技术领域
本发明涉及一种可应用于生物医学领域的纳米材料，特别涉及一种负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法。
背景技术
磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)是一种无创伤性的医学影像诊断手段，是通过检测脉冲磁场下氢离子的分布对深层组织进行成像，具有轴状面和矢状面的同步观察能力，在体现组织间病变微弱差异中具有独特的优势，同时对人体无辐射损伤。目前研究的MRI造影剂主要包括两大类：一类是使局部组织变亮的T1造影剂，如含三价钆离子(Gd3+)的顺磁性螯合物；另一类是使局部组织变暗的T2造影剂，如具有顺磁性的氧化铁纳米颗粒造影剂。目前，这两类造影剂的生物安全性和循环代谢等问题限制了在临床诊断中的应用。
普鲁士蓝是一种历史悠久的蓝色染料，已被美国食品药品监督局认证临床治疗铊等放射性元素中毒的解毒剂，具有良好的生物相容性及生物安全性。普鲁士蓝制备过程简单、成本低廉、反应条件温和、表面易修饰，由于本身独特的电子自旋特性而同时具备MRI的T1成像和T2成像能力，在生物医学诊断领域已经成为研究的热点。然而，大部分合成的普鲁士蓝纳米颗粒缺乏主动靶向的功能，使其在实际应用中未能精确地到达病灶部位，难以实现精准治疗，因此，制备一种可以主动靶向的普鲁士蓝纳米颗粒对于医学诊断尤为重要。
近年来，生物活性肽因其穿透能力强，能较快地到达靶点等特性而被用作靶向性修饰造影剂。这些多肽及多肽类似物的设计合成比较方便，具备良好的生物相容性并与靶点结合的特异性高，能够满足对相应疾病精准诊断的目的。
综上所诉，本研究在普鲁士蓝纳米颗粒的基础上对其进行功能化修饰，利用合成的普鲁士蓝纳米颗粒上的马来酰亚胺集团与靶向性多肽上的巯基相结合，制备出一种可负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒，其特征是普鲁士蓝纳米颗粒的粒径在70～180nm。
发明内容
本研究的目的旨在提供一种可负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，该纳米颗粒可主动靶向病灶区域实现MRI的T1/T2的同时成像。
本发明所述的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，其特征步骤如下：
1)将六氰络铁酸类物质和有机酸按摩尔比1：(10～25)溶于去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将氯化铁或氯化亚铁和有机酸按摩尔比1：(10～25)溶于去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)将溶液A逐滴加入溶液B中，使用的六氰络铁酸类物质与氯化铁或氯化亚铁的摩尔比为1：1；50～70℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将氨基化组分与普鲁士蓝纳米颗粒按摩尔比(0.015～0.03)：1添加到溶液C中，50～70℃下反应0.5～1h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D与羧基化组分溶于溶剂中，室温反应1～3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E，使用的羧基化组分与氨基化组分的摩尔比为(150～250)：1；
4)将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E与N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于溶剂中，室温反应1～3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F，使用的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺与羧基化组分的摩尔比为(1.5～2.5)：1；
5)将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与多肽按质量比1：(10～30)混匀悬培2-6h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒。
步骤1)所述的六氰络铁酸类物质，包括亚铁氰化钾、铁氰化钾、亚铁氰化钠、铁氰化钠、亚铁氰化铵、铁氰化铵中的一种或两种的组合。
步骤1)所述的六氰络铁酸类物质水溶液的浓度为1～5mmol/L；所述的氯化铁或氯化亚铁水溶液的浓度为1～5mmol/L。
步骤1)所述的有机酸为柠檬酸、苹果酸、琥珀酸中的一种或两种的组合。
步骤2)所述的氨基化组分为聚醚酰亚胺、聚丙烯胺基盐酸盐中的一种或两种的组合。
步骤2)所述的氨基化组分的浓度为0.015～0.05mmol/L。
步骤3)所述的羧基化组分为马来酸酐、丁二酸酐中的一种或两种的组合。
步骤3)所述的羧基化组分的浓度是2.5～8.75mol/L。
步骤3)所述的溶剂为二甲基亚砜或者丙酮，优选二甲基亚砜。
步骤4)所述的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺的浓度是5～12.5mol/L。
步骤4)所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，优选N,N-二甲基甲酰胺。
步骤5)所述的多肽为含有半胱氨酸的多肽或者是增添半胱氨酸残基的多肽。
本发明与现有技术相比特征在于：第一，制备的纳米颗粒具有良好的生物相容性及生物安全性，其粒度均一，粒径可控(70-180nm)；第二，通过对普鲁士蓝纳米颗粒进行功能化修饰，可以负载有生物活性的靶向性多肽，所制备的纳米颗粒具有良好的r1横向弛豫率和r2纵向弛豫率，可以实现对病灶区域的MRI(T1/T2)同时成像。
本发明的优点在于，提供了一种可负载靶向性多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的制备方法，该方法可重复性高，操作简单易行，且绿色环保，适合大批量生产。
附图说明
图1：实施例1中制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的透射电镜照片(形貌分析)。
图2：实施例2中制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的SDS-PAGE凝胶电泳图(判定马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒与多肽的结合情况)。1号泳道表示单纯含有半胱氨酸的多肽，2号泳道表示负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒经离心洗涤后的沉淀，3号泳道表示负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒经离心洗涤后的上清。
图3：实施例2中制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的核磁弛豫率图(MRI造影剂成像效果分析)。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明做进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1:
1)：将0.02毫摩尔的亚铁氰化钾和0.5毫摩尔柠檬酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.02毫摩尔的氯化铁和0.5毫摩尔柠檬酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.0006毫摩尔聚醚酰亚胺添加到溶液C中，60℃下反应0.5h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.1毫摩尔的马来酸酐溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.2毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比20:1混匀悬培6h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为70nm，如图1所示为制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的透射电镜图。
实施例2:
1)：将0.056毫摩尔的铁氰化钠和1.12毫摩尔柠檬酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.056毫摩尔的氯化亚铁和1.12毫摩尔柠檬酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.001毫摩尔的聚醚酰亚胺添加到溶液C中，60℃下反应0.5h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.25毫摩尔的丁二酸酐溶于40毫升丙酮中，室温反应2天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.375毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比15:1混匀悬培4h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为85nm；
