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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810338829.0 (22)申请日 2018.04.16 (71)申请人 杭州师范大学 地址 310000 浙江省杭州市余杭区余杭塘 路2318号 (72)发明人 芈肖肖 (74)专利代理机构 昆明合众智信知识产权事务 所 53113 代理人 钱磊 (51)Int.Cl. A61K 45/00(2006.01) A61K 31/18(2006.01) A61P 27/16(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)。
2、 G01N 15/00(2006.01) G01N 15/10(2006.01) G01N 15/14(2006.01) (54)发明名称 一种Wnt/-catenin信号通路影响斑马鱼 侧线毛细胞再生的方法 (57)摘要 本发明公开了一种Wnt/-catenin信号通 路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 所述方法 通过流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、 荧 光定量PCR、 整胚原位杂交以及外源添加Wnt/- catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂 的方法， 观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中Wnt/ -catenin信号通路各因子的时空表达情况及 毛细胞再生情况变化， 对模式动物斑马鱼。
3、侧线毛 细胞再生进行影响， Wnt/-catenin信号因子在 顺铂诱导毛细胞死亡过程中表达量升高， 包括配 体wnt2、 wnt3a及关键因子ctnnb1在侧线神经丘 助细胞类群表达量升高； dkk1a和dkk2在助细胞 类群表达量降低， 这说明了在毛细胞死亡时， Wnt/-catenin信号通路活化。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 108524936 A 2018.09.14 CN 108524936 A 1.一种Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述 方法通过流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、 荧光定量PCR、 整胚原位杂交。
4、以及外源添 加Wnt/ -catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的方法， 观察顺铂诱导毛细胞损 伤过程中Wnt/ -catenin信号通路各因子的时空表达情况及毛细胞再生情况变化， 对模式 动物斑马鱼侧线毛细胞再生进行影响。 2.根据权利要求1所述的Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于， 所述流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞方法具体为： 收集5天转基因鱼 SqET10顺铂处理3小时的样本， 冰上麻醉后， 用刀片切除耳泡以前的头部组织， 将躯干组织 转移到无钙Ringer s溶液中， 以5min为间隔用200 L枪头上下吹打样本15min以去。
5、除卵黄， 将去除卵黄的样本转移至含有1mM EDTA 0.25Trypsin溶液中， 28.5处理2030min， 其 间每隔5min用1mL枪头来回吹吸， 帮助组织解散成单细胞悬液， 加入10FBS和1mM CaCl2终 止酶促分解反应， 收集细胞悬液， 1000rpm离心5min， 1x PBS清洗2次， 最后重悬于500 L PBS 溶液中， 用BD Aria II流式细胞分选仪分选GFP阳性细胞， 细胞接收液为PBS(1x)， 将分选所 得的溶液离心， 1000rpm， 5min， 去除上清后， 直接加入Trizol-80保存。 3.根据权利要求2所述的Wnt/ -catenin信号通。
6、路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述头部组织需要去除头部侧线组织。 4.根据权利要求2所述的Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述无钙Ringer s溶液配方为116mM Nacl+2.9mM Kcl+5mM pH7.2HEPES。 5.根据权利要求1所述的Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述荧光定量PCR方法为Trizol提取分选细胞总RNA， 用M-MLV第一链合成体系 逆转成cDNA模板， -actin为内参基因。 6.根据权利要求5所述的Wnt/ -catenin信号通路。
