 叶子边缘无明显锯齿， 颜色为深绿色。干叶中 RebA 含量为 0.00， St 含量为 18.00。 0037 父本一 AKH L1 ： 2010 年从巴拉圭引进的高 Reb A 含量甜菊新品种。该。
25、品种为晚 熟品种， 株高 51 70cm， 大田种植前期生长慢， 中后期生长旺盛， 一茬大田生长期为 135 150 天。叶子颜色为淡绿色 / 黄绿色。干叶中 Reb A 含量为 11.5， St 含量为 1.30 , 亩 产干叶 200 公斤以上。 0038 母本二 AKH/G.8.D ： 2010 年从巴拉圭引进的高 Stev 含量 ( 以下简称 St) 甜菊新品 种。株高 50 55cm， 叶子成椭圆状， 叶子边缘无明显锯齿， 颜色为深绿色。干叶中 RebA 含 量为 0.00， St 含量为 18.00。 0039 父本二 YF002 ： 第一次杂交后代中性状优良且稳定的优良单株， 经。
26、无性扦插繁殖 固定后的新品系。其 RA 含量低， 且 RD 含量高， 分枝能力一般， 叶片大且厚实， 干叶产量高。 0040 杂交育种过程 ： 0041 2011 年 8 月中旬开始， 将所选 St 含量高的 AKH/G.8.D( 母本 ) 和 RebA 糖苷含量高 的AKH L1(父本)移入育种大棚内， 进行杂交育种， 10月初， 亲本现蕾之前放入蜂箱， 利用蜜 蜂进行封闭式授粉杂交 ； 11 月中旬开始采收杂交种子， 一直采收至 12 月中旬。2012 年初将 所得种子播种于育苗大棚内， 待其长到 3 叶 1 心 ( 约 10 厘米 ) 时， 将种苗移植至 6*8cm 的 育苗袋中， 并放。
27、于大棚内培养， 3 月初浇施一次可溶性复合肥 500 倍液及尿素 1000 倍液， 3 月中旬气温回暖后， 将种苗移栽至试验田， 并对其进行田间管理等措施。 0042 2012年7月份采收植株鲜叶， 并进行干燥， 采用TLC及高效液相色谱法分析干叶糖 苷含量， 选择 RA 糖苷含量低且 RD 糖苷含量高的单株， 即 YF002。 0043 YF002 及其亲本以及亲本含苷量检测结果见表 1 ： 0044 表 1 ： YF002 及其亲本检测结果 0045 0046 说 明 书 CN 105850709 A 6 5/9 页 7 0047 NDNot Detected( 未检出 )。 0048 然。
28、后在 2012 年 8 月中旬移入大棚内进行杂交育种。2013 年 1 月初将所得种子播 种在谱赛科公司塑料大棚内进行育种， 种子萌发后， 秧苗长至 3 叶 1 心时， 移植至 68cm 的 育苗袋中， 并放于大棚内培养， 3 月初浇施一次可溶性复合肥 500 倍液及尿素 1000 倍液， 3 月中旬气温回暖后， 将种苗移栽至试验田， 并对其进行田间管理等措施。 0049 2013 年 7 月份采收植株鲜叶， 并进行干燥， 采用薄层色谱及高效液相色谱法分析 干叶糖苷含量， 选育出所含RD占总甜菊糖苷量比例超过28， 所含RA占总甜菊糖苷量比例 超过 20的单株， 即 817096 谱星 5 号。
29、 (817096PC Star 5)。 0050 817096 谱星 5 号及其亲本含苷量检测结果见表 2 ： 0051 表 2 ： 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 及其亲本含苷量检测结果 0052 0053 ND 未检出。 0054 新品系 817096 谱星 5 号 (817096PC Star 5) 的扩繁及栽培管理 ： 0055 2013 年 10 月至 2014 年 2 月， 采用组织培养法将 817096 单株扩繁到 50000 株。 2014 年 2 月下旬将组培苗移植至育苗穴盘中进行炼苗 ； 2014 年 3 月中下旬， 将练好的种苗 移栽到大田。
30、， 并进行相应的田间管理。2014 年 4 月初 ( 移栽后 10 天左右 ) 进行查苗补缺工 作， 2014 年 4 月中下旬 ( 苗高 15cm 左右 ) 开始进行打顶摘心， 2014 年 4 月中下旬开始进行 第一次追肥， 追施的肥料为可溶性复合肥和尿素， 用量为可溶性复合肥 500 倍液， 尿素 1000 倍液， 2014 年 5 月份开始进行第二次追肥管理， 追施的肥料为可溶性复合肥和尿素， 用量为 可溶性复合肥 500 倍液， 尿素 1000 倍液， 后期 (6 月份 ) 补施磷酸二氢钾叶面肥。2014 年 7 月初开始进行收获， 收割采用人工采收， 打谷机脱叶方式， 然后进行晒干。
31、， 并装袋保存。 0056 分析采自所述植株的干燥叶， 通过高效液相色谱测定其成分。 0057 817096PC Star 5与相似品种(PC Star)中甜菊糖苷含量、 各组分占总甜菊糖苷比 说 明 书 CN 105850709 A 7 6/9 页 8 例以及性状的比较见表 3、 表 4 以及表 5。 0058 表3 ： 817096PC Star 5与相似品种(PC Star)中甜菊糖苷含量比较(wt/wt,干 基 ) 0059 0060 ND 未检出。 0061 表 4 ： 817096PC Star 5 与相似品种 (PC Star) 中各组分占总甜菊糖苷比例比较 ( ) 0062 0。
