用于利什曼病的决奈达隆、用于利什曼病的配制剂和组合.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201380038586.4 (22)申请日 2013.05.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104487068 A (43)申请公布日 2015.04.01 (30)优先权数据 12306362.0 2012.10.31 EP 12306472.7 2012.11.28 EP 61/650,182 2012.05.22 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.01.20 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2013/060513 2

2、013.05.22 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/182423 EN 2013.12.12 (73)专利权人 赛诺菲 地址 法国巴黎 (72)发明人 S贝尔斯 S尚博内 J-P科拉维里 (74)专利代理机构 北京坤瑞律师事务所 11494 代理人 史悦 (51)Int.Cl. A61K 31/343(2006.01) A61P 33/02(2006.01) (56)对比文件 CN 102065857 A,2011.05.18, WO 02051383 A2,2002.07.04, BENAIM GUSTAVO ET AL.In Vitro Anti- Trypanosoma

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4、30. A. E. PANIZ-MONDOLFI.CONCURRENT CHAGAS DISEASE AND BORDERLINE DISSEMINATED CUTANEOUS LEISHMANIAS THE ROLE OF AMIODARONE AS AN ANTITRYPANOSOMATIDAE DRUG. THERAPEUTICS AND CLINICAL RISK MANAGEMENT .2008,第4卷 (第3期),659-663. SERRANO-MARTIN XENON ET AL.Amiodarone and miltefosine act synergistically ag

5、ainst Leishmania mexicana and can induce parasitological cure in a murine model of cutaneous leishmaniasis. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY .2009,第53卷(第12期),5108-5113. 审查员 卞志家 (54)发明名称 用于利什曼病的决奈达隆、 用于利什曼病的 配制剂和组合 (57)摘要 本发明涉及用于治疗利什曼病的决奈达隆 或一种其药物上可接受的盐、 用于治疗利什曼病 的包含决奈达隆或一种其药物上可接受的盐的 配制物和组合。 权利要

6、求书1页 说明书8页 附图2页 CN 104487068 B 2018.09.11 CN 104487068 B 1.包含决奈达隆或一种其药学上可接受的盐的用于局部施用的配制物在制备用于利 什曼病的治疗的药物中的用途， 其中所述配制物是水-醇凝胶。 2.根据权利要求1的配制物的用途， 其中所述药学上可接受的盐是盐酸决奈达隆。 3.根据权利要求1的配制物的用途， 其中所述配制物至少包含药学上可接受的赋形剂。 4.根据权利要求2的配制物的用途， 其中所述配制物至少包含药学上可接受的赋形剂。 5.根据权利要求3的配制物的用途， 其中所述药学上可接受的赋形剂是羟丙基甲基纤 维素。 6.根据权利要求4的

7、配制物的用途， 其中所述药学上可接受的赋形剂是羟丙基甲基纤 维素。 7.根据权利要求1至6中任一项的配制物的用途， 其用于皮肤利什曼病的治疗。 8.根据权利要求1至6中任一项的配制物的用途， 其用于由亚马逊利什曼原虫 (Leishmania amazonensis)株产生的利什曼病的治疗。 9.根据权利要求8的配制物的用途， 其用于由抗五价锑化合物衍生物的亚马逊利什曼 原虫(Leishmania amazonensis)株产生的利什曼病的治疗。 10.根据权利要求9的配制物的用途， 其中所述五价锑化合物衍生物是葡甲胺锑酸盐。 11.根据权利要求1至6中任一项的配制物的 用途 ， 其用于由杜氏

8、利什曼原虫 (Leishmania donovani)株产生的利什曼病的治疗。 12.根据权利要求1至6中任一项的配制物的 用途 ， 其用于由硕大利什曼原虫 (Leishmania major)株产生的利什曼病的治疗。 13.根据权利要求1至6中任一项的配制物的用途， 其中决奈达隆或一种其药物上可接 受的盐可以按碱形式的有效组分占10重量的比例使用。 14.决奈达隆或一种其在药物上可接受的盐和抗利什曼病作用剂的组合产品， 其中所 述决奈达隆或一种其在药物上可接受的盐配制成水-醇凝胶， 且其中所述抗利什曼病作用 剂选自下列作用剂： -米替福新， -两性霉素， -五价锑化合物衍生物如葡甲胺锑酸盐。

