TSG的用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610326072.4 (22)申请日 2016.05.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105726550 A (43)申请公布日 2016.07.06 (73)专利权人 吉林大学 地址 130062 吉林省长春市前进大街2699 号 (72)发明人 李纯锦 刘亚亭 周虚 赵云 陈璐 陈树雄 蒋彦文 高珊 巴桑旺堆 刘卓 郑雪 王凤鸽 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 赵青朵 (51)Int.Cl. A61K 3

2、1/7032(2006.01) A61P 15/08(2006.01) (56)对比文件 CN 101554410 A,2009.10.14,全文. 李博玲等.褪黑素、 谷胱甘肽对猪精液冷冻 保存效果的影响. 四川畜牧兽医 .2011, (第7 期),第26-28页. 张金康.二苯乙烯苷防治骨质疏松的作用及 相关机制研究. 中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑 .2014, (第02期),E065-19. 吕丽爽.何首乌中二苯乙烯苷的研究进展. 食品科学 .2006,第27卷(第10期),第608-612 页. 赵娜等.钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化 调节作用研究. 畜牧与兽医 .201

3、5,第47卷(第9 期),第20-26页. 审查员 董潜 (54)发明名称 TSG的用途 (57)摘要 本发明涉及动物医学领域， 尤其涉及TSG的 用途。 本发明提供了TSG通过抑制Ca2+水平和ROS 水平来提高精子活力的应用， 本发明提供的实验 证明， TSG能够提高精子活力而不影响精子的活 率。 实验表明， 浓度为0.5g/mL4g/mL的TSG 对精子活力的提高作用十分显著(p 0.05） ， 而2h后， 经TSG处理的精液中精子的活力显著 （p0.01） 高于未经处理的精液中精子 活力。 并且， 本发明的实验显示， 在提高精子活力的同时， TSG对精子的活率并不产生影响。 0026

4、本发明还提供了一种提高精子活力的制剂， 其中包括TSG。 0027 本发明提供的精子活力制剂中包括TSG和PBS缓冲液。 0028 本发明提供的提高精子活率的制剂以PBS缓冲液溶解TSG制成。 0029 其中， PBS的pH值为7.4； TSG的浓度为110mg/mL； 优选的， TSG的浓度为1mg/mL。 0030 本发明还提供了一种提高精子活力的方法， 该方法为： 使TSG与精液混合。 0031 以本发明提供方法提高活力的精子为猪精子。 0032 提高精子活力的TSG的浓度为0.5 g/mL 4 g/mL。 即每 g TSG与5 L40 L精液 混合。 0033 本发明提供了TSG通过抑

5、制Ca2+水平和ROS水平来提高精子活力的应用， 本发明提 供的实验证明， TSG能够提高精子活力而不影响精子的活率。 实验表明， 浓度为0.5 g/mL4 g/mL的TSG对精子活力的提高作用十分显著 （p0.01） 。 附图说明 0034图1示TSG对精子活力的影响； 其中， *示P0.01； 其中， 示TSG浓度为0 g/mL处理 组； 示TSG浓度为0.5 g/mL处理组； 示TSG浓度为1 g/mL处理组； 示TSG浓度为4 g/mL处 理组； 0035 图2示不同浓度TSG处理种公猪精子2h后对其精子活力的影响； 0036 图3示TSG对精子活率的影响 （各组数值P0.05） ；

6、0037 图4流式细胞仪检测分析不同浓度TSG对精子内Ca2+水平的影响； 其中， 图4-a示空 白对照组， 图4-b示0.5 g/mL的TSG处理组， 图4-c示1 g/mL的TSG处理组， 图4-d示2 g/mL的 TSG处理组； 图4-e示4 g/mL的TSG处理组； 0038 图5示TSG对精子内Ca2+水平的影响； 其中， *示P0.01； 0039 图6示流式细胞仪检测分析不同浓度TSG对精子内ROS水平的影响； 其中， 图6-a示 空白对照组； 图6-b示0.5 g/ml的TSG处理组； 图6-c示1 g/ml的TSG处理组； 图6-d示2 g/ml 说 明 书 3/6 页 5