7、影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述QPCR所用的试剂盒为Green Quantitative RT-qPCR Kit。 7.根据权利要求1所述的Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述整胚原位杂交方法为取10条斑马鱼样本， 4PFA固定过夜， 加入地高辛标 记的反义链探针孵育过夜保证探针充分结合， 第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4- 5小时， 后加入BCIP和NBT底物避光显色。 8.根据权利要求1所述的Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述毛细胞再生的计数方法为1015条斑马。
8、鱼幼鱼放于1.5mL EP管中， 加入 500 L 2 M YO-PRO1毛细胞特异性活体染料， 室温避光30min， 回收染料， 用新鲜的养鱼水润 洗幼鱼3次即可， 用0.016质量体积比麻醉剂麻醉后， 在Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜计 数侧线神经丘毛细胞数目。 9.根据权利要求1所述的Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 其特征在于： 所述顺铂浓度为1mM。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108524936 A 2 一种Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的 方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其。
9、涉及一种Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧 线毛细胞再生的方法。 背景技术 0002 Wnt/ -catenin信号通路即Wingless-Int(Wnt)/ -catenin信号通路， 是公认的细 胞增殖和分化调节因子。 在Wnt/ -catenin信号通路中， Wnts配体结合Frizzled受体和 Lrp5/Lrp6辅助受体后通过招募Dishevelled活化受体复合物， 解聚 -catenin降解复合体 (GSK3 起主要调节作用)后， 最终使 -catenin在细胞质内累积并进入细胞核与TCF/LEF一 起激活下游因子表达。 Kawakami等发现抑制Wnt/ -cate。
10、nin信号通路导致斑马鱼、 美西螈、 非洲爪蟾和鸡等脊椎动物肢体再生障碍。 Wnt/ -catenin信号通路同样控制着斑马鱼视网 膜再生前体细胞的增殖。 当用新霉素杀死斑马鱼侧线毛细胞后， 增强Wnt/ -catenin信号通 路显著增加侧线神经丘助细胞增殖和毛细胞形成。 但是目前仍缺少对Wnt/ -catenin信号 在毛细胞再生程序启动早期的关注。 0003 顺铂的抗肿瘤作用发现30余年以来， 其同后来衍生出的铂类化合物成为抗肿瘤治 疗的一线用药。 但是顺铂类化合物的耳毒性也是有目共睹的。 研究者通过大样本数据回归 分析发现， 5岁以下的儿童尤其对顺铂诱发的耳聋敏感， 当顺铂累积使用量达。
11、400mg/m2后， 405岁以下儿童癌症患者表现出中度至重度的听力丢失， 而年龄在15-20岁的对照组仅有 5表现出听力丢失的现象。 目前研究认为在癌细胞和毛细胞中， 顺铂可和DNA碱基共价结 合， 引起DNA链内或链间交联， 诱发细胞凋亡。 因此建立符合临床特点的顺铂损伤毛细胞模 型是探究顺铂诱发听力障碍治疗的基础。 0004 斑马鱼侧线毛细胞可被多种耳毒性药物杀死， 研究发现， 氨基糖苷类抗生素、 顺铂 类治癌药物和重金属离子铜等都可特异性的杀死侧线毛细胞。 对氨基糖苷类药物来说， 目 前研究认为它们可以引起线粒体肿胀和胞内Ca2+浓度的瞬时增加。 重金属离子铜离子以细 胞凋亡和坏死结合。
12、的方式杀死侧线毛细胞。 顺铂类药物在杀死侧线毛细胞过程中可使毛细 胞的细胞核固缩， 断裂成核小片段。 我们前期研究结果发现， 顺铂在杀死斑马鱼侧线毛细胞 过程中可引起Caspase-3活化， 这说明顺铂是通过细胞凋亡诱导毛细胞死亡。 Piotrowski和 Hudspeth研究组分别利用分选的斑马鱼侧线神经丘助细胞类群进行转录组高通量测序分 析， 发现Wnt/ -catenin信号通路相关基因不参与新霉素和硫酸铜诱导毛细胞死亡后的助 细胞早期响应。 发明内容 0005 本发明的目的在于， 提供一种能够影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 本发明所 解决技术问题是提供一种Wnt/ -catenin信。