9、 15.根据权利要求14的组合产品， 其中所述五价锑化合物衍生物是葡甲胺锑酸盐。 16.根据权利要求14或15的组合产品(association)在制备用于利什曼病的治疗的药 物中的用途。 17.根据权利要求16的组合产品的用途， 其用于皮肤利什曼病的治疗。 18.根据权利要求16的组合产品的用途， 其用于由亚马逊利什曼原虫(Leishmania amazonensis)株产生的利什曼病的治疗。 19.根据权利要求18的组合产品的用途， 其用于由抗五价锑化合物衍生物的亚马逊利 什曼原虫(Leishmania amazonensis)株产生的利什曼病的治疗。 20.根据权利要求16的组合产品的用

10、途， 其用于由杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)株产生的利什曼病的治疗。 21.根据权利要求16的组合产品的用途， 其用于由硕大利什曼原虫(Leishmania major)株产生的利什曼病的治疗。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104487068 B 2 用于利什曼病的决奈达隆、 用于利什曼病的配制剂和组合 技术领域 0001 本发明涉及决奈达隆或一种其药学上可接受的盐， 其用于治疗利什曼病,特别是 皮肤利什曼病及其世界各地的多种品系 ,和/或由亚马逊利什曼原虫(Leishmania amazonensis)、 杜氏利什曼原虫(Leishmania dono

11、vani)或硕大利什曼原虫(Leishmania major)产生的利什曼病， 还涉及包含决奈达隆或一种其药学上可接受的盐的配制物， 特别 是局部配制物， 涉及他们的制备以及涉及它们的治疗性应用。 背景技术 0002 2-n-丁基-3-4-(3-二-n-丁基氨基丙氧基)苯甲酰-5-甲磺酰胺苯并呋喃， 或决 奈达隆， 及其药学上可接受的盐， 特别是其盐酸盐， 描述于欧洲专利EP 0 471 609 B1中。 此 外， 决奈达隆显示可降低具有阵发性或持续性心房颤动(AF)病史的窦性心律患者由于心房 颤动的住院风险， 或其显示用于临床上稳定的具有阵发性或持续性心房颤动(AF)的成年病 人在成功心脏复

12、律之后的窦性心律的维持。 发明内容 0003 令人惊讶的是， 本申请人现已表明决奈达隆可用于治疗利什曼病。 0004 尤其是， 本申请人提出了用于局部施用的配制物， 其适用于治疗利什曼病。 0005 事实上， 为了有效， 这样的配制物应该允许活性成分渗透/释放至寄生物所在的皮 肤层中。 那么在真皮中局部地获得高浓度的活性药物并且避免所述药物的高血浆浓度以及 相关的全身副作用是有可能的。 这种配制物的一个额外特征是避免/降低皮肤接触所述配 制物的毒性反应。 0006 此外， 决奈达隆与其他抗利什曼病作用剂的组合(association)是可能的， 并且具 有多种优势， 如降低施用药物的剂量来避免

13、副作用和避免对于已选治疗的抗性随着时间的 显现。 0007 因此， 本发明涉及配制物特别是局部配制物， 其包含决奈达隆或一种其药学上可 接受的盐以及至少药学上可接受的赋形剂， 涉及它们的制备并涉及它们的治疗应用如治疗 利什曼病， 特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、 杜氏利什曼原虫株或硕大利 什曼原虫株产生的利什曼病。 0008 本发明涉及尤其用于局部施用的药物组合物(局部药物组合物)， 其包含决奈达隆 或一种其药学上可接受的盐以及至少用于局部施用的药学上可接受的赋形剂， 涉及它们的 制备和治疗应用如治疗利什曼病， 特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、 杜氏 利什曼原虫株或

14、硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。 0009 本发明还涉及决奈达隆或一种其药学上可接受的盐用于制备药物的用途， 所述药 物用于治疗利什曼病， 特别是皮肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、 杜氏利什曼原虫 株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。 0010 本发明还涉及决奈达隆或一种其药学上可接受的盐用于治疗利什曼病， 特别是皮 说 明 书 1/8 页 3 CN 104487068 B 3 肤利什曼病和/或由亚马逊利什曼原虫株、 杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的 利什曼病。 0011 本发明的另一目的是决奈达隆或一种其药学上可接受的盐以及抗利什曼作用剂 的组合(association)。 所

