技术领域
本发明属于高分子材料技术和药剂学领域，涉及一种光可控释放纳米递送系统的制备方法及应用。
背景技术
聚乙烯亚胺（PEI）作为一种商业化基因载体，由于其结构包含大量带正电电荷氨基基团，可以有效地包载带负电的核酸，从而形成稳定的复合物，进一步递送入细胞内。但是，高分子阳离子聚合物拥有大量正电荷的同时，其材料的细胞毒性不可忽略，并且，包裹在其中的核酸材料难以释放，最终导致转染效果受限。发展可降解的阳离子聚合物，可以解决上述矛盾，同时实现核酸包载，及其胞内释放，并且降低高分子材料本身的细胞毒性。目前的刺激响应可降解阳离子聚合物大部分采用内源性刺激，如谷胱甘肽（GSH）、酸性环境等。然而，内源性刺激可调控性差。因此，研发新的递送体系，用来发展外源性刺激可调控、生物安全性高、毒副作用小、转染效率高的高分子阳离子聚合物基因载体是实现有效地基因治疗非常重要的手段。
发明内容
本发明提供了一种三元复合物纳米药物，尤其是该复合物包含的光敏剂可以在外源红光控制下，产生活性氧（ROS），实现光化学内在化（PCI）介导的溶酶体逃逸，以及光促进的聚合物降解，最终实现降低材料毒副作用，提高转染效率，增强肿瘤基因治疗效果的目的。
本发明采用如下技术方案：
一种三元复合物纳米药物，包括缩硫酮键交联低分子量PEI基聚合物、接有光敏剂的透明质酸聚合物、核酸药物。
本发明提供了一种缩硫酮键交联低分子量PEI基聚合物，所述缩硫酮键交联低分子量PEI基聚合物具有式I所示的结构，
其中，R为分子量低于5 kDa的树枝状PEI；20≤n≤500，4≤m≤24。
本发明还公开一种缩硫酮交联剂，其具有如下化学结构式：
本发明提供了一种缩硫酮键交联低分子量PEI基聚合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）以半胱胺、甲氧基丙烯、丙烯酰氯为原料，反应制备缩硫酮交联剂；
（2）以缩硫酮交联剂与PEI为原料，反应制备缩硫酮键交联低分子量PEI基聚合物（TK-PEI）。
本发明提供了一种缩硫酮交联剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）以半胱胺、甲氧基丙烯、丙烯酰氯为原料，反应制备缩硫酮交联剂。
上述技术方案中，步骤（1）中，以半胱胺、三氟乙酸为原料制备化合物1，再以化合物1和甲氧基丙烯为原料制备化合物2，再将化合物2用氢氧化钠脱保护制备化合物3，最后以化合物3、丙烯酰氯为原料，制备缩硫酮交联剂。
上述技术方案中，步骤（1）中，半胱胺、三氟乙酸的摩尔比为1∶1.9～2.1；化合物1和甲氧基丙烯的摩尔比为2.5～2.6∶1；化合物3、丙烯酰氯的摩尔比为1∶3。
上述技术方案中，步骤（2）中，以缩硫酮交联剂与PEI为原料通过迈克尔加成反应制备TK-PEI。
上述技术方案中，缩硫酮交联剂与PEI的质量比为1∶1.3～1.4。
上述技术方案中，本发明使用的PEI包括分子量低于5 kDa的树枝状PEI，比如PEI (600Da)、PEI (1800Da)。
本发明制备TK-PEI的方法具体可举例如下：
（1）将半胱胺（20.0 g，176.0 mmol，1当量）溶于含有三乙胺（35.8 g，353.9 mmol，2当量）的甲醇（400 mL）中。 加入三氟乙酸乙酯（26.2 g，184.8 mmol，1.05当量），并将反应溶液在室温下搅拌过夜。 然后加入乙酸，并将pH调节至6。溶液用乙酸乙酯（3×100 mL）萃取，合并有机层，用无水MgSO4干燥。 将溶液过滤并旋蒸。 通过使用正己烷/乙酸乙酯（8/1）作为洗脱液的硅胶柱色谱法进一步纯化残余物，得到化合物1，氘代氯仿打核磁；
（2）将化合物1（14.2 g，82.0 mmol，2.5当量）和PTSA（0.2 g，1.1 mmol，0.03当量）溶于苯（250 mL）中，将其在室温下搅拌10分钟。 加入分子筛（5 Å，100.0 g），并将混合物再搅拌10分钟。 然后加入2-甲氧基丙烯（2.3 g，32.6 mmol，1当量），并将混合物在室温下搅拌4 h。 将溶液过滤并通过旋蒸浓缩以获得化合物2，氘代氯仿打核磁；