32、063 0064 ND 未检出。 0065 表 5 ： 817096PC Star 5 与相似品种 (PC Star) 性状比较 0066 0067 实施例 2 0068 高 RD 含量甜菊糖苷产品的制备 说 明 书 CN 105850709 A 8 7/9 页 9 0069 (a)预处理 ： 将甜叶菊叶子与50软水按重量比1:15混合， 制成甜菊糖苷提取液， 经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序， 板框过滤后的滤液进入下一道工序 ； 0070 (b) 一次吸附及解吸 ： 用一次吸附树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分， 用 氢氧化钠溶液、 盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂， 纯水淋洗树脂，。
33、 至流出液 PH 值达 7 时止， 再用乙醇溶液进行解吸， 得到含 RD 为 22.69、 含苷量 79.5的解吸液， 解吸 液去醇进入下一道工序 ； 0071 (c) 一次离子交换 ： 去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂， 蒸发浓缩得到含 RD 为 24.24、 含苷量为 84.91的一次浓缩液， 浓缩液进入下一道工序 ； 0072 (d) 二次离子交换 ： 将浓缩液通过二次离子交换树脂进行深度除杂， 经过浓缩得 到含苷量为 85.12的二次离子交换液， 再进行除菌滤芯除菌过滤， 无菌液进入下一道工 序 ； 0073 (e) 喷雾干燥 ： 将无菌液进行喷雾干燥， 得到甜菊糖苷产品， 其中 R。
34、D/TSG 为 0.2855、 TSG 为 85.12。经高效液相色谱分析测定其成分 ： 0074 表 6 ： 产品高效液相检测结果 0075 0076 ND 未检出。 0077 实施例 3 0078 (a)预处理 ： 将甜叶菊叶子与70软水按重量比1:20混合， 制成甜菊糖苷提取液， 经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序， 板框过滤后的滤液进入下一道工序 ； 0079 (b) 一次吸附及解吸 ： 用一次吸附树脂吸附上述脱盐滤液中甜菊糖苷有效成分， 用氢氧化钠溶液、 盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂， 再用乙醇溶液进行解吸， 得到含 RD 为 23.41、 含苷量 82.0的解吸液， 解吸液。
35、去醇进入下一道工序 ； 0080 (c) 一次离子交换 ： 去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂， 蒸发浓缩得到 RD 为 25.02、 含苷量为 87.65的一次浓缩液， 浓缩液进入下一道工序 ； 0081 (d) 二次吸附提纯 ： 用二次大孔吸附树脂三柱串联吸附上述离子交换液除杂， 得 到 RD 为 27.11、 含苷量为 94.97甜菊糖苷提纯液， 提纯液进入下一道工序 ； 0082 (e) 二次离子交换 ： 通过二次离子交换树脂进行深度除杂， 经过浓缩得到 RD 为 27.14、 含苷量为 95.06的二次离子交换液， 再进行除菌滤芯除菌过滤， 无菌液进入下一 道工序 ； 0083 (f。
36、) 喷雾干燥 ： 将无菌液进行喷雾干燥， 得到甜菊糖苷产品。经高效液相色谱分 析， 产品 RD 含量为 27.14， TSG 为 95.56 ,RD/TSG 为 0.2840。 0084 表 7 ： 产品高效液相检测结果 0085 说 明 书 CN 105850709 A 9 8/9 页 10 0086 ND 未检出。 0087 本发明中所有样品， 在下列条件下， 通过高效液相色谱测定其成分。 0088 高效液相色谱检测 ： 0089 一种新的高效液相色谱方法检测甜菊糖苷。每个样品需用 2 种方法综合检测。 0090 方法 1 是用于分析 RebE、 RebD、 RebM、 RebN、 Reb。
37、O ； 方法 2 是用于分析 RebA、 Stev、 RebF、 RebC、 DulA、 Rub、 RebB、 Sbio。 0091 所有糖苷的标准品 , 包括 RebE、 RebD、 RebM、 RebN、 RebO 均购于美国 ChromaDex 公 司。 0092 检测仪器 ： 配备二元泵、 自动进样器的安捷伦 1200 高效液相色谱仪， DAD 检测器配 合化学工作站软件使用。 0093 方法 1 仪器条件 ： 0094 色谱柱 ： 安捷伦 Poroshell 120SB-C182.7m,4.6x 150mm 0095 柱温 ： 40 0096 流动相 A ： 10mM 磷酸二氢钠 p。
38、H2.6: 乙腈， 75 :25 (v/v) 0097 流动相 B ： 水 ： 乙腈， 50 :50 (v/v) 0098 流量 ： 0.5mL/min 0099 进样量 ： 5L 0100 检测 ： UV 210nm 0101 运行时间 ： 25 分钟 0102 过度时间 ： 10 分钟 0103 进样器温度 ： 常温 0104 梯度程序， (， v/v:) 0105 时间 (min) A( ) B( ) 0.01000 14.01000 14.50100 25.00100 0106 方法 2 仪器条件 ： 0107 色谱柱 ： 安捷伦 Poroshell 120SB-C182.7m,4.6x 150mm 说 明 书 CN 105850709 A 10 9/9 页 11 0108 柱温 ： 40 0109 流动相 ： 10mM 磷酸二氢钠 pH2.6: 乙腈， 68 :32 (v/v) 0110 流量 ： 1.0mL/min 0111 进样量 ： 5L 0112 检测 ： UV 210nm 0113 运行时间 ： 20 分钟 0114 进样器温度 ： 常温 说 明 书 CN 105850709 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 105850709 A 12 。