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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610886793.0 (22)申请日 2016.10.12 (71)申请人 中国医学科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路151 号 (72)发明人 王向涛 张明珠 韩美华 郭一飞 (51)Int.Cl. A61K 9/10(2006.01) A61K 31/56(2006.01) A61K 9/19(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K。
2、 47/22(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种雷公藤红素纳米混悬剂及其制备方法 (57)摘要 本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种用 mPEG-PCL、 mPEG-DSPE、 苄泽78、 SPC、 Tween80、 BSA、 TPGS等两亲性稳定剂制备的雷公藤红素纳 米混悬剂制备方法及其应用。 所述的雷公藤红素 纳米混悬剂采用溶剂沉淀-超声注入法制备， 其 处方组成： 雷公藤红素与稳定剂的组合比例为1 0.11(重量比)； 载药量最高达85， 粒径最小 可达67.1nm， 多分散性良好； 在胃肠液中及血浆。
3、 中均稳定， 即可口服给药， 也可以静脉注射； 体外 具有良好的缓释效果， 无突释； 该纳米混悬剂相 比于原药溶液在体外对肿瘤细胞抑制率显著； 体 内药效实验同时表现出了卓越的抗肿瘤药效， 具 有广阔的应用开发前景。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 106309364 A 2017.01.11 CN 106309364 A 1.一种雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于： 所述的纳米混悬剂由雷公藤红素单体和 稳定剂组成， 药物与稳定剂的质量比为1 0.11。 2.根据权利要求1所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于： 所述的稳定剂为mPEG- PCL、 mPEG-DSPE、 苄泽78。
4、、 SPC、 Tween80、 BSA、 TPGS等两亲性稳定剂， 其中mPEG-PCL、 mPEG- DSPE、 中PEG嵌段的分子量的范围为500-5000， 优选分子量500-2000； mPEG-PCL中PCL嵌段的 分子量范围为500-5000， 优选分子量500-2000， 所述的稳定剂可为一种或两种或多种稳定 剂的组合物。 3.如权利要求1至2所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于载药量最高可达85， 粒径10-1000nm， 优选平均粒径在40-150nm。 4.如权利要求1至3所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于纳米混悬剂在5葡萄 糖溶液， 0.9生理盐水以及PBS中均。
5、能保持稳定， 既不发生聚沉现象， 粒径也无较大变化； 纳米混悬剂在人工胃肠液及鼠血浆中均能保持较好的稳定性且不发生聚沉现象， 既适合静 脉注射给药， 也适合口服给药。 5.如权利要求1至4所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于其中的药物具有良好的 缓释作用， 没有突释。 6.根据权利要求1至5所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于： 采用搅拌注入、 超声 注入法： 制备方法包括以下步骤： (1)雷公藤红素药物和稳定剂溶于能与水混溶的有机溶剂中； (2)超声或搅拌条件下将含有药物和稳定剂的有机溶剂注入到水中； (3)减压旋转蒸发或透析法除去有机溶剂。 7.根据权利要求6所述的雷公藤红素纳米混。
6、悬剂的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)和 步骤(2)所述的有机溶剂选自DMSO、 DMF、 甲醇、 乙醇、 乙腈、 异丙醇、 PEG400中的一种或两种 或多种的混合体系， 只要混合体系能和水混溶同时能很好的溶解药物和辅料即可； 药物在 有机溶剂中的浓度为2mg/ml40mg/ml(w/v)， 稳定剂的浓度为5mg/ml30mg/ml(w/v)； 步 骤(2)中有机溶剂与水相的体积比为1 10100(v/v)； 步骤(2)中的超声条件为250HZ， 超声 温度为12-60， 超声时间为1-30min； 步骤(2)中的搅拌的条件为1001000rpm， 搅拌温 度为12-60， 搅拌时间16。
