技术领域
本发明涉及决奈达隆或一种其药学上可接受的盐，其用于治疗利什曼病,特别是皮肤利什曼病及其世界各地的多种品系,和/或由亚马逊利什曼原虫(Leishmania amazonensis)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)或硕大利什曼原虫(Leishmania major)产生的利什曼病，还涉及包含决奈达隆或一种其药学上可接受的盐的配制物，特别是局部配制物，涉及他们的制备以及涉及它们的治疗性应用。
背景技术
2-n-丁基-3-[4-(3-二-n-丁基氨基丙氧基)苯甲酰]-5-甲磺酰胺苯并呋喃，或决奈达隆，及其药学上可接受的盐，特别是其盐酸盐，描述于欧洲专利EP 0 471 609 B1中。此外，决奈达隆显示可降低具有阵发性或持续性心房颤动(AF)病史的窦性心律患者由于心房颤动的住院风险，或其显示用于临床上稳定的具有阵发性或持续性心房颤动(AF)的成年病人在成功心脏复律之后的窦性心律的维持。
发明内容
令人惊讶的是，本申请人现已表明决奈达隆可用于治疗利什曼病。
尤其是，本申请人提出了用于局部施用的配制物，其适用于治疗利什曼病。
事实上，为了有效，这样的配制物应该允许活性成分渗透/释放至寄生物所在的皮肤层中。那么在真皮中局部地获得高浓度的活性药物并且避免所述药物的高血浆浓度以及相关的全身副作用是有可能的。这种配制物的一个额外特征是避免/降低皮肤接触所述配制物的毒性反应。
此外，决奈达隆与其他抗利什曼病作用剂的组合(association)是可能的，并且具有多种优势，如降低施用药物的剂量来避免副作用和避免对于已选治疗的抗性随着时间的显现。
因此，本发明涉及配制物特别是局部配制物，其包含决奈达隆或一种其药学上可接受的盐以及至少药学上可接受的赋形剂，涉及它们的制备并涉及它们的治疗应用如治疗利什曼病，特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。
本发明涉及尤其用于局部施用的药物组合物(局部药物组合物)，其包含决奈达隆或一种其药学上可接受的盐以及至少用于局部施用的药学上可接受的赋形剂，涉及它们的制备和治疗应用如治疗利什曼病，特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。
本发明还涉及决奈达隆或一种其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗利什曼病，特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。
本发明还涉及决奈达隆或一种其药学上可接受的盐用于治疗利什曼病，特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。
本发明的另一目的是决奈达隆或一种其药学上可接受的盐以及抗利什曼作用剂的组合(association)。所述组合用于利什曼病的治疗，特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。
在一个实施方案中，所述抗利什曼病作用剂选自下列作用剂：
-米替福新或一种其药学上可接受的衍生物，
-两性霉素B或一种其药学上可接受的衍生物，
-五价锑化合物衍生物如葡甲胺锑酸盐。
所述决奈达隆药学上可接受的盐是盐酸盐。
在一个实施方案中，所述利什曼病是由抗五价锑化合物衍生物的利什曼原虫株产生的，且特别是亚马逊利什曼原虫株，其抗五价锑化合物衍生物，特别是抗葡甲胺锑酸盐。
应当提到的是葡甲胺锑酸盐的配制物以商标商品化并广为人知。
所述局部配制物或药物组合物可以是水-醇凝胶、半固体亲水蜡状配方、水包油或油包水乳剂，特别是水-醇凝胶。
