技术领域
本发明涉及动物医学领域，尤其涉及TSG的用途。
背景技术
TSG 全称2，3，5，4′-tetrahy -droxystilbene-2-O-β-D-glucoside，中文名为2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D 吡喃葡萄糖苷，分子量为406.39，化学式为C20H22O9
TSG是一种多羟基酚类化合物，是一种易溶于水的白色粉末。研究发现TSG具有多种生理活性，其药理作用十分广泛，其药用价值受到人们的广泛青睐。
精液品质是公猪繁殖力的一个重要指标,精液品质不良是母猪不孕的重要原因之一。对于现代养猪生产来说，公猪精液品质不良是一种经常出现的问题。
在改善种公猪精子质量方面，研究者们采用多种方式，通过一些化学合成药物、抗生素、一些中草药复方制剂及中草药提取物等的抗氧化剂可以清除精子内过量的ROS。维生素类和脂肪酸对于维持正常精液质量维生素A对维持精液品质有着重要的作用，其缺乏会导致种公猪的繁殖性能力下降、性欲下降、影响精子的生成，从而影响精液品质下降，影响生殖器官的发育。李雪梅等将维生素A加入种公猪基础日粮中，发现采精量、精子密度有所提高，精子畸形率降低，保证精子质量。王怀禹等人发现将适宜剂量维生素E加入日粮中，提高了精液品质。矿物质元素对于维持种公猪的精液品质具有一定的影响，其中钙和磷是最重要的，含量一般在0.85%-0.90%和0.70%-0.80%；锌对精液品质也有一定的影响，锌是多种酶的组成成分及激活剂，对精子的发育形成、精子活力、密度和精液量都具有明显的作用。何若刚等发现，锌能显著提高精子活力、有效精子数并降低精子畸形率。矿物质元素硒会使种公猪性欲减退，精液品质下降。苏惠龙等发现硒能提高精子活力、降低畸形率并保证顶体膜从而提高精子质量。维生素E是体内主要的抗氧化剂，也是精子中有效的抗氧能够保护精子细胞膜、线粒体膜及顶体膜等的生物膜的完整性，保护精子细胞免受ROS损害。在生殖上维生素E有调节性腺功能和延长精子寿命的作用。杨文瑾发现亚硒酸钠维生素E发挥了硒和维生素E的协同抗氧化作用，能够维持精子顶体细胞膜的机能。Echeverria-Alonzo等发现硒对精液品质的提高效果强于 VE。VC属于水溶性抗氧化剂，Ivos在公猪日粮中添加VC，发现其可以抵抗热应激， VC 能提高高频率采精期公猪的精液。Paulenz在公猪日粮中添加富含n-3PUFA的鱼肝油，能够改善精液品质。
除此之外，某些植物具有抗氧化性，如红景天、龙胆属植物、迷迭香等植物。抗氧化剂成分，可以清除精子内过量的ROS，减轻ROS对精子的损伤。提高保护精子质膜、正常形态精子率及其运动力、降低畸形率。zhao实验表明在猪冻精中加入红景天后精子ROS减少，谷胱甘肽还原酶等增加，减少了精子结构的损害。Mourvaki 等将亚麻仁油添加到种公猪日粮中，发现精子质膜结构得到改善。某些植物源性抗氧化剂中分离的单体物质：黄酮、多酚、生物碱、皂苷、多糖、番茄红素、枸杞多糖等抗氧化剂成分。均可抑制或清除精子内过量的ROS，增加抗氧化酶水平，抵抗由氧化应激导致的精子结构损伤，提高精子浓度和活力，保证精子质量。研究表明褪黑素（MLT）能够精子质量，李博玲在猪精液冷冻稀释液中添加MLT0.25mg/ml能显著提高精子活率、活力、线粒体活性和顶体完整性。
龙翔等用由当归、熟地、香附、阳起石、淫羊藿、川断、菟丝子、玄参组成的添加剂饲喂种公猪，发现能极显著提高精液量、精子密度、精子成活率，同降低精子顶体异常率、精子畸形率。谷新利等用淫羊藿和菟丝子等组成的中草药添加剂饲喂种公羊,结果精液品质明显改善。邱黛玉用当归、党参、黄芪、淫羊藿等组成的复方中草药制剂，公羊射精量增加、精子密度升高、精子畸形率降低，精液品质得到明显改善你呢。鼠尾草一种传统的中药，Jasem等用其乙醇提取饲喂大鼠，其具有改善雄性生殖功能作用的。研究显示,含多个羟基的化合物，如二苯乙烯苷、茶多酚、淫羊藿有效成分箭叶淫羊藿素A～ E等，李永刚羟基自由基可与芳香环发生加成反应，可清除ROS。杨欣等证明淫羊藿水提物具有抗氧化性，能清除精子内多余ROS，显著改善精子体外运动功能。段润甲基于止痢草油中含有活性成分香芹酚和百里香酚，均具有强的抗氧化能力，能有效抑制脂质过氧化。种公猪日粮中添加 止痢草油500mg/kg可以提高精液抗氧化酶活力，抑制精子脂质过氧化，从而提高了公猪的精子活力。杨欣研究菟丝子水提物对人精子顶体和超微结构的保护作用，发现适宜含量(0.25 g/mL)的菟丝子水提物具有抗氧化性，可拮抗ROS的过氧化损伤作用，对精子膜、顶体结构和精子线粒体功能具有明显的保护作用。肉苁蓉苯乙醇苷（Phenylethanoidgly-cosides,PhGs)含有多个酚羟基，是抗氧化和抗衰老的主要成分，能够结合体内自由基,避免其在体内的大量蓄积，保护机体免受过量氧化损伤。李刚证明PhGs发挥其抗氧化性，抑制精子膜脂质过氧化反应并对精子膜结构及功能具有一定的保护作用。