15、述组合用于利什曼病的治疗， 特别是皮肤利什曼病和/或由亚马 逊利什曼原虫株、 杜氏利什曼原虫株或硕大利什曼原虫株产生的利什曼病。 0012 在一个实施方案中， 所述抗利什曼病作用剂选自下列作用剂： 0013 -米替福新或一种其药学上可接受的衍生物， 0014 -两性霉素B或一种其药学上可接受的衍生物， 0015 -五价锑化合物衍生物如葡甲胺锑酸盐。 0016 所述决奈达隆药学上可接受的盐是盐酸盐。 0017 在一个实施方案中， 所述利什曼病是由抗五价锑化合物衍生物的利什曼原虫株产 生的， 且特别是亚马逊利什曼原虫株， 其抗五价锑化合物衍生物， 特别是抗葡甲胺锑酸盐。 0018应当提到的是葡甲胺

16、锑酸盐的配制物以商标商品化 并广为人知。 0019 所述局部配制物或药物组合物可以是水-醇凝胶、 半固体亲水蜡状配方、 水包油或 油包水乳剂， 特别是水-醇凝胶。 0020 所述局部配制物或药物组合物可包含赋形剂， 如羟丙基甲基纤维素(HPMC)， 特别 是HPMC占配制物全部重量的2。 0021 在一个实施方案中， 所述局部配制物或药物组合物可以是水-醇凝胶， 其包含至少 羟丙基甲基纤维素作为赋形剂。 0022 所述局部配制物或药物组合物， 其中决奈达隆或一种其药学上可接受的盐可以按 碱形式的有效组分占10重量的比例使用。 0023 更高或更低剂量可能是适当的； 这些剂量包括在本发明的范围之

17、内。 0024 应该提到的是术语配制物或组合物可被无差别地使用。 0025 以下实施例描述了根据本发明的某些配制物的制备。 这些实施例是非限制性的， 其仅为阐释本发明。 附图说明 0026 图1描述了方案时间表。 0027 图2是描述决奈达隆治疗的小鼠中病变的生长的图。 小鼠在第0天感染。 用全部指 明的决奈达隆配制物在第7天开始每日局部治疗且持续直至第37天， 除6号和7号组， 其由于 毒性(皮肤刺激)在第32天暂停。 病变大小在所示时间测量(n5)。 0028 图3是描述决奈达隆治疗的小鼠中寄生物的载量的图。 在感染的第39天， 通过有限 稀释法测定利用如图3所示配制物治疗的小鼠耳内的寄生

18、物载量。 平均值SD(n5)。 *p 0.005， *p0.001。 实施例 0029 实施例1 0030 利用感染亚马逊利什曼原虫的BALB/c小鼠实验模型实施了针对皮肤利什曼病的 说 明 书 2/8 页 4 CN 104487068 B 4 检测。 0031 配制物： 0032 配制物采用本领域技术人员熟知的技术制备。 0033 a)决奈达隆 0034 0035 0036 配制物5、 6和7详述如下： 0037 配制物5(水-醇凝胶水凝胶) 0.5M柠檬酸盐缓冲液pH 4.044 乙醇44 HPMC2 决奈达隆10(碱当量) 0038 配制物6(半固体亲水蜡状) 月硅酰聚乙二醇甘油酯(Ge

19、lucire 44/14)75 丙二醇15 决奈达隆10(碱当量) 0039 0040 *水由亲水赋形剂替代。 因此， 乳剂是由分散在亲水基质中的油滴构成的。 0041 b)锑酸葡胺配制物对照： 0042 锑酸葡胺-PBS配制物8号： 锑酸葡胺与无菌的PBS(20mg/ml)混合的可注射配制 物， 在4保存。 0043该制备物等同于商品其为经WHO鉴定作为第一个用于皮肤利什曼病 的意向性治疗。 0044 步骤 说 明 书 3/8 页 5 CN 104487068 B 5 0045 a)方案时间表 0046 方案时间表参见图1。 0047 b)感染 0048 将8周龄的小鼠在轻微的醚麻醉下用10