（3）在室温下将化合物2（10.0 g，25.8 mmol）在NaOH溶液（1 M，150 mL）中脱保护5小时。 用二氯甲烷（5×100 mL）萃取溶液，收集水相，在旋蒸除去溶剂后，得到化合物3，氘代DMSO打核磁；
（4）在0℃下，将化合物3（0.3 g，1.6 mmol，1当量）溶于含有三乙胺（0.9 g，9.6 mmol，6当量）的二氯甲烷（30 mL）中。 然后在0℃下将丙烯酰氯（0.4 g，4.8 mmol，3当量）滴加至混合物中。 用乙酸乙酯（3×100 mL）萃取溶液，收集水相并通过硅胶色谱法（正己烷/乙酸乙酯，8/1）纯化，得到化合物4，即缩硫酮交联剂，氘代DMSO打核磁；
（5）将化合物4（25.0 mg）和PEI (600Da)（33.0 mg）溶于1 mL甲醇中，并在45℃避光氮气环境中搅拌48小时。 对去离子水（去离子水，MWCO = 1kDa）透析该混合物2天并冻干，得到TK-PEI, 氘代重水打核磁,凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量。
上述具体反应可表示如下：
本发明公开了接有光敏剂的透明质酸聚合物（HAP），主链为透明质酸，侧链接有光敏剂，所述透明质酸的分子量为7～500 kDa，具有式Ⅱ所示的结构；
其中，R2为光敏剂单元；优选的，光敏剂为羧基卟啉衍生物、羧基叶绿素类卟啉衍生物或二氢卟吩衍生物，结构可表示如下：
本发明公开了一种接有光敏剂的透明质酸聚合物的制备方法，包括以下步骤，将乙酸酐加入透明质酸和吡啶的混合物中，反应得到乙酰化透明质酸；混合光敏剂比如脱镁叶绿素a (Pha)、碳二亚胺(EDC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌后加入乙酰化透明质酸，通过光敏剂的羧基与透明质酸的羟基反应得到接有光敏剂的透明质酸聚合物。
上述技术方案中，乙酸酐、透明质酸的摩尔比为147:1, 光敏剂、乙酰化透明质酸的质量比为20:1。
本发明制备HAP的方法具体可举例如下：
将透明质酸（0.5 g，86.2μmol）和吡啶（1.5mL，18.6mmol）溶于20mL甲酰胺中，并将混合物在室温下搅拌1小时。加入乙酸酐（1.2 mL，12.7 mmol），进一步搅拌24小时，去离子水透析（MWCO = 1 kDa）2天。 冷冻干燥后得到乙酰化的HA； 将Pha（1当量），EDC（1当量）和DMAP（1.5当量）溶于无水DMSO中并将混合物搅拌6小时。 然后将乙酰化的HA（25.0 mg）加入上述混合物中并在室温下再搅拌24小时。 用去离子水透析（MWCO = 1kDa）2天并冻干后获得HAP，紫外-可见（UV-Vis）光谱分析法测量HAP中的光敏剂含量。
本发明的核酸药物选自DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸。
本发明还公开了一种三元复合物纳米药物的制备方法，包括以下步骤，将缩硫酮键交联低分子量PEI基聚合物溶液与核酸药物溶液混合孵育后再加入接有光敏剂的透明质酸聚合物溶液，再次孵育，得到三元复合物纳米药物。具体可以为：
将TK-PEI溶解于DEPC水中，并与提前溶解好的核酸溶液按不同质量比例进行混合，并置于37℃水浴孵育30min后得到二元复合物；再按不同质量比加入溶于DEPC水的HAP，37℃水浴孵育60min，得到最终的纳米药物。
上述技术方案中，所述核酸药物选自DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸。
上述技术方案中，所述DNA为p53质粒DNA，可以表达p53的蛋白质。
本发明的三元复合物纳米药物中，TK-PEI与核酸药物的质量比为（0.1~10）∶1，优选的质量比为（0.5~2.5）∶1，更优选的质量比为1∶1。
本发明的三元复合物纳米药物中，HAP与核酸药物的质量比为（0.1~10）∶1，优选的质量比为（0.5~5）∶1，更优选的质量比为2.5∶1。
本发明的三元复合物纳米药物的粒径为100~1000 nm，优选的粒径为100~300 nm，更优选的粒径为100~150 nm。