可见，目前在提高种公猪精液品质技术方面，大部分采用通过一些化学合成药物、抗生素、一些中草药复方制剂及中草药提取物等。但这些物质作用有限，没有能够很好的提高精子的活力。且有些药物具有毒性及抗药性，会种公猪产生毒害作用，最终危害人类健康。故而，进一步研究提高公猪精液品质的方法具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供TSG的用途；该化合物能够降低精子内Ca2+水平和/或ROS水平，从而提高精子的活率和活力。
TSG在降低精子内Ca2+水平和/或ROS水平中的应用。
本发明中，所述精子为猪的精子。
本发明中，实验采用的猪为杜洛克猪。
TSG在降低精子内Ca2+水平中应用的浓度为0.5 μg/mL ~4 μg/mL。
TSG在降低精子内Ca2+水平中应用的浓度为0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL或4 μg/mL。
TSG在降低精子ROS水平中应用的浓度为0.5 μg/mL ~4 μg/mL。
TSG在降低精子ROS水平中应用的浓度为0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL或4 μg/mL。
活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），是机体在代谢过程中产生的一类中间物，研究表明，ROS引起的精子膜脂类过氧化反应是造成精子存活率降低和运动丧失的主要原因之一。本发明实验表明，相对于未经TSG处理的精液，以TSG处理精液2h后，精子内ROS水平显著降低（p<0.01）。且采用不同浓度处理TSG的实验组之间效果并无显著差异（p>0.05）。
Ca2+在精子发生、成熟、获能等过程中发挥重要的作用，是精子运动的调控者，顶体反应的第二信使。现有技术中，常通过增加Ca2+浓度来增强精子活力，本发明实验结果表明，抑制Ca2+水平有利于精子活力保持。本发明实验表明，相对于未经TSG处理的精液，以TSG处理精液2h后，精子内Ca2+水平受到显著的抑制（p<0.01）。且采用不同浓度处理TSG的实验组之间效果并无显著差异（p>0.05）。
本发明还提供了TSG在提高精子活力中的应用。
本发明中，所述精子为猪的精子。
本发明中，实验采用的猪为杜洛克猪。
TSG在提高精子活力中应用的浓度为0.5 μg/mL ~4 μg/mL。
TSG在提高精子活力中应用的浓度为0.5 μg/mL、1 μg/mL或4 μg/mL。
实验表明，浓度为0.5 μg/mL或1 μg/mL TSG对精子活力的提高作用更明显。
精子活率指精液中活精子所占的百分率。精子活力指精液中呈前进运动精子所占的百分率。本发明实验证实，在1h内，是否以TSG处理精液，精子的活力差别不显著（p>0.05），而2h后，经TSG处理的精液中精子的活力显著（p<0.01）高于未经处理的精液中精子活力。并且，本发明的实验显示，在提高精子活力的同时，TSG对精子的活率并不产生影响。
本发明还提供了一种提高精子活力的制剂，其中包括TSG。
本发明提供的精子活力制剂中包括TSG和PBS缓冲液。
本发明提供的提高精子活率的制剂以PBS缓冲液溶解TSG制成。
其中，PBS的pH值为7.4；TSG的浓度为1~10mg/mL；优选的，TSG的浓度为1mg/mL。
本发明还提供了一种提高精子活力的方法，该方法为：使TSG与精液混合。
以本发明提供方法提高活力的精子为猪精子。
提高精子活力的TSG的浓度为0.5 μg/mL ~4 μg/mL。即每μg TSG与5μL~40μL精液混合。