20、 l的106个前鞭毛体在右耳耳廓处感染。 0049 c)病变的生长 0050 感染和未感染的对侧耳厚度每3-4天利用游标卡尺进行测量， 并将病变的大小以 感染和未感染耳之间的厚度区别来表示。 0051 d)利用病变内锑酸葡胺和局部决奈达隆的治疗 0052 在感染的第7天,动物按照5只动物/鼠笼随机分开(1组动物对应每种决奈达隆或 锑酸葡胺配制物)。 另一感染组仅用于感染追踪。 0053 i)局部治疗： 将感染耳采用约20mg适当的局部决奈达隆配制物每日一次治疗30 天。 所述配制物采用一次性塑料刮刀尖部收集自其原始受体， 并使用同一刮刀通过10秒按 摩涂在感染耳廓内侧。 0054 ii)病变内

21、治疗： 在感染耳内侧向感染耳皮下注射10 l含有200 g锑酸葡胺粉末的 PBS， 从感染的第7天至37天每周两次(8剂)： 0055 e)皮肤致敏(MEST): 0056 按照用于化学品检测的OECD指导原则所示， 小鼠耳肿胀试验(MEST)能可靠检测中 等至强力致敏剂。 在感染的第34天将对侧未感染耳用相应的决奈达隆配制物处理(激发 (challenge)。 激发后对耳肿胀在不同时间进行测量(0小时、 1小时、 5小时、 24小时、 48小时 和72小时)。 0057 f)临床指征： 0058 在感染的第0天以及之后以周为周期对动物称重。 每日对动物病态指征(signs of morbid

22、ity)和死亡进行观察。 记录这些常规检查中的异常临床指征。 记录临床观察结果， 包 括死亡率、 抽搐的监控、 倦怠(lethargy)、 睡眠、 昏迷、 流涎、 腹泻、 笼边检查、 肤色、 毛皮、 眼 睛和粘膜、 自发和主动运动活动以及当动物死亡后的尸检。 根据国际指导原则(WHO/OECD)， 还记录经治疗的病变的任何不正常方面如小囊泡、 彻底溃疡、 生痂、 暗沉。 0059 g)照片 0060 对感染耳(治疗和未治疗的)利用数码相机以每周为时间间隔进行拍照。 0061 h)通过有限稀释法(LDA)检测寄生物载量 0062 在感染的第39天， 动物在麻醉后处死， 并将感染耳用碘乙醇继以单独

23、的乙醇进行 无菌清理。 将所述耳沿其基部切掉并无菌称重。 其后将它们单独切碎成块， 且在含有抗生素 的PBS(1ml/耳)中利用不锈钢网(Sigma)制备单细胞悬液。 将过筛的组织轻轻上下吸吹8次 使细胞分离。 将细胞悬液在补充了10热灭活胎牛血清、 100U/ml青霉素/100 g/ml链霉素 抗生素、 5ug/ml氯高铁血红素(hemine)和2人尿的M199培养基中预稀释500x， 随后在平底 微孔板中一式三份系列稀释3倍(50 l+100 l)， 共24份稀释。 将微孔板在26加湿BOD培养 箱中培育。 每3-4天检查孔内前鞭毛体的存在直至第20天。 每个感染耳内寄生物的数目根据 组织

24、质量(tissue mass)和理论上包含1个组织无鞭毛体的最终稀释来计算。 0063 关于决奈达隆配制物有效性的结果： 0064 决奈达隆： 病变生长： 5号配制物(水凝胶)在整个治疗过程中非常有效， 接近8号参 说 明 书 4/8 页 6 CN 104487068 B 6 照治疗(病变内锑酸葡胺)(图2)。 6号配制物(亲水蜡状半固体)和7号配制物(水包油乳剂) 导致病变大小增长。 这是由于皮肤刺激， 而不是因为得到促进的寄生物生长(见图3)。 此外， 在第32天6号和7号的治疗暂停导致之后耳厚度的迅速减少。 0065 决奈达隆： 耳内的寄生物载量。 在感染的第39天(治疗的第30天)，