所述局部配制物或药物组合物可包含赋形剂，如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，特别是HPMC占配制物全部重量的2％。
在一个实施方案中，所述局部配制物或药物组合物可以是水-醇凝胶，其包含至少羟丙基甲基纤维素作为赋形剂。
所述局部配制物或药物组合物，其中决奈达隆或一种其药学上可接受的盐可以按碱形式的有效组分占10％重量的比例使用。
更高或更低剂量可能是适当的；这些剂量包括在本发明的范围之内。
应该提到的是术语配制物或组合物可被无差别地使用。
以下实施例描述了根据本发明的某些配制物的制备。这些实施例是非限制性的，其仅为阐释本发明。
附图说明
图1描述了方案时间表。
图2是描述决奈达隆治疗的小鼠中病变的生长的图。小鼠在第0天感染。用全部指明的决奈达隆配制物在第7天开始每日局部治疗且持续直至第37天，除6号和7号组，其由于毒性(皮肤刺激)在第32天暂停。病变大小在所示时间测量(n＝5)。
图3是描述决奈达隆治疗的小鼠中寄生物的载量的图。在感染的第39天，通过有限稀释法测定利用如图3所示配制物治疗的小鼠耳内的寄生物载量。平均值±SD(n＝5)。**p<0.005，***p<0.001。
实施例
实施例1
利用感染亚马逊利什曼原虫的BALB/c小鼠实验模型实施了针对皮肤利什曼病的检测。
配制物：
配制物采用本领域技术人员熟知的技术制备。
a)决奈达隆
配制物5、6和7详述如下：
配制物5(水-醇凝胶＝水凝胶) ％ 0.5M柠檬酸盐缓冲液pH 4.0 44 乙醇 44 HPMC 2 决奈达隆 10(碱当量)
配制物6(半固体亲水蜡状) ％ 月硅酰聚乙二醇甘油酯(Gelucire 44/14) 75 丙二醇 15 决奈达隆 10(碱当量)
*水由亲水赋形剂替代。因此，乳剂是由分散在亲水基质中的油滴构成的。
b)锑酸葡胺配制物对照：
●锑酸葡胺-PBS配制物8号：锑酸葡胺与无菌的PBS(20mg/ml)混合的可注射配制物，在4℃保存。
该制备物等同于商品其为经WHO鉴定作为第一个用于皮肤利什曼病的意向性治疗。
步骤
a)方案时间表
方案时间表参见图1。
b)感染
将8周龄的小鼠在轻微的醚麻醉下用10μl的106个前鞭毛体在右耳耳廓处感染。
c)病变的生长
感染和未感染的对侧耳厚度每3-4天利用游标卡尺进行测量，并将病变的大小以感染和未感染耳之间的厚度区别来表示。
d)利用病变内锑酸葡胺和局部决奈达隆的治疗
在感染的第7天,动物按照5只动物/鼠笼随机分开(1组动物对应每种决奈达隆或锑酸葡胺配制物)。另一感染组仅用于感染追踪。
i)局部治疗：将感染耳采用约20mg适当的局部决奈达隆配制物每日一次治疗30天。所述配制物采用一次性塑料刮刀尖部收集自其原始受体，并使用同一刮刀通过10秒按摩涂在感染耳廓内侧。
ii)病变内治疗：在感染耳内侧向感染耳皮下注射10μl含有200μg锑酸葡胺粉末的PBS，从感染的第7天至37天每周两次(8剂)：
e)皮肤致敏(MEST):
按照用于化学品检测的OECD指导原则所示，小鼠耳肿胀试验(MEST)能可靠检测中等至强力致敏剂。在感染的第34天将对侧未感染耳用相应的决奈达隆配制物处理(激发(challenge))。激发后对耳肿胀在不同时间进行测量(0小时、1小时、5小时、24小时、48小时和72小时)。
f)临床指征：
在感染的第0天以及之后以周为周期对动物称重。每日对动物病态指征(signs of morbidity)和死亡进行观察。记录这些常规检查中的异常临床指征。记录临床观察结果，包括死亡率、抽搐的监控、倦怠(lethargy)、睡眠、昏迷、流涎、腹泻、笼边检查、肤色、毛皮、眼睛和粘膜、自发和主动运动活动以及当动物死亡后的尸检。根据国际指导原则(WHO/OECD)，还记录经治疗的病变的任何不正常方面如小囊泡、彻底溃疡、生痂、暗沉。
g)照片
对感染耳(治疗和未治疗的)利用数码相机以每周为时间间隔进行拍照。
