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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610074261.7 (22)申请日 2016.02.02 (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路220号 (72)发明人 叶丽 姜珊珊 王乾 冯美卿 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 吴桂琴 (51)Int.Cl. A61K 31/44(2006.01) A61K 31/164(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种治疗肿瘤的增效复方药物 (57)摘要。
2、 本发明属生物、 医药技术领域。 涉及抗肿瘤 增效药物， 具体涉及一种或多种神经酰胺和索拉 菲尼组成的治疗肿瘤的增效复方药物。 本发明所 述的复方药物其自身无明显细胞毒性， 联用后能 显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用， 并且能进一步 通过增强凋亡作用加强索拉菲尼对肿瘤细胞的 杀伤， 同时减少药物的用量， 增强其疗效， 降低对 人体的毒副作用。 进一步， 本发明提供了该增效 复方药物及其药物组合物的使用方法， 如， 采用 联合给药或序贯使用治疗肝癌、 肾癌、 非小细胞 肺癌或甲状腺癌等肿瘤， 增强药物对肿瘤的杀 伤。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 107019696 A 2017.08。
3、.08 CN 107019696 A 1.一种治疗肿瘤的增效复方药物， 其特征在于， 由一种或多种神经酰胺和索拉菲尼组 成增效复方药物及其药物组合物。 2.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效复方药物， 其特征在于， 所述的神经酰胺选自神 经酰胺或其衍生物， 包括C2-神经酰胺、 C6-神经酰胺或C8-神经酰胺。 3.按权利要求1或2所述的治疗肿瘤的增效复方药物， 其特征在于， 所述的神经酰胺是 C2-神经酰胺。 4.权利要求1所述的治疗肿瘤的增效复方药物在用于制备治疗肝癌、 肾癌、 非小细胞肺 癌或甲状腺癌药物中的用途。 5.按权利要求4所述的用途， 其中所述的增效复方药物采用联合用药方式或序贯。
4、使用 神经酰胺和索拉菲尼方式治疗肿瘤。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107019696 A 2 一种治疗肿瘤的增效复方药物 技术领域 0001 本发明属生物、 医药技术领域。 涉及抗肿瘤增效药物， 具体涉及一种或多种神经酰 胺和索拉菲尼组成的治疗肿瘤的增效复方药物。 背景技术 0002 业内公知肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一， 其发病率和死亡率呈逐年上升 趋势,严重威胁着人类的健康。 据资料显示， 在中国由于存在较为严重的乙型肝炎病毒 (HBV)感染等致癌风险因素， 肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻。 肝癌可分为原发性和继 发性两大类。 原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间。
5、叶组织， 是我国高发的、 危害极大 的恶性肿瘤； 继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏， 一般 多见于胃、 胆道、 胰腺、 结直肠、 卵巢、 子宫、 肺、 乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。 目前， 肝癌的 治疗手段主要包括肝移植、 肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。 由于肝癌 特别是肝细胞肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发， 因此， 系统化疗是临床上亟需 的HCC治疗手段。 0003 现有技术公开了索拉菲尼(Sorafenib,式1结构所示)是一种多激酶抑制剂， 能靶 向抑制多种存在于肿瘤细胞表面和细胞内的激酶， 如RAF激酶和多种受体酪氨酸激酶 (V。