本发明提供了TSG通过抑制Ca2+水平和ROS水平来提高精子活力的应用，本发明提供的实验证明，TSG能够提高精子活力而不影响精子的活率。实验表明，浓度为0.5 μg/mL~4μg/mL的TSG对精子活力的提高作用十分显著（p<0.01）。
附图说明
图2示不同浓度TSG处理种公猪精子2h后对其精子活力的影响；
图3示TSG对精子活率的影响（各组数值P＞0.05）；
图4流式细胞仪检测分析不同浓度TSG对精子内Ca2+水平的影响；其中，图4-a示空白对照组，图4-b示0.5μg/mL的TSG处理组，图4-c示1μg/mL的TSG处理组，图4-d示2μg/mL的TSG处理组；图4-e示4μg/mL的TSG处理组；
图5示TSG对精子内Ca2+水平的影响；其中，**示P<0.01；
图6示流式细胞仪检测分析不同浓度TSG对精子内ROS水平的影响；其中，图6-a示空白对照组；图6-b示0.5μg/ml的TSG处理组；图6-c示1μg/ml的TSG处理组；图6-d示2μg/ml的TSG处理组；图6-e示4μg/ml的TSG处理组
图7示TSG对精子ROS水平的影响；其中，**示P<0.01。
具体实施方式
本发明提供了TSG的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：
精液取自吉林大学原种猪场杜洛克种公猪，每次采精时间在都在早上，采用了手握法采精法。杜洛克新鲜精液，用Smeminark稀释液按1:1稀释，将精液稀释到l×106个/mL。
猪精子稀释液（seminark）、二苯乙烯苷（TSG）、PBS、4%多聚甲醛、0.22%考马斯亮蓝G-250、invitrgen公司的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4以及NaH2PO4均购自Sigma公司；
甲醇及冰醇酸均购自国产分析纯；
化丙啶（PI）、碧云天JC-1检测试剂盒、碧云天Fluo-3AM试剂盒、碧云天活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）。
可调式恒温水浴锅(DK-8D型，上海一恒科技有限公司)；
热恒温培养箱（DHP-9272型，上海一恒科学仪器有限公司）；
-20℃冰箱（中国新飞公司）、4℃冰箱（中国新飞公司）；
-80℃超低温冰箱（日本SANYO公司）；
PB-10PH计（Sartorius）、BS 124S 分析天平（Sartorius）；
DHP-9272涡旋混合器（海门其林尔贝）；
普通显微镜、4℃离心机（TGL-16gR ）；
普通离心机（德国Thermo公司）；
粘附载玻片（南通海伦生物医学器械制造有限公司）；
高压蒸汽灭菌锅(长春百奥公司)；
精子质量检测分析仪(型号GK-9900A，徐州市广科新技术发展有限公司生产)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 TSG对猪精子活力的影响
1）将TSG用PBS溶解，使TSG的储存浓度为1mg/ml，然后保存在-20℃的冰箱里，在使用前将1 mg/ml的PBS用猪精液稀释液稀释50倍后，使用时的工作浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、4μg/ml。
2）在不同时间0h、0.5 h、1 h、2 h，分别用0.5μg/ml、1μg/ml、4μg/ml处理子，放在37℃恒温箱孵育。即分别取200μ猪精液，加入5μl、10μl、40μlTSG。
3）各取50μl的用TSG处理后的精子和空白对照滴于玻片上，用精子质量检测分析仪检测精子活力。
4）同一时间点同一浓度用精子质量分析仪重复测8次。
检测结果如表1、图1~2：
表1 孵育2小时精子活力变化
0h活力（%） 2h活力（%） 活力降低程度（%） 0 μg/mL 76 38 38 0.5 μg/mL 77 58 17** 1 μg/ml 78 58 20** 4 μg/ml 77 52 25**
**示与0μg/mL的对照相比存在显著差异，p<0.01
结果显示，在1h内，是否以TSG处理精液，精子的活力差别不显著（p>0.05），而2h后，经TSG处理的精液中精子的活力显著（p<0.01）高于未经处理的精液中精子活力。
实施例2 TSG对猪精子成活率的影响
精子处理之后，用invitrgen公司的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)，之后用流式细胞仪检测猪精子活率。
