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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610634205.4 (22)申请日 2016.08.04 (71)申请人 大连大学 地址 116622 辽宁省大连市经济技术开发 区学府大街10号 (72)发明人 袁小林 杨真 张青 袁儒非 崔益芬 孙秀艳 李纯 关庆琳 (74)专利代理机构 大连智高专利事务所(特殊 普通合伙) 21235 代理人 胡景波 (51)Int.Cl. A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法 (57)摘。
2、要 本发明涉及M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方 法， 属于肿瘤免疫治疗技术领域。 本发明包含制 备肿瘤细胞裂解液， 进行巨噬细胞的分化培养， 以及进行巨噬细胞的M1极化诱导。 本发明的有益 效果为： M1型巨噬细胞是机体病原微生物和坏死 组织的主要清理细胞， 且具有抗原呈递功能， 在 特异性免疫反应的诱发和免疫调节过程中起关 键作用。 采用坏死肿瘤细胞刺激M1巨噬细胞而制 备的M1巨噬细胞肿瘤疫苗， 将能够克服肿瘤细胞 因表面抗原表达不足、 抗原性弱的弊端， 具有良 好的诱发特异性抗肿瘤免疫反应作用。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 106267174 A 2017.01.04 CN 。
3、106267174 A 1.M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于包含下列步骤： 诱导肿瘤细胞坏死及 制备裂解液， 进行单核细胞-巨噬细胞的分化培养， 进行巨噬细胞的M1极化诱导以及肿瘤细 胞裂解液刺激M1巨噬细胞。 2.根据权利要求1所述的M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述诱导肿瘤 细胞坏死及制备裂解液步骤具体如下： 研碎肿瘤组织并进行一次过滤得到滤液； 将所述滤液加入到装有Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的试管中， 2000rpm离心 20min， 吸取单个核细胞层得到肿瘤细胞， 将所述肿瘤细胞移入到另一试管中； 用生理盐水悬浮所述肿瘤细胞,1000rpm。
4、离心10min， 弃上清， 重复三次； 用生理盐水将所述肿瘤细胞调成4107c/mL,37、 5CO2条件下放置48小时制得坏死 细胞悬液； 将所述细胞悬液置于-80冰箱25min， 取出迅速放入37水浴中10min， 反复3次； 将所述细胞悬液1000rpm离心5min， 取上清液， 分装到离心管中， -20保存。 3.根据权利要求1所述的M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述巨噬细胞 的分化培养步骤包含下列步骤： 将肝素抗凝血注入离心管中,在4下1000rpm离心5min， 移去上层血浆得到血细胞； 向所述血细胞中加Hank s液或生理盐水并混匀制成血细胞悬液， 将所述血细胞。
5、悬液缓 慢加入到装有Ficoll-Hypaque的离心管中， 在4下2000rpm离心20min； 取PBMC并将其移入离心管中， 加Hank s液或生理盐水， 在4下1000rpm离心5min， 弃上 清， 用Hank s液或生理盐水洗细胞3次； 加入无血清培基悬浮所述细胞， 将细胞悬液加入培养瓶中， 37、 5CO2条件下培养2小 时； 轻轻摇晃培养瓶， 吸弃非贴壁细胞。 4.根据权利要求1所述的M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述巨噬细胞 的M1极化诱导步骤包含下列步骤： 吸弃非贴壁细胞的培养瓶中加入含GM-CSF的无血清培基， 37、 5CO2条件下培养9天； 加入含I。