6、EGFR2、 3， PDGFR、 RET、 c-Kit等)， 从而抑制肿瘤增殖及肿瘤血管形成， 被批准用于治疗肾 细胞癌(RCC)及肝细胞癌(HCC)； Sorafinib是近年来第一个在美国等多个国家被批准应用 于临床的对HCC有效的系统化疗药物， 是HCC分子靶向治疗研究进程中的一座里程碑， 而 Sorafenib的主要缺点是缓解率低。 0004 0005 式1 0006 研究公开了神经鞘磷脂(sphingolipid)是生物膜脂质类的一个家族， 它在调节脂 质双分子层的流动性和亚结构域方面发挥着重要作用； 神经酰胺(ceramide)作为神经鞘磷 脂代谢的核心分子， 不仅参与生物膜的构成。
7、， 而且发挥第二信使分子作用， 一系列合成酶或 分解酶参与神经酰胺在细胞内的代谢； 神经酰胺主要是通过调节磷酸酶和激酶等特异性靶 说 明 书 1/4 页 3 CN 107019696 A 3 蛋白构成的多种信号传导通路， 如AKT、 磷脂酶D、 蛋白激酶C(PKC)和丝裂原活性蛋白激酶 (MAPKs)， 介导肿瘤细胞的生长、 分化、 衰老和凋亡； 神经酰胺的生成和累积可能是阻断肿瘤 活化和生长的关键机制， 因此， 通过调节神经酰胺代谢途径的关键酶或模拟神经酰胺(如神 经酰胺类似物C2或C6神经酰胺)增加神经酰胺的浓度可以增强药物作用、 克服耐药性、 保护 细胞毒性药物作用下的正常细胞， 为治疗。
8、恶性肿瘤提供全新的方法。 据文献报道， 神经酰胺 能够诱导肺癌、 结肠癌、 肝癌等多种肿瘤细胞的凋亡， 在肿瘤治疗中起着重要作用 (Galadari,S.,et al.,Tumor suppressive functions of ceramide:evidence and mechanisms.Apoptosis,2015.20(5):p.689-711.)。 0007 目前临床实践中， 常采用手术、 放射和药物等方法治疗肿瘤， 其中药物治疗仍是肿 瘤治疗的重要手段； 由于化疗单一用药使人体对特定药物产生耐药性的几率较大， 疗效不 甚理想， 因此， 为了达到更好的治疗效果， 常采用多种抗肿瘤。
9、药物进行联合化疗， 迄今， 尚未 见有关神经酰胺和索拉菲尼组成的治疗肿瘤的增效复方药物的报道。 发明内容： 0008 本发明的目的是针对现有技术的缺陷， 提供一种新的复方药物及组合药物， 尤其 是有神经酰胺和索拉菲尼组成的治疗肿瘤的增效复方药物。 本发明所述的复方药物其自身 无明显细胞毒性或对肿瘤有辅助杀伤作用并且能进一步通过增强凋亡作用加强索拉菲尼 对肿瘤细胞的杀伤， 增强其疗效， 降低副作用。 0009 具体的， 本发明提供了一种或多种神经酰胺和索拉菲尼组成的治疗肿瘤的增效复 方药物及其药物组合物； 0010 进一步， 本发明提供了该增效复方药物及其药物组合物的使用方法， 如， 本发明的 。
10、实施例中， 所述的神经酰胺和索拉菲尼组成的治疗肿瘤的增效复方药物及其药物组合物采 用联合给药或序贯使用治疗肝癌、 肾癌、 非小细胞肺癌或甲状腺癌等； 其中优选治疗肝癌的 效果。 0011 本发明中， 神经酰胺可以是神经酰胺本身， 也可以是神经酰胺的衍生物， 如C2-神 经酰胺、 C6-神经酰胺、 C8-神经酰胺， 其中最优选C2-神经酰胺。 0012 本发明的复方药物及其药物组合物中， 所述的索拉菲尼能靶向性的与肿瘤细胞结 合抑制肿瘤细胞增殖， 神经酰胺能直接诱导肿瘤细胞凋亡， 二者联合用药能增强索拉菲尼 肿瘤治疗作用。 0013 本发明中进行了细胞试验， 选取肝癌肿瘤细胞系Bel7402， 。
11、设置不同浓度梯度给予 索拉菲尼和神经酰胺， MTT法测细胞活性， 结果显示， 索拉菲尼能显著抑制肿瘤细胞的增殖， 神经酰胺对Bel7402的杀伤相对较弱； 采用联合给药方式， 包括10 M索拉菲尼加10 M神经酰 胺， 结果显示， 联合给药方式对肿瘤细胞的杀伤作用高于单独给药组。 0014 本发明中， 采用Western-blot法检测凋亡相关蛋白PARP/Cleaved-PARP、 Caspase3/Cleaved-Caspase3、 Caspase9/Cleaved-Caspase9、 Bax、 Bcl2的水平， Annexin -PI双染检测联合给药方式后细胞的凋亡情况， 结果均显示， 。
12、联合用药后肿瘤细胞的凋亡 水平明显增加。 0015 本发明的优点在于， 0016 1， 提供的由神经酰胺和索拉菲尼组成的治疗肿瘤的增效复方药物其自身无明显 说 明 书 2/4 页 4 CN 107019696 A 4 细胞毒性； 0017 2， 联合用药或序贯使用神经酰胺和索拉菲尼治疗肿瘤， 能增强索拉菲尼杀伤肿瘤 细胞的能力； 0018 3， 可以减少药物的用量， 降低对人体的毒副作用， 尤其适用于肝癌、 肾癌， 其中肝 癌效果明显。 附图说明 0019 图1， 索拉菲尼对Bel7402存活率的影响。 0020 图2， 神经酰胺对Bel7402存活率的影响。 0021 图3， 联合给药对Be。