13、号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法。 0006 本发明的技术方案是： 说 明 书 1/6 页 3 CN 108524936 A 3 0007 一种Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 所述方法通过 流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、 荧光定量PCR、 整胚原位杂交以及外源添加Wnt/ - catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的方法， 观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中 Wnt/ -catenin信号通路各因子的时空表达情况及毛细胞再生情况变化， 对模式动物斑马 鱼侧线毛细胞再生进行影响； 我们利用模式脊椎动物斑马鱼侧线毛细胞再生系统， 建立顺 铂诱导毛细。
14、胞损伤与再生体系， 利用流式分选侧线神经丘助细胞类群以及整胚原位杂交方 法探讨Wnt/ -catenin信号在毛细胞损伤及再生早期的时空表达变化， 进一步通过外源添 加小分子化合物抑制或增强Wnt/ -catenin信号强度观察再生毛细胞数目变化。 0008 作为优选的技术方案， 所述流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞方法具体为： 收集5天转基因鱼SqET10顺铂处理3小时的样本， 冰上麻醉后， 用刀片切除耳泡以前的头部 组织， 将躯干组织转移到无钙Ringer s溶液中， 以5min为间隔用200 L枪头上下吹打样本 15min以去除卵黄， 将去除卵黄的样本转移至含有1mM EDTA 0.2。
15、5Trypsin溶液中， 28.5 处理2030min， 其间每隔5min用1mL枪头来回吹吸， 帮助组织解散成单细胞悬液， 加入10 FBS和1mM CaCl2终止酶促分解反应， 收集细胞悬液， 1000rpm离心5min， 1x PBS清洗2次， 最 后重悬于500 L PBS溶液中， 用BD Aria II流式细胞分选仪分选GFP阳性细胞， 细胞接收液 为PBS(1x)， 将分选所得的溶液离心， 1000rpm， 5min， 去除上清后， 直接加入Trizol-80保 存。 0009 作为优选的技术方案， 所述头部组织需要去除头部侧线组织。 0010 作为优选的技术方案， 所述无钙Rin。
16、ger s溶液配方为116mM Nacl+2.9mMKcl+5mM pH7.2HEPES。 0011 作为优选的技术方案， 所述荧光定量PCR方法为Trizol提取分选细胞总RNA， 用M- MLV第一链合成体系逆转成cDNA模板， -actin为内参基因。 0012作为优选的技术方案， 所述QPCR所用的试剂盒为Green Quantitative RT- qPCR Kit。 0013 作为优选的技术方案， 所述整胚原位杂交方法为取10条斑马鱼样本， 4PFA固定 过夜， 加入地高辛标记的反义链探针孵育过夜保证探针充分结合， 第二天加入碱性磷酸酶 偶联二抗室温孵育4-5小时， 后加入BCIP。
17、和NBT底物避光显色。 0014 作为优选的技术方案， 所述毛细胞再生的计数方法为1015条斑马鱼幼鱼放于 1.5mL EP管中， 加入500 L 2 M YO-PRO1毛细胞特异性活体染料， 室温避光30min， 回收染 料， 用新鲜的养鱼水润洗幼鱼3次即可， 用0.016质量体积比麻醉剂麻醉后， 在Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜计数侧线神经丘毛细胞数目。 0015 作为优选的技术方案， 所述顺铂浓度为1mM。 0016 由于采用了上述技术方案， 一种Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞 再生的方法， 其特征在于： 所述方法通过流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、。
18、 荧光定量 PCR、 整胚原位杂交以及外源添加Wnt/ -catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的 方法， 观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中Wnt/ -catenin信号通路各因子的时空表达情况及 毛细胞再生情况变化， 对模式动物斑马鱼侧线毛细胞再生进行影响； Wnt/ -catenin信号因 子在顺铂诱导毛细胞死亡过程中表达量升高， 包括配体wnt2、 wnt3a及关键因子ctnnb1在侧 线神经丘助细胞类群表达量升高； dkk1a和dkk2在助细胞类群表达量降低， 这说明了在毛细 说 明 书 2/6 页 4 CN 108524936 A 4 胞死亡时， Wnt/ -catenin信号。