6、FN-以及肿瘤细胞裂解液的无血清培基， 37、 5CO2条件下培养3天； 轻轻摇晃培养瓶， 吸弃培基； 用生理盐水冲洗贴壁细胞， 刮下贴壁细胞， 转至离心管中， 补加盐水， 4下1000rpm离 心5min， 弃去上清； 生理盐水洗细胞并重悬细胞， 加入CpG， 过滤， 将细胞悬液装入冻存管中， 封口粘贴标 签。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106267174 A 2 M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域， 特别是M1巨噬细胞肿瘤疫苗的制备方法。 背景技术 0002 特异性主动免疫疗法治疗肿瘤具有一定的疗效已为许多研究所证实， 如何制。
7、备出 高抗原表达的瘤苗是提高此疗法疗效的关键。 目前， 处于基础和临床研究阶段的瘤苗主要 有修饰的自体肿瘤细胞瘤苗、 单一蛋白成分瘤苗或热休克蛋白肽复合体瘤苗及树突状细胞 瘤苗等,如专利93112060.8等。 修饰的自体肿瘤细胞瘤苗是采用适当的理化因素对肿瘤细 胞进行处理以促进细胞表面蛋白质的变构或偶联， 或用病毒转染和转基因等手段使肿瘤细 胞的异物性增加， 以提高肿瘤细胞的免疫原性而制备的瘤苗， 肿瘤细胞经处理后虽在一定 程度上可增加肿瘤细胞的抗原性， 但修饰方法没有从根本上改变肿瘤细胞表面MHC1类分子 表达减少， 肿瘤特异或非特异性抗原不能表达在细胞表面的弊端， 自体修饰肿瘤细胞瘤苗 。
8、免疫反应的诱发作用不强， 临床疗效并不十分理想。 0003 单一蛋白成分瘤苗(如用从黑色素瘤细胞中提取出的MAGE1、 MAGE2制备的瘤苗)， 这些瘤苗不能克服肿瘤的异质性， 采用这样的瘤苗治疗只会使免疫系统对实体瘤中表达该 抗原肿瘤细胞产生杀伤， 而对同一肿瘤中不表达该抗原的肿瘤细胞不会杀伤， 单一蛋白成 分瘤苗的临床疗效亦不理想。 0004 热休克蛋白肽复合体瘤苗是利用从肿瘤细胞中分离出的热休克蛋白肽复合体制 备的肿瘤疫苗， 这种蛋白成分的瘤苗可以克服MHCI类分子的限制能够用于同种异体， 并能 够克服肿瘤的异质性， 实验研究表明这种瘤苗具有较好的抑瘤作用， 但这种瘤苗的制备成 本很高、。
9、 瘤苗细胞数量少， 不便于临床实际应用。 0005 树突状细胞肿瘤疫苗(DC细胞瘤苗)是目前国内外热点研究的肿瘤疫苗， DC细胞瘤 苗是利用树突状细胞与肿瘤细或肿瘤细胞内容物混合培养而制备的肿瘤瘤苗， 这些肿瘤苗 瘤苗虽可克服了肿瘤细胞抗原性弱和不能用于同种异体的弊端， 但热休克蛋白肽复合体和 DC前体细胞的分离提取比较复杂， 且费用较高， 不适于临床应用。 本项发明是为建立一种有 效并便于临床应用的肿瘤疫苗制备方法。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 本发明提供一种M1巨噬细胞肿瘤疫苗的 制备方法。 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的： M1巨噬细胞肿瘤疫苗。
10、的制 备方法， 包含下列步骤： 诱导肿瘤细胞坏死及制备裂解液， 进行单核细胞-巨噬细胞的分化 培养， 进行巨噬细胞的M1极化诱导以及肿瘤细胞裂解液刺激M1巨噬细胞。 0007 优选地， 所述制备肿瘤细胞裂解液步骤包含下列步骤： 研碎肿瘤组织并进行一次 过滤得到滤液； 将所述滤液加入到装有Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的试管中， 2000rpm 离心20min， 吸取单个核细胞层得到肿瘤细胞， 将所述肿瘤细胞移入到另一试管中； 生理盐 水悬浮所述肿瘤细胞,1000rpm离心10min， 弃上清， 重复三次； 用生理盐水将所述肿瘤细胞 说 明 书 1/4 页 3 CN 10626717。
11、4 A 3 调成4107c/mL,37、 5CO2条件下放置48小时制得细胞悬液； 将所述细胞悬液置于-80 冰箱25min， 取出迅速放入37水浴中10min， 反复3次； 将所述细胞悬液1000rpm离心5min， 取上清液， 分装到离心管中， -20保存。 0008 优选地， 所述巨噬细胞的分化培养步骤包含下列步骤： 将肝素抗凝血注入离心管 中,在4下1000rpm离心5min， 弃上层血浆得到血细胞； 向所述血细胞中加Hank s液或生理 盐水并混匀制成血细胞悬液， 将所述血细胞悬液缓慢加入到装有Ficoll-Hypaque的离心管 中， 在4下2000rpm离心20min； 取PBM。