25、耳内的寄生物载 量在用5号(水凝胶)局部治疗的组中显著较低。 配制物6号(亲水蜡状半固体)和7号(水包油 乳剂)没有改变寄生物载量(图3)： 0066 结论 0067 配制物5在整个感染中最有希望控制病变生长， 在实验结束时的低寄生物载量与 受控的病变生长相容， 其与8剂200ug病变内锑酸葡胺取得的效果相似。 动物在整个治疗过 程中看起来良好， 体重增加正常且在激发时没有造成皮肤敏感性。 0068 实施例2 0069 在相似实验条件下， 与葡甲胺锑酸盐、 米替福新和两性霉素B的参照治疗相比， 决 奈达隆对于亚马逊利什曼虫株有效性的体外研究。 0070 使用了亚马逊利什曼虫株(MHOM/BR/

26、73/M2269)。 盐酸决奈达隆和葡甲胺锑酸盐由 Sanofi提供。 两性霉素B(脱氧胆酸盐)和米替福新购自Sigma-Aldrich。 0071 本研究涉及两个细胞模型： 0072 -1/无污染的(axenic)亚马逊利什曼虫无鞭毛体(分离的寄生虫) 0073 -2/巨噬细胞内的亚马逊利什曼虫无鞭毛体(寄生虫寄宿在巨噬细胞中， 0074 在皮肤利什曼病感染期间发现于真皮中)。 0075 培养在基于M199的培养基中的第一种细胞模型能够明确物质作用于寄生物本身 的固有活性， 同时第二种细胞模型整合能穿过巨噬细胞膜以及吞噬溶酶体膜的物质的能力 (capacity)。 所用巨噬细胞是RAW 26

27、4.7细胞， 其培养在基于具有10胎牛血清的DMEM的培 养基中。 0076 每种分子IC50的测定 0077 每次实验前制备溶解在DMSO中的决奈达隆、 溶解在水中的葡甲胺锑酸盐和米替福 新以及溶解在等渗葡萄糖溶液中两性霉素B溶液。 体外评估是一式两份的三个独立实验的 目的。 实验通过如Audisio等人描述的(Eur.J.Med.Chem.,52:44-50,2012)利用SYBRGREEN 来定量寄生物DNA以及对于巨噬细胞内无鞭毛体通过qPCR扩增所述寄生物的 -微管蛋白来 实现。 用两种方法所得结果相似。 0078 与决奈达隆接触72小时后对寄生物生长的50抑制浓度(IC50)进行测

28、定， 与作为 参照产品使用的葡甲胺锑酸盐、 米替福新和两性霉素B进行比较。 0079 对于无污染的无鞭毛体(检测条件1)， 决奈达隆的IC50为0.340.06 M， 同时葡甲 胺锑酸盐的IC50为908159 M， 米替福新的IC50为0.90.2 M且两性霉素B的IC50为0.031 0.002 M。 0080 对于巨噬细胞内的无鞭毛体(检测条件2)， 决奈达隆的IC50为0.500.22 M， 同时 葡甲胺锑酸盐的IC50为133.6310.41 M， 米替福新的IC50为1.870.032 M且两性霉素B 的IC50为0.0470.005 M。 0081 与参照药物相比决奈达隆对于人宿

29、主细胞(巨噬细胞)的潜在毒性的评估。 0082 对于巨噬细胞(细胞RAW 264.7)的细胞毒性的研究 说 明 书 5/8 页 7 CN 104487068 B 7 0083 无毒的最大浓度(CMA)根据Audisio等人描述的已有方法(Eur.J.Med.Chem.,52: 44-50,2012)通过台盼蓝技术测定。 0084 决奈达隆的CMA是12.5 M。 0085 葡甲胺锑酸盐的CMA是200 M。 0086 两性霉素B的CMA是6.25 M。 0087 米替福新的CMA是50 M。 0088 因此， 决奈达隆对于真皮巨噬细胞的毒性低于多数参照药物， 且不会妨碍其对于 皮肤利什曼病的治