19、通路活化。 附图说明 0017 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动性的前提下， 还可 以根据这些附图获得其他的附图。 0018 图1是本发明Wnt/ -catenin信号通路因子在助细胞中表达量升高图； A： RT-PCR结 果。 Total RNA提取自流式分选助细胞类群， 以oligo dT构建cDNA为模板， 扩增Wnt信号通路 配体(参与Wnt/ -catenin信号通路配体有wnt1、 wnt2。
20、、 wnt2ba、 wnt2bb、 wnt3a、 wnt4a、 wnt4b、 wnt7ba、 wnt8a、 wnt8b、 wnt9b、 wnt10a、 wnt10b和wnt16， 参与非经典Wnt信号通路配体 有wnt3、 wnt5a、 wnt5b、 wnt6a、 wnt6b、 wnt7aa、 wnt7bb、 wnt9b、 wnt11和wnt11r)。 其中RT-PCR 结果显示表达量发生变化的有： wnt2和wnt3a相较于对照组表达量升高， wnt7bb相对于对照 组表达量降低。 cldnb为助细胞类群特异性分子， -actin为内参。 B： QPCR结果。 wnt2、 wnt3a、 wn。
21、t7bb和ctnnb1(beta-catenin)在分选助细胞类群QPCR结果， -actin为内参。 *,P0.5； ns， 没有显著性差异。 0019 图2是本发明Wnt/ -catenin信号通路拮抗因子dkk1a和dkk2在助细胞类群表达量 下降图， A-F： 整胚原位杂交显示dkk1a表达图谱； G-L： 整胚原位杂交显示dkk2表达图谱。 左 侧箭号标示毛细胞类群， 右侧箭号标示紧挨毛细胞的助细胞类群。 外侧圆圈标示神经丘大 小， 内侧圆圈标示神经丘中心毛细胞区域。 比例尺， 10 m。 0020 图3是本发明Wnt/ -catenin信号通路抑制剂/增强剂对侧线毛细胞再生数目的影。
22、 响图。 具体实施方式 0021 一种Wnt/ -catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法， 所述方法通过 流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、 荧光定量PCR、 整胚原位杂交以及外源添加Wnt/ - catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的方法， 观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中 Wnt/ -catenin信号通路各因子的时空表达情况及毛细胞再生情况变化， 对模式动物斑马 鱼侧线毛细胞再生进行影响； 我们利用模式脊椎动物斑马鱼侧线毛细胞再生系统， 建立顺 铂诱导毛细胞损伤与再生体系， 利用流式分选侧线神经丘助细胞类群以及整胚原位杂交方 法探讨Wnt/ -catenin信号在。
23、毛细胞损伤及再生早期的时空表达变化， 进一步通过外源添 加小分子化合物抑制或增强Wnt/ -catenin信号强度观察再生毛细胞数目变化。 0022 所述流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞方法具体为： 收集5天转基因鱼 SqET10顺铂处理3小时的样本， 冰上麻醉后， 用刀片切除耳泡以前的头部组织， 将躯干组织 转移到无钙Ringer s溶液中， 以5min为间隔用200 L枪头上下吹打样本15min以去除卵黄， 将去除卵黄的样本转移至含有1mM EDTA0.25Trypsin溶液中， 28.5处理2030min， 其 间每隔5min用1mL枪头来回吹吸， 帮助组织解散成单细胞悬液， 加入10。
24、FBS和1mM CaCl2终 止酶促分解反应， 收集细胞悬液， 1000rpm离心5min， 1x PBS清洗2次， 最后重悬于500 L PBS 溶液中， 用BD Aria II流式细胞分选仪分选GFP阳性细胞， 细胞接收液为PBS(1x)， 将分选所 说 明 书 3/6 页 5 CN 108524936 A 5 得的溶液离心， 1000rpm， 5min， 去除上清后， 直接加入Trizol-80保存。 0023 所述头部组织需要去除头部侧线组织。 0024 所述无钙Ringer s溶液配方为116mM Nacl+2.9mM Kcl+5mM pH7.2HEPES。 0025 所述荧光定量P。