如图2凝胶电泳结果所示，负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒经离心洗涤后的沉淀与单纯含有半胱氨酸多肽的蛋白条带相一致，而经离心洗涤后的上清则无条带，说明制备的马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒可以成功负载含半胱氨酸的多肽；如图3核磁弛豫率测试结果所示，所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒的r1横向弛豫率为1.724mM-1·s-1，r2纵向弛豫率为2.528mM-1·s-1，说明此纳米颗粒具有良好的MRI(T1/T2)成像能力。
实施例3:
1)：将0.04毫摩尔的亚铁氰化铵和0.6毫摩尔苹果酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.04毫摩尔的氯化铁和0.6毫摩尔苹果酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.0008毫摩尔的聚丙烯胺基盐酸盐添加到溶液C中，60℃下反应1h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.16毫摩尔的马来酸酐溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.4毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比15:1混匀悬培2h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为120nm。
实施例4:
1)：将0.08毫摩尔的铁氰化钾和1.2毫摩尔琥珀酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.08毫摩尔的氯化亚铁和1.2毫摩尔琥珀酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.0015毫摩尔的聚丙烯胺基盐酸盐添加到溶液C中，60℃下反应1h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.25毫摩尔的马来酸酐溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应1天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.4毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比20:1混匀悬培6h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为140nm。
实施例5:
1)：将0.03毫摩尔的亚铁氰化钾和0.03毫摩尔的亚铁氰化钠、0.6毫摩尔柠檬酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.06毫摩尔的氯化铁和0.6毫摩尔柠檬酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.0012毫摩尔的聚醚酰亚胺添加到溶液C中，60℃下反应0.5h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.18毫摩尔的丁二酸酐溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.4毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比10:1混匀悬培3h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为110nm。
实施例6:
1)：将0.1毫摩尔的亚铁氰化钠和1毫摩尔琥珀酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.1毫摩尔的氯化铁和1毫摩尔琥珀酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.0006毫摩尔的聚醚酰亚胺和0.001毫摩尔的聚丙烯胺基盐酸盐添加到溶液C中，60℃下反应1h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.35毫摩尔的马来酸酐溶于40毫升丙酮中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.6毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应2天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比30:1混匀悬培6h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为180nm。
实施例7:
1)：将0.01毫摩尔的铁氰化钠和0.03毫摩尔的铁氰化胺、0.5毫摩尔的柠檬酸和0.5毫摩尔的苹果酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.04毫摩尔的氯化亚铁、以及0.5毫摩尔的柠檬酸和0.5毫摩尔的苹果酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.001毫摩尔的聚醚酰亚胺添加到溶液C中，60℃下反应1h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.07毫摩尔的马来酸酐和0.08毫摩尔的丁二酸酐溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.375毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比10:1混匀悬培5h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为165nm。
实施例8:
1)：将0.02毫摩尔的亚铁氰化钾和0.04毫摩尔的亚铁氰化胺、以及0.6毫摩尔的琥珀酸溶于20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液A；将0.06毫摩尔的氯化铁和0.6毫摩尔的琥珀酸20毫升去离子水中，充分混匀得到澄清溶液B；
2)：将溶液A逐滴加入溶液B中，60℃下反应，得到含有普鲁士蓝纳米颗粒的水溶液C，紧接着将0.001毫摩尔的聚醚酰亚胺和0.001毫摩尔的聚丙烯胺基盐酸盐添加到溶液C中，60℃下反应0.5h，待反应体系降至室温，离心洗涤，得到含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D；
3)：将含有氨基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀D、0.16毫摩尔的马来酸酐和0.14毫摩尔的丁二酸酐溶于40毫升二甲基亚砜中，室温反应3天，离心洗涤，得到含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E；
4)：将含有羧基化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀E、0.5毫摩尔的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶于40毫升N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应1天，离心洗涤，得到含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F；
5)：将含有马来酰亚胺化的普鲁士蓝纳米颗粒的沉淀F分散于磷酸盐溶液中，并与含半胱氨酸的多肽按质量比20:1混匀悬培6h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次，得到负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒；
所制备的负载多肽的普鲁士蓝纳米颗粒其粒径约为100nm。
所述的制备方法包括普鲁士蓝纳米颗粒的合成以及其表面功能化修饰，利用纳米颗粒表面修饰的马来酰亚胺集团与巯基的特异性结合来负载有生物活性的靶向性多肽。本发明的制备方法操作简单、绿色环保，原料易得，制备的纳米颗粒具有生物相容性好和生物安全性高的优点，可以主动靶向病灶区域，实现对疾病的精确诊断。本发明制备的普鲁士蓝纳米颗粒粒径大小可控，在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中具有良好的分散性，有利于在生物体内的应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。