7、0min。 8.根据权利要求6至7所述的雷公藤红素纳米混悬剂的制备方法， 其特征在于： 步骤(3) 还可以通过冷冻干燥进一步固化， 所用冻干保护剂可以是泊洛沙姆、 BSA、 HP- -CD、 甘露醇、 乳糖中的一种或两种及两种以上的组合， 优选BSA为冻干保护剂； 冻干保护剂的用量为 0.1-20(g/100mL)， 优选的冻干保护剂用量为0.5-5(g/100mL)。 9.根据权利要求1至8所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 可用于制备注射剂， 所述的注射 剂包括注射液和无菌粉针； 水相分散介质可用高浓度的氯化钠或葡萄糖水溶液调成0.9 氯化钠或者5葡萄糖生理等渗体系， 适应静脉给药应用； 本发明。
8、的雷公藤红素纳米粒冻干 粉可加入适量的无菌药用0.9氯化钠或者5葡萄糖水溶液稀释， 重建成供静脉给药用的 均匀分散体系， 适合运输处藏。 10.如权利要求1至9所述的雷公藤红素纳米混悬剂， 其特征在于体外细胞毒实验表明， 表现出较雷公藤红素溶液(5吐温80的生理盐水)有更高的肿瘤细胞抑制率； 药效试验给 药后， 体重均呈上升趋势， 说明药物对小鼠没有明显的毒副作用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106309364 A 2 一种雷公藤红素纳米混悬剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及药物制剂领域， 具体涉及一种用mPEG-PCL、 mPEG-DSPE、 苄泽78、 SPC、。
9、 Tween80、 BSA、 TPGS等两亲性稳定剂制备的雷公藤红素纳米混悬剂， 及其制备方法及应用。 背景技术 0002 雷公藤红素(Celastrol简称CSL)来源于卫矛科植物雷公藤的根、 叶和花， 为雷公 藤的三萜单体成分， 研究发现CSL对多种免疫系统疾病有显著疗效， 近几年研究发现其抗肿 瘤作用也较为显著， 研究发现其对大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12、 细胞大鼠神经 胶质瘤C6细胞株、 鼻咽癌细胞株CNE-1、 SHG-44胶质瘤细胞株、 宫颈癌HeLa细胞、 人前列腺癌 细胞PC-3、 白血病细胞U937、 人肺癌细胞(H727、 H1299、 A549)、 人乳腺癌细胞。
10、株MCF-7等具有 显著疗效。 0003 CSL难溶于水， 导致体内研究中的给药方式受到极大限制。 已有的体内研究多采用 悬浮灌胃， 或者腹腔给药， 但均由于生物利用度较低导致难以最大程度的发挥疗效。 并且 CSL的毒副作用较大， 对生殖、 内分泌和消化系统有一定毒性。 0004 药物通过不同的方法制备而成的纳米大小的颗粒就是纳米粒， 其中包括胶束、 纳 米晶、 聚合物纳米粒、 纳米混悬剂等。 将难溶性药物制备成为纳米粒已成为解决难溶性药物 的给药问题的主要方法之一。 同时， 药物多包封在纳米粒内部， 进入体内之后有溶出的过 程， 可以达到缓慢释放的效果， 从而在一定程度上改善药物的不稳定性，。
11、 延缓代谢。 当纳米 粒的粒径较小时(如300nm以内)， 还会由于EPR(enhanced permeation and retention)效 应对肿瘤细胞产生归巢效应， 达到被动靶向肿瘤的效果。 因此， 难溶性药物， 尤其是抗肿瘤 药物的临床应用可以通过纳米给药系统来解决。 0005 纳米混悬剂是纳米给药系统的重要分支， 运用合适的制备方法， 将两亲性的稳定 剂与药物直接制备成纳米大小的微粒， 是纳米粒的一种。 与使用了大量辅料的其他纳米给 药系统相比， 纳米混悬剂具有较多优点： (1)理论上， 纳米混悬剂是近乎纯药物， 具有最大限 度的载药量， 特别适合大剂量难溶性药物的口服和注射给药。
12、； (2)适用范围广， 无论是难溶 于水的药物， 还是水、 油都难溶的药物， 都可利用一定的方法制得相应的纳米混悬剂， 且可 通过相应技术实现工业化大生产。 纳米混悬剂处方组成简单、 工艺简单、 制备快速， 干燥后 所得粉末作为中间体进一步制备成口服、 注射、 外用等不同的剂型， 方便携带， 提高病人顺 应性。 发明内容 0006 本发明的目的之一在于提供一种制备方法简便、 载药量高、 稳定性高， 能实现雷公 藤红素的体内外缓释、 增强抗癌疗效的纳米混悬剂。 0007 一种雷公藤红素纳米混悬剂， 由雷公藤红素和稳定剂组成， 药物与稳定剂的质量 比为1 0.11。 0008 一种雷公藤红素纳米混。
13、悬剂， 选用的稳定剂为mPEG-PCL、 mPEG-DSPE、 苄泽78、 SPC、 说 明 书 1/6 页 3 CN 106309364 A 3 Tween80、 BSA、 TPGS等两亲性稳定剂中的一种或多种联合运用。 0009 本发明目的之二在于提供一种雷公藤红素纳米混悬剂的制备方法， 本发明采用的 是溶剂沉淀-超声或搅拌注入的方法制备纳米混悬剂， 技术方案如下： 0010 (1)雷公藤红素和稳定剂溶于能与水混溶的有机溶剂中； 0011 (2)超声或搅拌条件下将含有药物和稳定剂的有机溶剂注入到水中； 0012 (3)减压旋转蒸发或透析法除去有机溶剂； 0013 上述制备方法， 其特征在于。