h)通过有限稀释法(LDA)检测寄生物载量
在感染的第39天，动物在麻醉后处死，并将感染耳用碘乙醇继以单独的乙醇进行无菌清理。将所述耳沿其基部切掉并无菌称重。其后将它们单独切碎成块，且在含有抗生素的PBS(1ml/耳)中利用不锈钢网(Sigma)制备单细胞悬液。将过筛的组织轻轻上下吸吹8次使细胞分离。将细胞悬液在补充了10％热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素抗生素、5ug/ml氯高铁血红素(hemine)和2％人尿的M199培养基中预稀释500x，随后在平底微孔板中一式三份系列稀释3倍(50μl+100μl)，共24份稀释。将微孔板在26℃加湿BOD培养箱中培育。每3-4天检查孔内前鞭毛体的存在直至第20天。每个感染耳内寄生物的数目根据组织质量(tissue mass)和理论上包含1个组织无鞭毛体的最终稀释来计算。
关于决奈达隆配制物有效性的结果：
决奈达隆：病变生长：5号配制物(水凝胶)在整个治疗过程中非常有效，接近8号参照治疗(病变内锑酸葡胺)(图2)。6号配制物(亲水蜡状半固体)和7号配制物(水包油乳剂)导致病变大小增长。这是由于皮肤刺激，而不是因为得到促进的寄生物生长(见图3)。此外，在第32天6号和7号的治疗暂停导致之后耳厚度的迅速减少。
决奈达隆：耳内的寄生物载量。在感染的第39天(治疗的第30天)，耳内的寄生物载量在用5号(水凝胶)局部治疗的组中显著较低。配制物6号(亲水蜡状半固体)和7号(水包油乳剂)没有改变寄生物载量(图3)：
结论
配制物5在整个感染中最有希望控制病变生长，在实验结束时的低寄生物载量与受控的病变生长相容，其与8剂200ug病变内锑酸葡胺取得的效果相似。动物在整个治疗过程中看起来良好，体重增加正常且在激发时没有造成皮肤敏感性。
实施例2
在相似实验条件下，与葡甲胺锑酸盐、米替福新和两性霉素B的参照治疗相比，决 奈达隆对于亚马逊利什曼虫株有效性的体外研究。
使用了亚马逊利什曼虫株(MHOM/BR/73/M2269)。盐酸决奈达隆和葡甲胺锑酸盐由Sanofi提供。两性霉素B(脱氧胆酸盐)和米替福新购自Sigma-Aldrich。
本研究涉及两个细胞模型：
-1/无污染的(axenic)亚马逊利什曼虫无鞭毛体(分离的寄生虫)
-2/巨噬细胞内的亚马逊利什曼虫无鞭毛体(寄生虫寄宿在巨噬细胞中，
在皮肤利什曼病感染期间发现于真皮中)。
培养在基于M199的培养基中的第一种细胞模型能够明确物质作用于寄生物本身的固有活性，同时第二种细胞模型整合能穿过巨噬细胞膜以及吞噬溶酶体膜的物质的能力(capacity)。所用巨噬细胞是RAW 264.7细胞，其培养在基于具有10％胎牛血清的DMEM的培养基中。
●每种分子IC50的测定
每次实验前制备溶解在DMSO中的决奈达隆、溶解在水中的葡甲胺锑酸盐和米替福新以及溶解在等渗葡萄糖溶液中两性霉素B溶液。体外评估是一式两份的三个独立实验的目的。实验通过如Audisio等人描述的(Eur.J.Med.Chem.,52:44-50,2012)利用SYBRGREEN来定量寄生物DNA以及对于巨噬细胞内无鞭毛体通过qPCR扩增所述寄生物的α-微管蛋白来实现。用两种方法所得结果相似。
与决奈达隆接触72小时后对寄生物生长的50％抑制浓度(IC50)进行测定，与作为参照产品使用的葡甲胺锑酸盐、米替福新和两性霉素B进行比较。
对于无污染的无鞭毛体(检测条件1)，决奈达隆的IC50为0.34±0.06μM，同时葡甲胺锑酸盐的IC50为908±159μM，米替福新的IC50为0.9±0.2μM且两性霉素B的IC50为0.031±0.002μM。
对于巨噬细胞内的无鞭毛体(检测条件2)，决奈达隆的IC50为0.50±0.22μM，同时葡甲胺锑酸盐的IC50为133.63±10.41μM，米替福新的IC50为1.87±0.032μM且两性霉素B的IC50为0.047±0.005μM。