30、疗用途。 0089 决奈达隆与葡甲胺锑酸盐、 米替福新和两性霉素B的组合的研究 0090 根据Odds等人描述的方法(J.Antimicrob.Chemother.,52:1,2003)， 对决奈达隆 与每个参照产品的组合进行了研究来确定其协同、 相加或拮抗作用。 本研究包含三个独立 实验， 其允许对分级抑制浓度指数(FICI)进行了计算： 0091 -如果FICI0.5： 协同 0092 -如果0.5FICI4： 相加效应， 无相互作用 0093 -如果FICI4： 拮抗 0094 -决奈达隆和葡甲胺锑酸盐之间的相互作用： 0095 对于无污染的无鞭毛体， FICI0.27。 获得了决奈达隆

31、和葡甲胺锑酸盐之间的协 同效应。 0096 对于巨噬细胞内的无鞭毛体， FICI0.79。 获得了决奈达隆和葡甲胺锑酸盐之间 的相加效应。 0097 -决奈达隆和米替福新之间的相互作用： 0098 对于无污染的无鞭毛体， FICI0.39。 获得了决奈达隆和米替福新之间的协同效 应。 0099 对于巨噬细胞内的无鞭毛体， FICI0.46。 获得了决奈达隆和米替福新之间的协 同效应。 0100 -决奈达隆和两性霉素B之间的相互作用： 0101 对于无污染的无鞭毛体， FICI0.63。 获得了决奈达隆和米替福新之间的相加效 应。 0102 对于巨噬细胞内的无鞭毛体， FICI0.54。 获得了

32、决奈达隆和米替福新之间的相 加效应。 0103 结论 0104 A/与参照药物相比， 决奈达隆对于寄生物的活性： 0105 决奈达隆在体外对亚马逊利什曼虫无污染的无鞭毛体和巨噬细胞内的无鞭毛体 两种模型均展示出强抗利什曼病活性,具有在微摩范围内的较低IC50， 这使其在活性方面 介于两性霉素B和米替福新之间。 当其被保护在巨噬细胞的巨噬溶酶体中时， 作用于寄生物 本身的固有活性由此得到保持。 0106 B/与其他参照药物组合时决奈达隆对于寄生物的活性： 0107 决奈达隆与葡甲胺锑酸盐或与两性霉素B的相互作用是相加类型。 无拮抗效应得 到证明， 其提示决奈达隆和葡甲胺锑酸盐或两性霉素B的联合使

33、用具备可能性。 说 明 书 6/8 页 8 CN 104487068 B 8 0108 决奈达隆与米替福新的相互作用是协同类型， 其提示决奈达隆与米替福新的联合 使用可能值得关注， 例如用于降低施用剂量。 0109 实施利3 0110亚马逊利什曼虫株抗葡甲胺锑酸盐的体外研究 0111 对处于无鞭毛体形态下的抗葡甲胺锑酸盐(IC50200mM)的亚马逊利什曼虫株， 其对决奈达隆的化学敏感性与实验者在不抗葡甲胺锑酸盐(的活性成分)的虫 株上观察到的相似。 0112 这意味着决奈达隆对寄生物的作用机制与葡甲胺锑盐的不同。 决奈达隆具有治疗 锑酸葡胺抗性虫株(如在拉丁美洲找到的虫株)的潜力。 0113

34、 实施例4 0114 利用亚马逊利什曼虫株对其随时间发展决奈达隆抗性的体外研究 0115 检测包括对亚马逊利什曼虫株的长期培养(无鞭毛体形态)， 将其与逐渐升高的决 奈达隆剂量接触， 起始于低于IC50的初始浓度。 0116 在有规律的时间点， 寄生物的生存力和致病性通过使培养物形成(move to)无污 染的无鞭毛体和巨噬细胞内的无鞭毛体并且计算新的对于50种群抑制的浓度(IC50)来 确认。 0117 将寄生物培养并暴露于决奈达隆6个月后， 未观察到抑制浓度(IC50)的显著改变。 0118 作为参照： 将所述虫株类似地暴露于锑酸葡胺导致IC50增长x200。 0119 尽管所述研究将持续

35、一段时间， 已经可以声明所述分子没有在暴露的寄生虫中产 生抗性。 0120 实施例5 0121 对杜氏利什曼原虫和硕大利什曼原虫的体外研究 0122 为评估决奈达隆作为对多种遍布全球的、 已知对所述参照药物具有不同敏感性的 利什曼虫株的治疗的多价性， 利用被认为代表不同地方病区域的虫株完成了前述检测。 0123 将杜氏利什曼原虫(MHOM/ET/67/HU3)和硕大利什曼原虫(MHOM/SU/73/5-ASKH)的 虫株用于本研究。 0124 盐酸决奈达隆和葡甲胺锑酸盐由Sanofi提供。 米替福新购自Sigma-Aldrich。 0125 本体外研究是涉及四种细胞模型： 0126 -1/杜氏