13、l7402的影响， 其中， C表示神经酰胺； S表示索拉菲尼。 0022 图4， 光镜下观察联合给药后细胞状态。 0023 图5， 流式细胞术检测Bel7402细胞凋亡情况。 0024 图6， western-blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。 具体实施方式： 0025 实施例1： 索拉菲尼、 神经酰胺对Bel7402的存活率的影响实验 0026 Bel7402细胞生长至对数生长期后， 以5103cells/ml的浓度转入细胞培养板内 培养， 待细胞贴壁后， 更换新鲜培养基， 给予不同浓度的索拉菲尼、 神经酰胺及二者联合给 药， 连续培养48h， 加入10 l MTT反应液， 37避光孵育4。
14、h， 待MTT与细胞内琥珀酸脱氢酶充 分反应生成甲瓒后加入100 l二甲亚砜(DMSO)， 溶解后于590nm波长下测各组的O.D值， 以对 照组的O.D.为100进行细胞活力百分比换算， 并用graphpad进行统计学分析， 结果显示， 索拉菲尼对肝癌细胞Bel7402的杀伤作用呈剂量依赖性增加， 10 M索拉菲尼对细胞的杀伤 为20左右， 20 M杀伤为60左右(如图1所示)； 0027 图2显示了神经酰胺对Bel7402细胞的杀伤作用呈剂量依赖性增加， 剂量为20 M时 对细胞的杀伤约为30， 当剂量提高到80 M时对细胞的杀伤达到80； 0028 图3显示了联合用药后， 达到相同杀伤效。
15、果， 需要的联合用药剂量降低， 如10 M索 拉菲尼与10 M神经酰胺单独作用细胞， 对细胞的杀伤仅为20-30左右， 联合给药后， 杀 伤作用增加到60。 若单独治疗， 当杀伤率为60需要索拉菲尼20 M， 神经酰胺40 M； 0029 联合用药结果表明， 神经酰胺能够增强索拉菲尼对Bel7402的细胞毒性， 同时， 降 低了药物的用量， 减少对正常组织的副作用。 0030 实施例2光学显微镜下观察神经酰胺联合索拉菲尼后细胞形态的改变 0031 将对数期细胞以5103/孔的密度种于6孔板中， 以一定药物作用细胞， 之后， 与光 学显微镜下观察细胞形态的改变， 图4显示了联合给药与正常组及单给。
16、药组相比， 细胞皱 缩， 数量明显减少。 0032 实施例3： 流式细胞术检测神经酰胺联合索拉菲尼能够增强肿瘤细胞的凋亡 0033 将处于对数期的细胞以5103/孔的密度种于6孔板中， 药物作用一定时间， 收集 细胞， 用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次， 弃掉PBS， 加入500 l缓冲液重悬细胞， 加入5 l Annexin和5 l PI， 随后采用流式细胞仪检测Annexin阳性比率， 结果显示， 神经酰胺联 合索拉菲尼能够增强肿瘤细胞的凋亡(如图5所示) 说 明 书 3/4 页 5 CN 107019696 A 5 0034 实施例4： Western-blot检测神经酰胺联合索拉菲尼后凋亡。
17、相关蛋白的表达水平 0035 将对数期细胞以5103/孔的密度种于6孔板中， 以一定药物作用细胞， 之后， 收集 细胞， 用预冷的0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤2次， 用RIPA裂解液重悬并裂解细胞， 冰上 放置30min待细胞充分裂解， 4下12000r离心5min收集上清液， 每孔上样等量蛋白并进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离， 随后将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜并用含5牛血清蛋白 的TBST进行封闭1.5h， 一抗孵育过夜后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h， TBST清 洗3次后ECL化学发光显色试剂盒进行显色， 观察凋亡相关蛋白的表达情况， 结果显示， 神经 酰胺联合索拉菲尼后明显增加凋亡相关蛋白的表达水平(如图6所示)。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107019696 A 6 图1 图2 图3 图4 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 107019696 A 7 图5 图6 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 107019696 A 8 。