12、C并将其移入离心管中， 加Hank s液或生理盐水， 在4 下1000rpm离心5min， 弃上清， 用Hank s液或生理盐水洗细胞3次； 加入无血清培基悬浮所 述细胞， 将细胞悬液加入培养瓶中， 37、 5CO2条件下培养2小时； 轻轻摇晃培养瓶， 吸弃 非贴壁细胞。 0009 优选地， 所述巨噬细胞的M1极化诱导步骤包含下列步骤： 加入含GM-CSF的无血清 培基， 37、 5CO2条件下培养9天； 加入含IFN-以及肿瘤细胞裂解液的无血清培基， 37 、 5CO2条件下培养3天； 轻轻摇晃培养瓶， 吸弃培基； 用生理盐水冲洗贴壁细胞， 刮下贴 壁细胞， 转至离心管中， 补加盐水， 4下。
13、1000rpm离心5min， 弃去上清； 生理盐水洗细胞并重 悬细胞， 加入CpG,过滤， 将细胞悬液装入冻存管中， 封口粘贴标签。 0010 本发明的优点和积极效果是： M1型巨噬细胞是机体病原微生物和坏死组织的主要 清理细胞， 且具有抗原呈递功能， 在特异性免疫反应的诱发和免疫调节过程中起关键作用。 采用坏死肿瘤细胞裂解液刺激M1巨噬细胞而制备的M1巨噬细胞肿瘤疫苗， 将能够克服肿瘤 细胞因表面抗原表达不足、 抗原性弱的弊端， 具有良好的诱发特异性抗肿瘤免疫反应作用。 附图说明 0011 图1为M1型巨噬细胞程度CD68、 CD14分子的表达率； 0012 图2为M1型巨噬细胞程度CD68。
14、、 MHC分子的表达率； 0013 图3为M1型巨噬细胞程度CD80、 CD86分子的表达率； 0014 图4为实验组小鼠的处理流程； 0015 图5为各组小鼠的肿瘤形成率； 0016 图6为各组小鼠的肿瘤体积； 0017 图7为各组小鼠的肿瘤重量； 0018 图8为各组小鼠的肿瘤脾细胞肿瘤杀伤率。 具体实施方式 0019 下面结合附图、 通过具体实施例对本发明作进一步详述。 以下实施例只是描述性 的， 不是限定性的， 不能以此限定本发明的保护范围。 0020 实验器材 0021 低温常速离心机(美国， Beckman)、 CO2细胞培养箱(日本， Sanyo)、 移液器(美国, Thermo。
15、)、 刻度吸管(美国， Kimble)、 25cm2培养瓶(美国， Corning)、 15ml离心管(美国， Corning)、 50ml离心管(美国， Corning)、 细胞刮刀(美国， Corning)、 注射器芯(中国， 山东威 高医用高分子股份有限公司)、 培养皿(美国， Corning)、 细胞滤器(美国， Corning)、 倒置显 微镜(日本， Nikon)、 冻存管(美国， Corning)。 说 明 书 2/4 页 4 CN 106267174 A 4 0022 实验试剂 0023 Ficoll-Hypaque细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)、 氯化钠注 射。
16、液(石家庄四药公司)、 NaCl(国药泸试)、 KCl(国药泸试)、 MgSO47H2O(天津致远化学有限 公司)、 MgCl26H2O(天津致远化学有限公司)、 CaCl2(天津博迪化学有限公司)、 Na2HPO4 12H2O(天津市光复科技发展有限公司)、 KH2PO4(天津致远化学有限公司)、 葡萄糖(国药泸 试)、 酚红(上海宝曼生物科技有限公司)、 肝素钠(上海第一生化药业有限公司)、 IFN-(北 京四环生物制药有限公司)、 GM-CSF(北京双鹭药业股份有限公司)、 无血清培基(Thermo)、 CpG(Peprotech)。 0024 肿瘤细胞裂解液的制备： 新鲜肿瘤组织(离体。
17、0.5小时内)剪成1mm3方块， 洗涤后， 采用注射器芯在培养皿中将瘤块研碎,200目滤网过滤， 将滤液加入到装有稀释的Ficoll- Hypaque试管中Ficoll-Hypaque的密度为1.0770.02)： 生理盐水3： 1， 2000rpm离心 20min， 吸取单个核细胞层， 将肿瘤细胞移入到另一试管中。 生理盐水悬浮细胞,1000rpm离 心10min， 弃上清， 重复三次。 用生理盐水将细胞调成4107c/mL,37、 5CO2条件下放置48 小时， 将细胞悬液置于-80冰箱25min， 取出迅速放入37水浴中10min， 反复3次。 1000rpm 离心5min， 取上清液，。