本发明的三元复合物纳米药物的Zeta电势为-20~50 mV，优选的Zeta电势为5~30 mV，更优选的Zeta电势为5~10 mV。
本发明还公开了上述TK-PEI和/或HAP在制备核酸药物载体中的应用。
本发明进一步公开了上述TK-PEI、HAP或者三元复合物纳米药物在制备基因药物中的应用，尤其是在制备光可控释放纳米基因药物递送体系中的应用。
本发明的主要优势在于：
（1）TK-PEI包载核酸药物形成的二元复合物作为内核，具有如下优点和作用：①可以稳定包载核酸药物，有效促进核酸药物的内吞；②多氨基的结构可以通过质子海绵效应，提高溶酶体逃逸能力，增强核酸药物进核量；③所含缩硫酮键可在外界刺激下断裂，降低材料本身的毒副作用，并且同时促进核算药物的释放；④合成方法简单可控；⑤原料较为廉价，节约成本；
（2）本发明得到的三元复合纳米颗粒具有如下优点和作用：①外层吸附的透明质酸可以增强复合物的血清稳定性，并通过主动靶向肿瘤细胞提高肿瘤细胞的特异性内吞；②光敏剂在短时间光照条件下，可以产生ROS，通过PCI效应进一步促进纳米颗粒的溶酶体逃逸，同时还可以控制TK-PEI的降解，达到降低毒副作用，增强核酸药物释放的效果；③光敏剂在长时间光照条件下，可以产生致死剂量ROS，实现肿瘤的光动力治疗（PDT）；
（3）本发明公开的三元复合纳米颗粒在不同细胞模型中可以起到明显的肿瘤细胞或正常细胞转染的效果，并进一步通过光照，进一步提高基因转染效果；在体内可以实现协同的肿瘤基因治疗和光动力治疗。
附图说明
图1为实施例一化合物4的1H NMR谱；
图2为实施例二TK-PEI的1H NMR谱；
图3为实施例六的UV-Vis谱图；
图4为实施例二、对比例一双氧水处理前后的GPC谱图；
图5为实施例二和对比例一包裹DNA后的粒径图；
图6为实施例二和对比例一包裹DNA后的电势图；
图7为实施例二和对比例一经过不同浓度双氧水预处理后的DNA包裹图；
图8为三元复合物和二元复合物在血清中随时间的粒径变化图；
图9为B16F10细胞上，实施例二，对比例一和PEI 25k包裹DNA后复合物的基因转染图；
图10为B16F10, HeLa, COS-7细胞上，三元复合物、二元复合物光照前后的基因转染图；
图11 为B16F10细胞上，三元复合物光照前后溶酶体逃逸的荧光图；
图12为B16F10细胞上，三元复合物光照前后DNA释放的荧光图；
图13为B16F10细胞上，实施例二、对比例一、PEI 25k和PEI 600双氧水处理后材料的细胞毒性图；
图14为B16F10肿瘤模型上，三元复合物分别包裹模式DNA（luc）和治疗DNA(p53)、在短光照和长光照条件下的抑瘤曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
实施例一
（1）将半胱胺（20.0 g，176.0 mmol，1当量）溶于含有三乙胺（35.8 g，353.9 mmol，2当量）的甲醇（400 mL）中。加入三氟乙酸乙酯（26.2 g，184.8 mmol，1.05当量），并将反应溶液在室温下搅拌过夜。然后加入乙酸，并将pH调节至6。溶液用乙酸乙酯（3×100 mL）萃取，合并有机层，用无水MgSO4干燥。将溶液过滤并旋蒸，通过使用正己烷/乙酸乙酯（8/1）作为洗脱液的硅胶柱色谱法进一步纯化残余物，得到化合物1，结构式如下：
（2）将化合物1（14.2 g，82.0 mmol，2.5当量）和PTSA（0.2 g，1.1 mmol，0.03当量）溶于苯（250 mL）中，将其在室温下搅拌10分钟。加入分子筛（5 Å，100.0 g），并将混合物再搅拌10分钟。然后加入2-甲氧基丙烯（2.3 g，32.6 mmol，1当量），并将混合物在室温下搅拌4 h。将溶液过滤并通过旋蒸浓缩以获得化合物2，结构式如下：
（3）在室温下将化合物2（10.0 g，25.8 mmol）在NaOH溶液（1 M，150 mL）中脱保护5小时。用二氯甲烷（5×100 mL）萃取溶液，收集水相，在旋蒸除去溶剂后，得到化合物3，结构式如下：