25、CR方法为Trizol提取分选细胞总RNA， 用M-MLV第一链合成体系逆 转成cDNA模板， -actin为内参基因。 0026所述QPCR所用的试剂盒为Green Quantitative RT-qPCR Kit。 0027 所述整胚原位杂交方法为取10条斑马鱼样本， 4PFA固定过夜， 加入地高辛标记 的反义链探针孵育过夜保证探针充分结合， 第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5 小时， 后加入BCIP和NBT底物避光显色。 0028 所述毛细胞再生的计数方法为1015条斑马鱼幼鱼放于1.5mL EP管中， 加入500 L 2 M YO-PRO1毛细胞特异性活体染料， 室温避光30m。
26、in， 回收染料， 用新鲜的养鱼水润洗幼 鱼3次即可， 用0.016质量体积比麻醉剂麻醉后， 在Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜计数侧 线神经丘毛细胞数目。 0029 1.实验材料与方法 0030 1.1实验材料： 实验所用野生型鱼系为Tbingen(简称TU)。 标记侧线助细胞的转基 因鱼系SqET10来自新加坡科技研究局Tol2转座子介导的增强子斑马鱼系筛选工程。 饲养环 境为恒温28.5水环境。 顺铂(美国， Sigma,479306)、 活体染料YO-PRO1(美国， Invitrogen， Y3603)、 碱性磷酸酶抗地高辛抗体(瑞士， Roche， 11093274910)。
27、、 肝素(美国， Sigma， H3393)、 tRNA(美国， Sigma， R8759)、 EDTA 0.25Trypsin(美国， Gibco， 25200056)、 BIO(美国， Sigma， SML0531)、 XAV939(英国， Tocris， 3748)、 FH535(英国， Tocris， 4344)。 0031 1.2溶液的配制： 实验所用顺铂浓度为1mM。 BIO所用浓度为1 M， FH535所用浓度梯 度为0.001 M、 0.01 M和0.1 M， XAV939所用浓度为25 M。 用养鱼水稀释小分子化合物至所需 浓度， 温度28.5并避光条件下浸泡实验中斑马鱼， 。
28、就可达到在毛细胞再生过程中阻断或 增强该信号通路的目的。 实验结束时回收小分子化合物， 避光4保存备用。 0032 1.3流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞方法： 收集5天转基因鱼SqET10顺铂处 理3小时的样本， 冰上麻醉后， 用刀片切除耳泡以前的头部组织(去除头部侧线组织)， 将躯 干组织转移到无钙Ringer s溶液中(配方为： 116mM Nacl+2.9mM Kcl+5mM pH7.2HEPES)， 以 5min为间隔用200 L枪头上下吹打样本15min以去除卵黄， 将去除卵黄的样本转移至含有 1mM EDTA0.25Trypsin溶液中， 28.5处理2030min， 其间每隔。
29、5min用1mL枪头来回吹 吸， 帮助组织解散成单细胞悬液。 加入10FBS和1mM CaCl2终止酶促分解反应， 收集细胞悬 液， 1000rpm离心5min， 1x PBS清洗2次， 最后重悬于500 L PBS溶液中。 用BD Aria II流式细 胞分选仪分选GFP阳性细胞， 细胞接收液为PBS(1x)， 将分选所得的溶液离心， 1000rpm， 5min， 去除上清后， 直接加入Trizol-80保存。 0033 1.4整胚原位杂交方法： 取10条斑马鱼样本， 4PFA固定过夜， 加入地高辛标记的 反义链探针孵育过夜保证探针充分结合， 第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5小 时。
30、， 后加入BCIP和NBT底物避光显色。 0034 1.5基因表达定量方法： Trizol提取分选细胞总RNA， 用M-MLV第一链合成体系逆转 成cDNA模板。 QPCR所用的试剂盒为Green QuantitativeRT-qPCR Kit， -actin为内 参基因， 统计数据均来自三次独立重复实验。 说 明 书 4/6 页 6 CN 108524936 A 6 0035 1.6再生毛细胞计数方法： 1015条斑马鱼幼鱼放于1.5mL EP管中， 加入500 L 2 M YO-PRO1毛细胞特异性活体染料， 室温避光30min， 回收染料， 用新鲜的养鱼水润洗幼鱼3 次即可。 用0.01。
31、6质量体积比麻醉剂麻醉后， 在Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜计数侧线 神经丘毛细胞数目。 0036 1.7统计分析： 斑马鱼侧线神经丘毛细胞的统计方法为计数后侧线前三个神经丘 毛细胞数目取平均值， 数据表示为均数SEM， 采用student t检验进行显著性分析。 0037 2结果 0038 2.1Wnt/ -catenin信号通路因子在神经丘助细胞类群表达量升高。 我们通过流式 分选方法从转基因鱼SqET10分选得到侧线神经丘助细胞类群， 检测了Wnt信号通路配体和 关键性因子beta-catenin(ctnnb1)表达量的变化。 如图1所示， Wnt/ -catenin信号通路配。