14、： 步骤(1)所述的稳定剂为mPEG-PCL、 mPEG-DSPE、 苄泽 78、 SPC、 Tween80、 BSA、 TPGS等两亲性稳定剂。 其中mPEG-PCL、 mPEG-DSPE、 中PEG嵌段的分子 量的范围为500-5000， 优选分子量500-2000。 mPEG-PCL中PCL嵌段的分子量范围为500- 5000， 优选分子量500-2000。 0014 上述制备方法， 其特征在于步骤(1)所述的有机溶剂选自DMSO、 DMF、 甲醇、 乙醇、 乙 腈、 异丙醇、 PEG400中的一种或两种或多种的混合体系， 只要混合体系能和水混溶同时能很 好的溶解药物和辅料即可。 药物在。
15、有机溶剂中的浓度为2mg/ml40mg/ml(w/v)， 稳定剂的 浓度为5mg/ml30mg/ml(w/v)； 步骤(2)中有机溶剂与水相的体积比为1 10100(v/v)。 步 骤(2)中的超声条件为250HZ， 超声温度为12-60， 超声时间为1-30min。 步骤(2)中的搅 拌的条件为1001000rpm， 搅拌温度为12-60， 搅拌时间160min。 0015 步骤(3)还可以通过冷冻干燥进一步固化， 所用冻干保护剂可以是泊洛沙姆、 BSA、 HP- -CD、 甘露醇、 乳糖中的一种或两种及两种以上的组合， 优选BSA为冻干保护剂； 冻干保 护剂的用量为0.1-20(g/100。
16、mL)， 优选的冻干保护剂用量为0.5-5(g/100mL)。 0016 本发明的目的之三在于提供一种雷公藤红素纳米混悬剂在制备注射剂中的应用， 所述的注射剂包括注射液和无菌粉针。 水相分散介质可用高浓度的氯化钠或葡萄糖水溶液 调成0.9氯化钠或者5葡萄糖生理等渗体系， 适应静脉给药应用。 本发明的雷公藤红素 纳米粒冻干粉可加入适量的无菌药用0.9氯化钠或者5葡萄糖水溶液稀释， 重建成供静 脉给药用的均匀分散体系， 适合运输处藏。 0017 本发明的纳米混悬剂的优点在于： (1)处方简单， 最少可以只含有药物和稳定剂； (2)载药量可高达85， 同时平均粒径可小于100nm， 具有非常高的药物。
17、传输效率， 同时易实 现对肿瘤的被动靶向； (3)体外释放没有突释， 缓慢释放72h以上； (4)在人工胃肠液和血浆 中稳定， 既可以口服给药， 也可以静脉注射； (5)载药量可根据需要再很宽的范围内(10- 85)调整， 在低载药量时纳米混悬剂以胶束的形式存在。 0018 本发明的雷公藤红素纳米混悬剂经体外细胞毒实验表明， 表现出较雷公藤红素溶 液(5吐温80的生理盐水)有更高的肿瘤细胞抑制率。 0019 本发明的雷公藤红素纳米混悬剂经荷瘤小鼠药效实验证明， 其特征在于给药后， 体重均呈上升趋势， 说明药物对小鼠没有明显的毒副作用。 0020 本发明的纳米混悬剂工艺简单， 辅料经济安全易得，。
18、 有广阔的产业化前景。 附图说明 0021 图1为实施例1中CSL纳米混悬剂的平均粒径分布图 0022 图2为实施例1中透射电镜照片 0023 图3为实施例1中CSL纳米混悬剂在人工胃肠液、 血浆中的稳定性考察(n3) 说 明 书 2/6 页 4 CN 106309364 A 4 0024 图4为实施例1中CSL纳米混悬剂在0.5吐温的PBS中的体外释放曲线(n3) 0025 图5为实施例1中CSL纳米混悬剂对C6细胞毒考察(n6) 0026 图6为实施例1中CSL纳米混悬剂对HepG 2细胞毒考察(n6) 0027 图7为实施例1中H22荷瘤小鼠体重随时间变化曲线(n10) 0028 图8为。
19、实施例1中H22荷瘤小鼠肿瘤体积随时间变化曲线(n10) 具体实施方式 0029 下面将描述本发明的几个实施例， 但本发明的内容完全不局限于此。 0030 实施例1 0031 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mgPEG2000-PCL2000共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件 下250HZ超声缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米 混悬剂。 平均粒径为67.1nm(图1)， 多分散性指数(PDI)为0.232， 电位值-10.4mV。 0032 实施例2 0033 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mgPEG2000-PCL1140共同溶解于。