7、CN 105726550 B 5 的TSG处理组； 图6-e示4 g/ml的TSG处理组 0040 图7示TSG对精子ROS水平的影响； 其中， *示P0.01。 具体实施方式 0041 本发明提供了TSG的用途， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数 实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它 们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人 员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与 组合， 来实现和应用本发明技术。 0042 本发明采用的材料、 仪器皆为普通市

8、售品， 皆可于市场购得。 其中： 0043 精液取自吉林大学原种猪场杜洛克种公猪， 每次采精时间在都在早上， 采用了手 握法采精法。 杜洛克新鲜精液， 用Smeminark稀释液按1:1稀释， 将精液稀释到l106个/mL。 0044 猪精子稀释液 （seminark） 、 二苯乙烯苷 （TSG） 、 PBS、 4%多聚甲醛、 0.22%考马斯亮蓝 G-250、 invitrgen公司的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)、 NaCl、 KCl、 Na2HPO4、 KH2PO4以及NaH2PO4均购自Sigma公司； 0045 甲醇及冰醇酸均购自国产分析纯

9、； 0046 化丙啶 （PI） 、 碧云天JC-1检测试剂盒、 碧云天Fluo-3AM试剂盒、 碧云天活性氧检测 试剂盒 （Reactive Oxygen Species Assay Kit） 。 0047 可调式恒温水浴锅(DK-8D型， 上海一恒科技有限公司)； 0048 热恒温培养箱 （DHP-9272型， 上海一恒科学仪器有限公司） ； 0049 -20冰箱 （中国新飞公司） 、 4冰箱 （中国新飞公司） ； 0050 -80超低温冰箱 （日本SANYO公司） ； 0051 PB-10PH计 （Sartorius） 、 BS 124S 分析天平 （Sartorius） ； 0052 D

10、HP-9272涡旋混合器 （海门其林尔贝） ； 0053 普通显微镜、 4离心机 （TGL-16gR ） ； 0054 普通离心机 （德国Thermo公司） ； 0055 粘附载玻片 （南通海伦生物医学器械制造有限公司） ； 0056 高压蒸汽灭菌锅(长春百奥公司)； 0057 精子质量检测分析仪(型号GK-9900A， 徐州市广科新技术发展有限公司生产)。 0058 下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 0059 实施例1 TSG对猪精子活力的影响 0060 1） 将TSG用PBS溶解， 使TSG的储存浓度为1mg/ml， 然后保存在-20的冰箱里， 在使 用前将1 mg/ml的PBS用猪精

11、液稀释液稀释50倍后， 使用时的工作浓度为0.5 g/ml、 1 g/ml、 4 g/ml。 0061 2） 在不同时间0h、 0.5 h、 1 h、 2 h， 分别用0.5 g/ml、 1 g/ml、 4 g/ml处理子， 放在 37恒温箱孵育。 即分别取200 猪精液， 加入5 l、 10 l、 40 lTSG。 0062 3） 各取50 l的用TSG处理后的精子和空白对照滴于玻片上， 用精子质量检测分析 仪检测精子活力。 0063 4） 同一时间点同一浓度用精子质量分析仪重复测8次。 说 明 书 4/6 页 6 CN 105726550 B 6 0064 检测结果如表1、 图12： 00

12、65 表1 孵育2小时精子活力变化 0066 0h活力 （%）2h活力 （%）活力降低程度 （%） 0 g/mL763838 0.5 g/mL775817* 1 g/ml785820* 4 g/ml775225* 0067 *示与0 g/mL的对照相比存在显著差异， p0.05） ， 而2h 后， 经TSG处理的精液中精子的活力显著 （p0.01） 高于未经处理的精液中精子活力。 0069 实施例2 TSG对猪精子成活率的影响 0070 精子处理之后， 用invitrgen公司的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)， 之后用流式细胞仪检测猪精子活率。 00

13、71 将精子处理之后,在37恒温箱中孵育2h， 600g离心8分钟， 然后用200 l的猪精子 稀释液 （ （seminark） 悬浮。 0072 各加入0.2 l的PI(2.4Mm， propidium iodide)， 37孵育10分钟。 0073 孵育后用猪精液稀释液 （seminark） 离心洗涤两次。 0074 用流式细胞仪检测精子活率。（死精子被PI染色呈红色， 试验每个浓度重复五次， 每个样品至少检测10000个精子） 0075 检测结果如图3， 结果显示在提高精子活力的同时， TSG对精子的活率并不产生影 响。 0076 实施例3 TSG对精子内钙离子水平的检测 0077 实验