18、 分装到离心管中， -20保存。 0025 配置Hank s液： 1.甲液： NaCl 160g、 KCl8g、 MgSO47H2O 2g、 MgCl26H2O 2g加入 到800ml三蒸水， 溶解。 CaCl2 2.8g溶于100ml三蒸水， 溶解后加入到上述800ml溶液中， 补足 三蒸水至1000ml。 2.乙液： Na2HPO412H2O 3.04g、 KH2PO41.2g、 葡萄糖20g加入800ml双蒸水， 溶解。 加入0.4酚红溶液100ml， 上述二液混合， 加三蒸水至1000ml。 使用时按甲液1份、 乙 液1份、 三蒸水18份滤过， 8磅20min分钟灭菌， 4保存。 00。
19、26 巨噬细胞的分化培养与M1极化诱导： 将20ml肝素抗凝血注入50ml离心管中,在4 下1000rpm离心5min。 移弃上层血浆， 加Hank s液或生理盐水至20ml， 混匀。 将血细胞悬液缓 慢加入到装有4ml Ficoll-Hypaque(密度： 1.0770.001)的离心管中， 每管10ml， 在4下 2000rpm离心20min， 吸取沉淀(PBMC层)细胞并将其移入15ml离心管中。 加Hank s液或生理 盐水至15ml， 在4下1000rpm离心5min， 弃上清。 Hank s液或生理盐水洗细胞3次。 加入16ml 无血清培基悬浮PBMC细胞， 将细胞悬液加入到25c。
20、m2培养瓶中， 每瓶8ml细胞悬液， 37、 5 CO2条件下培养2小时。 轻轻摇晃培养瓶， 吸弃非贴壁细胞。 加入含100ng/mlGM-CSF的无血清 培基， 每瓶12ml， 37、 5CO2条件下培养9天。 加入含100IU/ml IFN-及100 l/ml肿瘤细 胞裂解液(制备方法如方法1)的无血清培基， 每瓶4ml， 37、 5CO2条件下培养3天。 吸取 2ml上清液用于支原体检查(RT-PCR法)， 然后轻轻摇晃培养瓶， 吸弃培基。 用生理盐水冲洗 贴壁细胞3次， 用细胞刮刀刮下贴壁细胞， 转至离心管中， 补加生理盐水至50mL。 4下 1000rpm离心5min， 弃去上清。 。
21、生理盐水洗细胞3次。 1ml生理盐水重悬细胞， 加入4mg/ml的 0.1mlCpG， 200目滤网过滤， 将细胞悬液装入到2mL冻存管中， 封口， 粘贴标签， 用于皮下接 种。 0027 效果测试： 在图5到图8中， A为生理盐水注射组； B为巨噬细胞接种组； C为巨噬细胞 肿瘤疫苗接种组。 A、 B及C组小鼠分别于左后肢皮下接种生理盐水、 未经肿瘤刺激的巨噬细 胞及巨噬细胞肿瘤疫苗(坏死H22肿瘤细胞刺激M1巨噬细胞而得)， 0.1ml/只(B组与C组接种 的巨噬细胞浓度为2106/ml， 生理盐水稀释)， 每周1次， 连续2次， 间隔2周后四组小鼠分别 于左前肢皮下接种生长良好的H22肿。
22、瘤细胞， 0.1ml/只(细胞悬液浓度为2106/ml， 生理盐 说 明 书 3/4 页 5 CN 106267174 A 5 水稀释)， 肿瘤细胞接种4周后处死全部小鼠， 并分别计算四组小鼠成瘤率， 电子天平称量瘤 重量， 游标卡尺测量肿瘤结节的长度(L)与宽度(W)， 计算瘤体积。 注(： 体积0.5LW2)。 结果显示巨噬细胞肿瘤疫苗接种组肿瘤细胞攻击后肿瘤成瘤率、 瘤体积及瘤重量明显低于 未刺激巨噬细胞接种组和生理盐水接种组(P0.05)。 巨噬细胞肿瘤疫苗接种组的脾细胞对 肿瘤细胞的杀伤率明显高于未刺激巨噬细胞接种组和生理盐水接种组(P0.05)， 表明巨噬 细胞肿瘤疫苗在体内能够诱发特异性抗肿瘤免疫反应。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106267174 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 106267174 A 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 106267174 A 8 图5 图6 图7 图8 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 106267174 A 9 。