20、0.2mL甲醇中， 室温条件 下250HZ超声缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米 混悬剂。 平均粒径为74.2nm， 多分散性指数(PDI)为0.201， 电位值-12.6mV。 0034 实施例3 0035 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mgPEG5000-PCL2000共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件 下250HZ超声缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米 混悬剂。 平均粒径为76.4nm， 多分散性指数(PDI)为0.192， 电位值-13.8mV。 0036 实施例4 0037 将。
21、5mg雷公藤红素(CSL)、 5mgSPC共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件下250HZ超声 缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米混悬剂。 平均 粒径为175.7nm， 多分散性指数(PDI)为0.118， 电位值-22.1mV。 0038 实施例5 0039 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mgTPGs共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件下250HZ超声 缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米混悬剂。 平均 粒径为107.4nm， 多分散性指数(PDI)为0.143， 电位值-22.3mV。。
22、 0040 实施例6 0041 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mg mPEG2000-DSPE共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件 下250HZ超声缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米 混悬剂。 平均粒径为130.3nm， 多分散性指数(PDI)为0.176， 电位值-30.8mV。 0042 实施例7 0043 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mg苄泽78共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件下250HZ超 声缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米混悬剂。 平 均粒径为113.4nm， 多分。
23、散性指数(PDI)为0.153， 电位值-20.6mV。 0044 实施例8 0045 将5mg雷公藤红素(CSL)、 5mg吐温80共同溶解于0.2mL甲醇中， 室温条件下250HZ超 声缓慢滴注于5mL去离子水中， 继续超声3min， 旋转蒸发除去甲醇， 即得CSL纳米混悬剂。 平 说 明 书 3/6 页 5 CN 106309364 A 5 均粒径为144.1nm， 多分散性指数(PDI)为0.193， 电位值-18.7mV。 0046 实施例9 0047 制备6mg/mL浓度的实例1中CSL混悬剂， 吸取6 L滴到300目的铜网上， 空气中自然 晾干， 后用0.1醋酸铀染色10min，。
24、 透射电镜下观察粒子的形态(图2)。 0048 实施例10 0049 实例1中CSL纳米混悬剂在0.9NaCl、 5Glu、 PBS中的稳定性考察 0050 配置1.8NaCl、 10Glu的溶液， 随后将此溶液和PBS分别与实例一中的CSL纳米 混悬剂(1mg/mL)1 1等体积混合， 37孵育并在特定的时间点测其粒径的变化。 0051 结果： CSL纳米混悬剂在0.9NaCl、 5Glu、 PBS基本稳定， 孵育24h之内未发现明 显沉淀或粒径增大的现象(下表所示)。 0052 实施例11 0053 CSL纳米混悬剂在人工胃肠液、 血浆中的稳定性考察 0054 人工胃液的配置： 取浓度为1。
25、mol/L的稀盐酸16.4mL， 加800mL蒸馏水， 10g胃蛋白 酶， 混匀， 加水稀释至1000mL。 0055 人工肠液的配置： 6.8g磷酸二氢钾， 加水500mL， 用0.1mol/L氢氧化钠调pH6.8， 另 取胰蛋白酶10g， 加水溶解， 两液混合后加水稀释至1000mL。 0056 取0.5mL过膜后的配置好的人工胃肠液和大鼠血浆， 与实例1中的CSL纳米混悬剂 混合后(4 1， v/v)， 37孵育， 并在特定时间点测其粒径的变化。 0057 结果： 在人工胃肠液中， CSL纳米混悬剂在12h之内粒径变化几乎不大， 在血浆中 24h之内并未发现沉淀(图3)， 说明CSL纳米。