（4）在0℃下，将化合物3（0.3 g，1.6 mmol，1当量）溶于含有三乙胺（0.9 g，9.6 mmol，6当量）的二氯甲烷（30 mL）中。然后在0℃下将丙烯酰氯（0.4 g，4.8 mmol，3当量）滴加至混合物中。用乙酸乙酯（3×100 mL）萃取溶液，收集水相并通过硅胶色谱法（正己烷/乙酸乙酯，8/1）纯化，得到化合物4，结构式如下：
氘代DMSO打核磁，图1为化合物4核磁图。
实施例二
将化合物4（25.0 mg）和PEI (600Da)（33.0 mg）溶于1 mL甲醇中，并在45℃避光氮气环境中搅拌48小时。对去离子水（去离子水，MWCO = 1kDa）透析该混合物2天并冻干，得到化合物5 （TK-PEI），氘代重水打核磁，图2为化合物5核磁图，图4为化合物5的GPC图，分子量为11 kDa。
实施例三
将化合物4（25.0 mg）和PEI (1800Da)（33.0 mg）溶于1 mL甲醇中，并在45℃避光氮气环境中搅拌48小时。对去离子水（去离子水，MWCO = 1kDa）透析该混合物2天并冻干，得到化合物5 （TK-PEI），分子量为18 kDa。
实施例四
将化合物4（25.0 mg）和PEI (1800Da)（66.0 mg）溶于1 mL甲醇中，并在45℃避光氮气环境中搅拌48小时。对去离子水（去离子水，MWCO = 1kDa）透析该混合物2天并冻干，得到化合物5 （TK-PEI），分子量为20 kDa。
实施例五
将化合物4（25.0 mg）和PEI (600Da)（66.0 mg）溶于1 mL甲醇中，并在45℃避光氮气环境中搅拌48小时。对去离子水（去离子水，MWCO = 1kDa）透析该混合物2天并冻干，得到化合物5 （TK-PEI），分子量为12 kDa。
对比例一
（1）在0℃下，将1，7-庚二胺（0.3 g，1.6 mmol，1当量）溶于含有三乙胺（0.9 g，9.6 mmol，6当量）的二氯甲烷（30 mL）中。 然后在0℃下将丙烯酰氯（0.4 g，4.8 mmol，3当量）滴加至混合物中。 用乙酸乙酯（3×100 mL）萃取溶液，收集水相并通过硅胶色谱法（正己烷/乙酸乙酯，8/1）纯化，得到化合物6，结构式如下：
（2）将化合物6（25.0 mg）和PEI (600Da)（33.0 mg）溶于1 mL甲醇中，并在45℃避光氮气环境中搅拌48小时。对去离子水（去离子水，MWCO = 1kDa）透析该混合物2天并冻干，得到化合物7（NK-PEI），结构式如下：
实施例六
将透明质酸（0.5 g，86.2μmol）和吡啶（1.5mL，18.6mmol）溶于20mL甲酰胺中，并将混合物在室温下搅拌1小时。加入乙酸酐（1.2 mL，12.7 mmol），进一步搅拌24小时，去离子水透析（MWCO = 1 kDa）2天。 冷冻干燥后得到乙酰化的HA； 将Pha（1当量），EDC（1当量）和DMAP（1.5当量）溶于无水DMSO中并将混合物搅拌6小时。 然后将乙酰化的HA（25.0 mg）加入上述混合物中并在室温下再搅拌24小时。 用去离子水透析（MWCO = 1kDa）2天并冻干后获得接有光敏剂的透明质酸聚合物HAP，图3为HAP紫外可见光谱图。
实施例七
将透明质酸（0.5 g，86.2μmol）和吡啶（1.5mL，18.6mmol）溶于20mL甲酰胺中，并将混合物在室温下搅拌1小时。加入乙酸酐（1.2 mL，12.7 mmol），进一步搅拌24小时，去离子水透析（MWCO = 1 kDa）2天。 冷冻干燥后得到乙酰化的HA； 将Pha（1当量），EDC（1当量）和DMAP（1.5当量）溶于无水DMSO中并将混合物搅拌6小时。 然后将乙酰化的HA（25.0 mg）加入上述混合物中并在室温下再搅拌24小时。 用去离子水透析（MWCO = 1kDa）2天并冻干后获得HAP。
实施例八
将透明质酸（0.5 g，86.2μmol）和吡啶（1.5mL，18.6mmol）溶于20mL甲酰胺中，并将混合物在室温下搅拌1小时。加入乙酸酐（1.2 mL，12.7 mmol），进一步搅拌24小时，去离子水透析（MWCO = 1 kDa）2天。 冷冻干燥后得到乙酰化的HA； 将二氢卟吩Ce6（1当量），EDC（1当量）和DMAP（1.5当量）溶于无水DMSO中并将混合物搅拌6小时。 然后将乙酰化的HA（25.0 mg）加入上述混合物中并在室温下再搅拌24小时。 用去离子水透析（MWCO = 1kDa）2天并冻干后获得HAP。