●与参照药物相比决奈达隆对于人宿主细胞(巨噬细胞)的潜在毒性的评估。
对于巨噬细胞(细胞RAW 264.7)的细胞毒性的研究
无毒的最大浓度(CMA)根据Audisio等人描述的已有方法(Eur.J.Med.Chem.,52:44-50,2012)通过台盼蓝技术测定。
决奈达隆的CMA是12.5μM。
葡甲胺锑酸盐的CMA是＞200μM。
两性霉素B的CMA是6.25μM。
米替福新的CMA是50μM。
因此，决奈达隆对于真皮巨噬细胞的毒性低于多数参照药物，且不会妨碍其对于皮肤利什曼病的治疗用途。
●决奈达隆与葡甲胺锑酸盐、米替福新和两性霉素B的组合的研究
根据Odds等人描述的方法(J.Antimicrob.Chemother.,52:1,2003)，对决奈达隆与每个参照产品的组合进行了研究来确定其协同、相加或拮抗作用。本研究包含三个独立实验，其允许对分级抑制浓度指数(FICI)进行了计算：
-如果FICI<0.5：协同
-如果0.5<FICI<4：相加效应，无相互作用
-如果FICI<4：拮抗
-决奈达隆和葡甲胺锑酸盐之间的相互作用：
对于无污染的无鞭毛体，FICI＝0.27。获得了决奈达隆和葡甲胺锑酸盐之间的协同效应。
对于巨噬细胞内的无鞭毛体，FICI＝0.79。获得了决奈达隆和葡甲胺锑酸盐之间的相加效应。
-决奈达隆和米替福新之间的相互作用：
对于无污染的无鞭毛体，FICI＝0.39。获得了决奈达隆和米替福新之间的协同效应。
对于巨噬细胞内的无鞭毛体，FICI＝0.46。获得了决奈达隆和米替福新之间的协同效应。
-决奈达隆和两性霉素B之间的相互作用：
对于无污染的无鞭毛体，FICI＝0.63。获得了决奈达隆和米替福新之间的相加效应。
对于巨噬细胞内的无鞭毛体，FICI＝0.54。获得了决奈达隆和米替福新之间的相加效应。
结论
A/与参照药物相比，决奈达隆对于寄生物的活性：
决奈达隆在体外对亚马逊利什曼虫无污染的无鞭毛体和巨噬细胞内的无鞭毛体两种模型均展示出强抗利什曼病活性,具有在微摩范围内的较低IC50，这使其在活性方面介于两性霉素B和米替福新之间。当其被保护在巨噬细胞的巨噬溶酶体中时，作用于寄生物本身的固有活性由此得到保持。
B/与其他参照药物组合时决奈达隆对于寄生物的活性：
决奈达隆与葡甲胺锑酸盐或与两性霉素B的相互作用是相加类型。无拮抗效应得到证明，其提示决奈达隆和葡甲胺锑酸盐或两性霉素B的联合使用具备可能性。
决奈达隆与米替福新的相互作用是协同类型，其提示决奈达隆与米替福新的联合使用可能值得关注，例如用于降低施用剂量。
实施利3
亚马逊利什曼虫株抗葡甲胺锑酸盐 的体外研究
对处于无鞭毛体形态下的抗葡甲胺锑酸盐(IC50＝200mM)的亚马逊利什曼虫株，其对决奈达隆的化学敏感性与实验者在不抗葡甲胺锑酸盐(的活性成分)的虫株上观察到的相似。
这意味着决奈达隆对寄生物的作用机制与葡甲胺锑盐的不同。决奈达隆具有治疗锑酸葡胺抗性虫株(如在拉丁美洲找到的虫株)的潜力。
实施例4
利用亚马逊利什曼虫株对其随时间发展决奈达隆抗性的体外研究
检测包括对亚马逊利什曼虫株的长期培养(无鞭毛体形态)，将其与逐渐升高的决奈达隆剂量接触，起始于低于IC50的初始浓度。
在有规律的时间点，寄生物的生存力和致病性通过使培养物形成(move to)无污染的无鞭毛体和巨噬细胞内的无鞭毛体并且计算新的对于50％种群抑制的浓度(IC50)来确认。
将寄生物培养并暴露于决奈达隆6个月后，未观察到抑制浓度(IC50)的显著改变。
作为参照：将所述虫株类似地暴露于锑酸葡胺导致IC50增长x200。
尽管所述研究将持续一段时间，已经可以声明所述分子没有在暴露的寄生虫中产生抗性。
实施例5
对杜氏利什曼原虫和硕大利什曼原虫的体外研究