26、混悬剂在人工胃肠液中基本稳定， 能够口服给 药， 在血浆中也较为稳定。 0058 实施例12 0059 CSL纳米混悬剂的溶血考察 0060 小鼠摘眼球取血后， 于5000rpm离心5min， 弃上清。 随后用0.9的NaCl吹打洗涤几 遍， 直至上清无明显红色。 随后血细胞用0.9NaCl的溶液稀释至红细胞含量为4(v/v)。 取此悬浮液0.5mL与0.5mL的不同浓度的已调等渗的纳米混悬剂混合， 37孵育4h后， 5000rpm离心5min， 取上清于酶标仪在540nm处测吸光值。 同时将4的红细胞悬浮液与 0.9的NaCl混合作为阴性对照， 4的红细胞悬浮液与去离子水混合作为阳性对照。 。
27、0061 溶血率()(OD样 品-A阴 性 对 照)/(A阳 性 对 照-A阴 性 对 照)100 0062 结果： CSL纳米混悬剂的溶血率很低(如下表)， 体内静脉给药时所需的浓度完全不 溶血， 满足静脉注射的条件。 说 明 书 4/6 页 6 CN 106309364 A 6 0063 实施例13 0064 CSL纳米混悬剂的体外释放实验 0065 方案： 取制备好的实例1中的CSL纳米混悬剂4mL(1mg/mL， 平行三份)， 于截留分子 量在8000-14000的透析袋(MWCO20000， Spectra/Por， USA)中， 分别置于50ml含0.5吐温 80的PBS中， 37。
28、下100rpm搅拌， 定时吸取1ml释放液， 同时加入等体积的新鲜释放介质， 取 出的释放外液13000rpm离心20分钟后， HPLC测定CSL的含量， 计算累积释放率。 0066 结果： CSL纳米混悬剂能够缓慢释放(图4)， 整个过程无明显突释。 0067 实施例14 0068 CSL纳米混悬剂对C6、 HepG 2的体外细胞毒考察 0069 方案： 用含10胎牛血清的1640培养液将C6、 HepG 2细胞配成单细胞悬液， 以每孔 1.0104个细胞左右接种到96孔板。 5CO2、 37细胞培养24h后， 吸去培养液， 用不含胎牛 血清的培养基稀释CSL纳米混悬剂至不同浓度梯度， 加入。
29、150uL继续培养(同时以不含胎牛 血清的培养基作为空白对照)， 每个浓度6个复孔。 孵育24h后， 吸去样品溶液， 每孔加MTT溶 液(5mgmL-1， PBS配制)20 L； 继续孵育4h后， 终止孵育， 吸去孔内液体， 每孔加200 L DMSO， 振荡20min， 使蓝紫色结晶物充分溶解。 选择570nm波长， 在酶联免疫荧光仪检测OD值。 0070 细胞抑制率()(空白对照组OD-实验组OD)/空白对照组OD100。 0071 结果： 结果显示， 和雷公藤红素DMSO溶液相比， 纳米混悬剂对C6、 HepG 2均具有更 强的抑制作用(图6、 图7)。 孵育24h后， CSL溶液和纳米。
30、混悬剂的IC50值如下表(n6， mean SD， *p0.01vs.CSL solution)： 0072 实施例15 0073 CSL纳米混悬剂在H22荷瘤小鼠的抗肿瘤药效研究 0074 给药方案： 将筛选出来的荷瘤小鼠随机分为3组， 每组10只， 除正常饮食外， 尾静脉 注射CSL纳米混悬剂4mg/kg、 CSL溶液(5吐温80的生理盐水)， 生理盐水为阴性对照组。 隔 天给药， 共给药5次。 0075 考察指标： 隔天给药时用电子秤称量小鼠体重； 用游标卡尺测量肿瘤体积。 实验结 束后， 脱颈椎处死小鼠， 完整剥离腋下肿瘤组织称重， 计算抑瘤率。 0076 抑瘤率()(1一治疗组平均瘤。
31、重/生理盐水组平均瘤重)100。 0077 结果： CSL纳米混悬剂给药组、 CSL溶液， 生理盐水组的体重均产生了上升的趋势 (图7)， 瘤体积变化也呈一定的上升趋势(图8)， 说明雷公藤红素纳米混悬剂以及CSL溶液在 给药剂量下没有明显的毒副作用。 但CSL纳米混悬剂静脉注射时表现出卓越的抗肿瘤治疗， 4mg/kg尾静脉给药的肿瘤抑制率达到70.36， 说明4mg/kg的给药剂量是接受的， CSL纳米 混悬剂及CSL溶液对H22荷瘤小鼠的抑瘤率如下表(n10， meanSD)： 说 明 书 5/6 页 7 CN 106309364 A 7 Notes： #p0.01vs Negative control， and&p0.05vs CSL nanosuspension 4mg/ kg。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106309364 A 8 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 106309364 A 9 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 106309364 A 10 图7 图8 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 106309364 A 11 。