实施例九
将透明质酸（0.5 g，86.2μmol）和吡啶（1.5mL，18.6mmol）溶于20mL甲酰胺中，并将混合物在室温下搅拌1小时。加入乙酸酐（1.2 mL，12.7 mmol），进一步搅拌24小时，去离子水透析（MWCO = 1 kDa）2天。 冷冻干燥后得到乙酰化的HA； 将羧基卟啉（1当量），EDC（1当量）和DMAP（1.5当量）溶于无水DMSO中并将混合物搅拌6小时。 然后将乙酰化的HA（25.0 mg）加入上述混合物中并在室温下再搅拌24小时。 用去离子水透析（MWCO = 1kDa）2天并冻干后获得HAP。
实施例十
以实施例二的TK-PEI、实施例六的HAP为载体组装的纳米药物的制备以及表征、性能。
配制实施例二TK-PEI和DNA（质粒DNA，从大肠杆菌中提取的含luciferase或者p53表达的质粒）浓度分别为1 mg/mL和0.1 mg/mL 的DEPC水溶液。按照TK-PEI/DNA不同重量比混合，将混合物涡旋10秒，然后在37℃下孵育30分钟，以形成TK-PEI/DNA复合物。
配制实施例六HAP浓度为1 mg/mL 的DEPC水溶液。按照HAP/上述二元复合物不同重量比混合，将混合物涡旋10秒，然后在37℃下孵育60钟，以形成HAP/TK-PEI/DNA三元复合物。
利用动态光散射（DLS）评估三元复合物在不同重量比混合下，复合物的粒径和电位。
将EB溶液与DNA以重量比为10:1混合。并在室温下孵育1小时。然后按照TK-PEI/DNA不同重量比将实施例加入到EB/DNA混合物中，进一步将混合物放在室温下孵育30分钟，通过酶标仪测定其荧光强度（λex = 510 nm，λem = 590 nm）定量测定DNA包裹效率。
B16F10细胞以每孔2.5×104个接种到96孔板内，然后在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，并按照0.3 µg DNA/每孔的浓度加入二元复合物。37 ℃孵育4小时后，移除培养基，替换成新鲜培养基之后进一步孵育20小时。使用荧光素酶试剂盒测定荧光素酶表达，并使用BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度，评价其基因转染效率。
B16F10细胞以每孔2.5×104个接种到96孔板内，然后在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。按照0.3 µg DNA/每孔的浓度加入三元复合物。37 ℃孵育4小时后，移除培养基，替换成新鲜培养基，将细胞分为两组，一组进行光照（661 nm, 8 min），一组不进行光照，之后进一步孵育20小时。使用荧光素酶试剂盒测定荧光素酶表达，并使用BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度，评价其基因转染效率。
共聚焦激光扫描显微镜可以进一步观察复合物的细胞内化和分布。B16F10细胞以每孔1.5×104个接种到24孔板内，然后在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时后，换成无血清培养基，按照1 μg YOYO-1-DNA/孔的浓度加入复合物。37℃培养4小时。 用含肝素钠的PBS洗涤三次，用Lysotracker-Red（200 nM）染色1小时；再用含肝素钠的PBS洗三次后，用4％多聚甲醛固定15分钟；随后用含肝素钠的PBS洗三次后用DAPI（5 μg/mL）染10分钟；最后用甘油封片。其荧光强度通过激光共聚焦显微镜进行观察。
B16F10细胞以每孔2.5×104个接种到96孔板内，培养24小时。然后换成无血清培养基，加入不同终浓度的双氧水预处理的聚合物。37 ℃下孵育4小时后，弃原培养基，换成10％FBS的DMEM培养基中培养20小时后。通过MTT法测定细胞存活率。