为评估决奈达隆作为对多种遍布全球的、已知对所述参照药物具有不同敏感性的利什曼虫株的治疗的多价性，利用被认为代表不同地方病区域的虫株完成了前述检测。
将杜氏利什曼原虫(MHOM/ET/67/HU3)和硕大利什曼原虫(MHOM/SU/73/5-ASKH)的虫株用于本研究。
盐酸决奈达隆和葡甲胺锑酸盐由Sanofi提供。米替福新购自Sigma-Aldrich。
本体外研究是涉及四种细胞模型：
-1/杜氏利什曼原虫和硕大利什曼原虫的无污染无鞭毛体(分离的寄生物)
-2/杜氏利什曼原虫和硕大利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体(寄生物寄生于巨噬细胞中，在皮肤利什曼病感染期间发现于真皮中)。
将无污染的无鞭毛体模型培养在基于M199的培养基中，并且该模型能够明确物质作用于寄生物本身的固有活性，同时巨噬细胞内无鞭毛体的模型整合穿过巨噬细胞膜和吞噬溶酶体膜的物质的能力。
所用巨噬细胞是RAW 264.7细胞，其培养在基于具有10％胎牛血清的DMEM的培养基中。
决奈达隆、和米替福新IC50的确定：
每次实验前制备溶解在DMSO中的决奈达隆、溶解在水中的葡甲胺锑酸盐和米替福新溶液。体外评估是三次独立实验的目的。
实验通过如Audisio等人描述的(Eur.J.Med.Chem.,52:44-50,2012)利用SYBRGREEN定量寄生物DNA来实现。
与决奈达隆接触72小时后测定寄生物生长的50％抑制浓度(IC50)，与作为对照产品使用的葡甲胺锑酸盐和米替福新进行比较。
-对于杜氏利什曼原虫的无污染无鞭毛体，决奈达隆的IC50为47.38±6.27μM，同时葡甲胺锑酸盐的IC50＞1000μM，且米替福新的IC50为13.0±1.25μM。
-对于硕大利什曼原虫的无污染无鞭毛体，决奈达隆的IC50为2.55±0.51μM，同时葡甲胺锑酸盐的IC50＞1000μM，且米替福新的IC50为5.57±1.50μM。
-对于杜氏利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体，决奈达隆的IC50为1.67±0.10μM，同时葡甲胺锑的IC50为390.36±40.46μM，且米替福新的IC50为0.88±0.10μM。
-对于硕大利什曼原虫巨噬细胞内的无鞭毛体，决奈达隆的IC50为1.32±0.12μM，同时葡甲胺锑的IC50为347.98±79.87μM，且米替福新的IC50为0.72±0.11μM。
此外，直至12.5μM的浓度决奈达隆并没有表现出对于巨噬细胞的毒性。其50％细胞毒性浓度(CC50)因此高于12.5。
结论
1-决奈达隆对于杜氏利什曼原虫(作为印度/非洲的模型虫株)的体外活性。
决奈达隆表现出与米替福新相似的对于杜氏利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体的强活性，大约为1-2μM数量级，同时其对于无污染的无鞭毛体作用微弱。定义为对于杜氏利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体的CC50/IC50的决奈达隆的治疗指标因此高于7。
2-决奈达隆对于硕大利什曼原虫(作为中东的模型虫株)的体外活性。
决奈达隆表现出在体外对于硕大利什曼原虫的无污染无鞭毛体和巨噬细胞内无鞭毛体的模型的强活性，其IC50低于3μM，该活性水平与米替福新相似。如此对寄生物本身的固有活性在其被保护于巨噬细胞中的巨噬溶酶体内时得到保持。定义为对于硕大利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体的CC50/IC50的决奈达隆的治疗指标因此高于9。
这些结果倾向于证明决奈达隆在与米替福新相似且明显低于锑酸葡胺的浓度，能够带来针对多种虫株的治疗效果(检测了来自全球的3种模型)。