将精子处理之后,在37℃恒温箱中孵育2h，600g离心8分钟，然后用200μl的猪精子稀释液（（seminark）悬浮。
各加入0.2μl的PI(2.4Mm，propidium iodide)，37℃孵育10分钟。
孵育后用猪精液稀释液（seminark）离心洗涤两次。
用流式细胞仪检测精子活率。（死精子被PI染色呈红色，试验每个浓度重复五次，每个样品至少检测10000个精子）
检测结果如图3，结果显示在提高精子活力的同时，TSG对精子的活率并不产生影响。
实施例3 TSG对精子内钙离子水平的检测
实验分为实验组和对照组，实验组分为四组，即在精液中加入TSG：0.5ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml，对照组不加TSG。另设置一空白对照，不加Fluo-3AM染料。每组实验做5个重复。
实验方法为：
精子经过处理后，用碧云天Fluo-3AM试剂盒，并且用流式细胞仪检测精子内钙离子水平。
1)每组取200μl的猪精液，加入相对应的不同浓度的TSG处理后，放在37℃恒温箱里，孵育2h。
2)按照1：1000比例，在精液中加入Fluo-3AM染料以后，轻轻混匀后，放在37℃恒温箱里孵育30min。
)用猪精洗涤液洗涤两次，然后37℃恒温箱，孵育20min。以确保Fluo-3AM在精子内全部变成Fluo-3。Fluo-3AM的荧光特别弱，其荧光强度不会随着钙离子浓度升高而增强，当Fluo-3AM染料进入细胞后，细胞内的剪酯酶可以把它剪切成 Fluo-3。Fluo-3可以与钙离子结合，结合钙离子后会产生荧光，每种处理重复五次，每个样品至少检测 10000 个精子。钙离子水平可以用钙离子强度来表示。
)用流式细胞仪快速检测TSG对精子钙离子水平的影响。
结果如图4-a~图4-e及图5所示，结果显示：相对于未经TSG处理的精液，以TSG处理精液2h后，精子内Ca2+水平受到显著的抑制（p<0.01）。且采用不同浓度处理TSG的实验组之间效果并无显著差异（p>0.05）。
实施例4 TSG对精子内活性氧水平的检测
一：实验设计及分组
实验分为实验组和阳性对照组，并设置空白对照组。即在实验组设计四个不同浓度的TSG:0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml，每组重复五次；阳性对照组中各加入Ros-up 0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml，每个浓度重复一次；空白对照组加入等量的猪精液稀释液；实验组、阳性对照组和空白对照组均加入DCFH-DA探针，并设置一个不加入DCFH-DA探针的空白组。
二：方法
1）先处理好精子（用二苯乙烯苷TSG，以不同浓度的TSG处理2h，方法如之前所述），37℃孵育2h。
2）加入DCFH-DA（按照1:1000比例），放在37℃恒温箱里，孵育30min。（每隔3-5min颠倒轻轻混匀一下，使得荧光探针DCFH-DA与细胞充分地接触）。
3）用猪精液稀释液洗涤三次，充分除去未进入细胞内的DCFH-DA)。
4）用猪精稀释液充分悬浮细胞后，用流式细胞仪检测仪检测精子的活性氧产生情况。实验采用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Assay Kit)，这是一种利用带有荧光的DCFH-DA探针进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身并没有荧光，它可以自由地穿过细胞膜，当进入细胞内以后，细胞内的酯酶可以将其水解生成DCFH。酶水解之后形成的DCFH不能通透细胞膜，这样探针就使得探针很容易装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。这样通过检测DCF的荧光就可以知道细胞内的活性氧水平。
结果如图6-a~图6-e及图7，相对于未经TSG处理的精液，以TSG处理精液2h后，精子内ROS水平显著降低（p<0.01）。且采用不同浓度处理TSG的实验组之间效果并无显著差异（p>0.05）。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。