36、利什曼原虫和硕大利什曼原虫的无污染无鞭毛体(分离的寄生物) 0127 -2/杜氏利什曼原虫和硕大利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体(寄生物寄生于巨 噬细胞中， 在皮肤利什曼病感染期间发现于真皮中)。 0128 将无污染的无鞭毛体模型培养在基于M199的培养基中， 并且该模型能够明确物质 作用于寄生物本身的固有活性， 同时巨噬细胞内无鞭毛体的模型整合穿过巨噬细胞膜和吞 噬溶酶体膜的物质的能力。 0129 所用巨噬细胞是RAW 264.7细胞， 其培养在基于具有10胎牛血清的DMEM的培养 基中。 0130决奈达隆、和米替福新IC50的确定： 0131 每次实验前制备溶解在DMSO中的决奈达隆、 溶解

37、在水中的葡甲胺锑酸盐和米替福 说 明 书 7/8 页 9 CN 104487068 B 9 新溶液。 体外评估是三次独立实验的目的。 0132 实验通过如Audisio等人描述的(Eur.J .Med .Chem .,52:44-50 ,2012)利用 SYBRGREEN定量寄生物DNA来实现。 0133 与决奈达隆接触72小时后测定寄生物生长的50抑制浓度(IC50)， 与作为对照产 品使用的葡甲胺锑酸盐和米替福新进行比较。 0134 -对于杜氏利什曼原虫的无污染无鞭毛体， 决奈达隆的IC50为47.386.27 M， 同 时葡甲胺锑酸盐的IC501000 M， 且米替福新的IC50为13.

38、01.25 M。 0135 -对于硕大利什曼原虫的无污染无鞭毛体， 决奈达隆的IC50为2.550.51 M， 同时 葡甲胺锑酸盐的IC501000 M， 且米替福新的IC50为5.571.50 M。 0136 -对于杜氏利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体， 决奈达隆的IC50为1.670.10 M， 同时葡甲胺锑的IC50为390.3640.46 M， 且米替福新的IC50为0.880.10 M。 0137 -对于硕大利什曼原虫巨噬细胞内的无鞭毛体， 决奈达隆的IC50为1.320.12 M， 同时葡甲胺锑的IC50为347.9879.87 M， 且米替福新的IC50为0.720.11 M。 0

39、138 此外， 直至12.5 M的浓度决奈达隆并没有表现出对于巨噬细胞的毒性。 其50细 胞毒性浓度(CC50)因此高于12.5。 0139 结论 0140 1-决奈达隆对于杜氏利什曼原虫(作为印度/非洲的模型虫株)的体外活性。 0141 决奈达隆表现出与米替福新相似的对于杜氏利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体 的强活性， 大约为1-2 M数量级， 同时其对于无污染的无鞭毛体作用微弱。 定义为对于杜氏 利什曼原虫的巨噬细胞内无鞭毛体的CC50/IC50的决奈达隆的治疗指标因此高于7。 0142 2-决奈达隆对于硕大利什曼原虫(作为中东的模型虫株)的体外活性。 0143 决奈达隆表现出在体外对于硕大

40、利什曼原虫的无污染无鞭毛体和巨噬细胞内无 鞭毛体的模型的强活性， 其IC50低于3 M， 该活性水平与米替福新相似。 如此对寄生物本身 的固有活性在其被保护于巨噬细胞中的巨噬溶酶体内时得到保持。 定义为对于硕大利什曼 原虫的巨噬细胞内无鞭毛体的CC50/IC50的决奈达隆的治疗指标因此高于9。 0144 这些结果倾向于证明决奈达隆在与米替福新相似且明显低于锑酸葡胺的浓度， 能 够带来针对多种虫株的治疗效果(检测了来自全球的3种模型)。 说 明 书 8/8 页 10 CN 104487068 B 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 104487068 B 11 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 104487068 B 12