雄性C57BL / 6小鼠在左侧皮下注射1×10 6个B16F10细胞。当肿瘤体积达到80mm3时，将小鼠随机分为4组（n = 6），在第1、3、5、7和9天接受瘤内注射磷酸盐缓冲液或各种纳米粒（3mg DNA /kg，注射体积〜50μL）。组1接受注射磷酸盐缓冲液。第3组接受注射TK-PEI / HAP / luc 纳米粒。第2组和第4组接受TK-PEI / HAP / p53 纳米粒。在注射后4小时对组2中的动物照射（20mW /cm2，661nm）8分钟，而组3和4中的动物在4小时照射（20mW /cm 2，661nm）8分钟注射后和注射后24小时30分钟。每隔一天监测肿瘤大小。
将实施例二的TK-PEI更换为对比例一的NK-PEI，组装形成的二元、三元复合物进行比较，结果如下：
图4为实施例二和对比例一双氧水处理前后的GPC图，从图4中发现本发明的实施例二和对比例一具有相似的分子量（10~12 kDa）。相比于对比例一，实施例二在双氧水处理后保留时间明显延长，说明双氧水处理导致实施例二分子量降低。
图5为实施例二和对比例一包裹DNA后的粒径图，从图5中发现本发明的TK-PEI作为载体拥有良好的纳米粒径分布，约为100~150 nm。
图6为实施例二和对比例一包裹DNA后的电势图，从图6中发现实施例二和对比例一在和核酸药物质量比为0.5负电荷变为正电荷，约为10~20mV，实施例二和对比例一与核酸药物复合良好。
图7为实施例二和对比例一包裹DNA后的溴化乙锭处理的DNA包裹图，从图7中发现实施例二和对比例一在和核酸药物质量比为0.5时均可实现高达将近90%的包载率，证明实施例二和对比例一均可以很好的包裹核酸药物；通过使用不同浓度双氧水处理实施例二和对比例一，图7中可以发现实施例二的DNA包载率明显下降，而对比例一DNA包载率没有变化，说明实施例二具有双氧水响应性降解。
图8为二元复合物（TK-PEI/DNA）和三元复合物（HAP/TK-PEI/DNA）在血清中的稳定性图，从图8中可以发现，随着时间的延长，二元复合物粒径明显增大，三元复合物粒径保持稳定。说明三元复合物在血清中具有更强的稳定性。
图9为B16F10细胞上，实施例二，对比例一和25k PEI包裹DNA后复合物的基因转染，从图9中可以发现实施例二在和对比例一在和核酸药物相同质量比的时候，拥有相似的转染效率。
图10为B16F10细胞上，三元复合物、二元复合物包裹DNA后的光照前后基因转染，从图10中可以发现，当对三元复合物进行短光照，三元复合物的转染效果相较于非光照有着明显提高，证明三元复合物具有良好的光可激活性，促进光动力破膜，有利于复合物逃逸内涵体。
图11为B16F10细胞上，三元复合物光照前后的溶酶体逃逸的荧光图，从图11中可以发现光照后，红色和绿色荧光重叠减少，证明有更多的复合物逃逸出内涵体，有利于促进基因转染。
图12为B16F10细胞上，三元复合物光照前后的DNA从复合物中释放的荧光图，从图12中可以发现光照后，红色和绿色荧光重叠减少，证明有更多的DNA从复合物中释放到细胞质中，有利于促进基因转染。
图13为B16F10细胞上，实施例二，对比例一，25k PEI和600 PEI经过双氧水预处理24小时后的聚合物材料的细胞毒性，从图13中可以发现实施例二与600 PEI具有相似的细胞存活率，在聚合物浓度达到0.1mg/mL时，细胞存活率仍可维持在90%以上，而对比例一的细胞存活率随着聚合物浓度的增加，显示出明显的细胞毒性。证明实施例二对双氧水的响应性降解可以提高材料的生物相容性，减少毒副作用。
图14为B16F10肿瘤模型上，三元复合物包裹模式DNA（luc）和治疗DNA(p53)、在短光照和长光照条件下的抑瘤曲线图。从图14可以看出，相比于单一的基因治疗或单一的光动力治疗，结合治疗性DNA和长光照产生的光动力治疗效果，可以达到最好地抑制肿瘤的生长。
本发明提供的含光敏剂和缩硫酮敏感键的三元光可控释放纳米递送系统，设计的具有红光响应的三元复合物可以作为核酸药物的载体且具有良好的稳定性、生物可降解性和光可激活性，在核酸药物给药系统中具有良好的应用。