14、分为实验组和对照组， 实验组分为四组， 即在精液中加入TSG： 0.5ng/ml、 1 ng/ml、 2 ng/ml、 4 ng/ml， 对照组不加TSG。 另设置一空白对照， 不加Fluo-3AM染料。 每组实 验做5个重复。 0078 实验方法为： 0079 精子经过处理后， 用碧云天Fluo-3AM试剂盒， 并且用流式细胞仪检测精子内钙离 子水平。 0080 1)每组取200 l的猪精液， 加入相对应的不同浓度的TSG处理后， 放在37恒温箱 里， 孵育2h。 0081 2)按照1： 1000比例， 在精液中加入Fluo-3AM染料以后， 轻轻混匀后， 放在37恒温 箱里孵育30min。

15、 0082 )用猪精洗涤液洗涤两次， 然后37恒温箱， 孵育20min。 以确保Fluo-3AM在精子内 全部变成Fluo-3。 Fluo-3AM的荧光特别弱， 其荧光强度不会随着钙离子浓度升高而增强， 当 Fluo-3AM染料进入细胞后， 细胞内的剪酯酶可以把它剪切成 Fluo-3。 Fluo-3可以与钙离子 结合， 结合钙离子后会产生荧光， 每种处理重复五次， 每个样品至少检测 10000 个精子。 钙 离子水平可以用钙离子强度来表示。 0083 )用流式细胞仪快速检测TSG对精子钙离子水平的影响。 说 明 书 5/6 页 7 CN 105726550 B 7 0084 结果如图4-a图4

16、-e及图5所示， 结果显示： 相对于未经TSG处理的精液， 以TSG处理 精液2h后， 精子内Ca2+水平受到显著的抑制 （p0.05） 。 0085 实施例4 TSG对精子内活性氧水平的检测 0086 一： 实验设计及分组 0087 实验分为实验组和阳性对照组， 并设置空白对照组。 即在实验组设计四个不同浓 度的TSG:0.5 g/ml、 1 g/ml、 2 g/ml和4 g/ml， 每组重复五次； 阳性对照组中各加入Ros-up 0.5 g/ml、 1 g/ml、 2 g/ml和4 g/ml， 每个浓度重复一次； 空白对照组加入等量的猪精液稀 释液； 实验组、 阳性对照组和空白对照组均加入

17、DCFH-DA探针， 并设置一个不加入DCFH-DA探 针的空白组。 0088 二： 方法 0089 1） 先处理好精子 （用二苯乙烯苷TSG， 以不同浓度的TSG处理2h， 方法如之前所述） ， 37孵育2h。 0090 2） 加入DCFH-DA （按照1:1000比例） ， 放在37恒温箱里， 孵育30min。（每隔3-5min 颠倒轻轻混匀一下， 使得荧光探针DCFH-DA与细胞充分地接触） 。 0091 3） 用猪精液稀释液洗涤三次， 充分除去未进入细胞内的DCFH-DA)。 0092 4） 用猪精稀释液充分悬浮细胞后， 用流式细胞仪检测仪检测精子的活性氧产生情 况。 实验采用活性氧检

18、测试剂盒(Reactive Oxygen Assay Kit)， 这是一种利用带有荧光的 DCFH-DA探针进行活性氧检测的试剂盒。 DCFH-DA本身并没有荧光， 它可以自由地穿过细胞 膜， 当进入细胞内以后， 细胞内的酯酶可以将其水解生成DCFH。 酶水解之后形成的DCFH不能 通透细胞膜， 这样探针就使得探针很容易装载到细胞内。 细胞内的活性氧可以氧化无荧光 的DCFH生成有荧光的DCF。 这样通过检测DCF的荧光就可以知道细胞内的活性氧水平。 0093 结果如图6-a图6-e及图7， 相对于未经TSG处理的精液， 以TSG处理精液2h后， 精子 内ROS水平显著降低 （p0.05） 。 0094 以上仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 105726550 B 8 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 105726550 B 9 图4 图5 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 105726550 B 10 图6 图7 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 105726550 B 11