32、 体wnt2和wnt3a表达量升高(P0.5)， 而非经典Wnt信号通路配体wnt7bb略降低， 但不具有 显著性(P0.5)， 同时Wnt/ -catenin信号通路关键因子beta-catenin在分选助细胞中的 表达量也显著升高(P0.5)。 这说明经典Wnt/ -catenin信号通路参与了顺铂损伤-毛细胞 再生过程。 0039 2.2Wnt/ -catenin信号通路拮抗因子dkks在神经丘助细胞类群表达量下降。 Dickkopf(Dkk)作为Wnt/ -catenin信号通路拮抗分子， 可以通过阻碍Wnt-Frizzled复合体 的形成起到拮抗Wnt/ -catenin信号通路的作。
33、用。 在已有的文献报道中， 我们已知dkk1、 dkk2和dkk4是Wnt/ -catenin信号通路的拮抗因子。 斑马鱼整胚原位杂交结果显示， 如图2 所示， dkk1a和dkk2表达在5天野生型神经丘细胞区域， 通过其表达的位置， 我们认为此时两 者不仅表达在神经丘中心区域的毛细胞， 也表达在毛细胞外围的助细胞区域(图2A与G， 左 侧箭号标示毛细胞类群， 右侧箭号标示紧挨毛细胞的助细胞类群)， 而dkk1b和dkk4在神经 丘区域不表达(数据未呈现)。 我们观察到dkk1a在顺铂加入1小时后所有神经丘细胞内的表 达显著性降低， 一直延续到药物处理终点(图2A-F)。 dkk2在顺铂加入1。
34、小时后， 在神经丘中 心毛细胞区域依然可以检测到表达， 而毛细胞外围助细胞区域(粉色圆圈和红色圆圈之间 的区域)dkk2不再表达。 随着时间延长， dkk2在神经丘细胞区域的表达也逐渐减少(图2G-L， 红色箭号标示神经丘中心毛细胞类群， 绿色箭号标示神经丘助细胞类群)。 综上， dkk1a和 dkk2在神经丘助细胞区域的表达均降低， 这和上一小节观察到的现象相呼应， 这说明了神 经丘助细胞Wnt/ -catenin信号通路增强。 0040 2.3Wnt/ -catenin信号通路在顺铂损伤-毛细胞再生体系中是必需非充分条件。 为了检测Wnt/ -catenin信号通路对侧线毛细胞再生的必要性。
35、， 外源添加Wnt/ -catenin信 号通路抑制剂或增强剂去观察毛细胞再生情况的变化。 如图3所示， 正常再生过程中， 顺铂 去除后恢复到48小时， 侧线神经丘毛细胞平均再生8个左右； 当外源添加小分子化合物抑制 剂FH535时， 48小时之后侧线神经丘毛细胞平均再生3个左右(图3， 0.01 M、 0.001 M FHF535 和35 MXAV939， 连续浸泡48h)； 当把抑制剂浓度提高后(0.1 M FH535)， 48小时后侧线神经 丘毛细胞再生数目平均为1个左右。 以上数据说明抑制Wnt/ -catenin信号通路可抑制侧线 毛细胞再生。 进一步， 我们把时间窗锁定在撤出顺铂后。
36、前12小时时间段内， 发现添加抑制剂 2小时即可抑制48小时处毛细胞再生能力， 同时毛细胞再生能力随着抑制剂作用时间延长 而逐渐减弱。 而且前4小时和前12小时抑制Wnt/ -catenin信号通路后侧线毛细胞再生数目 没有显著差别(P0.5)(比较图3A中0.1 M FH535作用在012h和0.1 M FH535作用在0 说 明 书 5/6 页 7 CN 108524936 A 7 4h侧线神经丘毛细胞再生数目)。 由此我们可以得出结论Wnt/ -catenin信号通路在侧线神 经丘毛细胞再生早期是必需条件。 0041 另一方面， 我们也利用小分子化合物增强剂BIO来增强Wnt/ -cat。
37、enin信号强度， 观察对侧线神经丘毛细胞再生情况的影响。 如图3B所示， 不管是不同浓度BIO连续作用48小 时， 还是同一浓度BIO作用在不同的12小时时间窗， 侧线神经丘毛细胞的再生数目相较于对 照组没有显著性变化(P0.5)。 这说明Wnt/ -catenin信号通路对顺铂损伤后毛细胞的再 生不是充分条件。 0042 A： 抑制Wnt/ -catenin信号通路后再生毛细胞数目降低。 图中用到的Wnt/ - catenin信号通路抑制剂有FH535和XAV939， 两者都可降低进入细胞核内 -catenin， 从而使 Wnt信号通路不能有效的作用于下游靶基因。 图中给出抑制剂FH535。
38、的两种使用方式： 不 同浓度浸泡相同时间， 即0.1 M、 0.01 M和0.001 M FH535连续浸泡48小时； 同一浓度浸泡 不同的时间长度， 即0.1 M FH535在再生的前12小时分别浸泡2h、 4h、 8h和12h。 B： 增强Wnt/ -catenin信号通路后再生毛细胞数目没有变化。 图中用到的经典Wnt信号通路增强剂为 BIO， 可以抑制GSK3 ， 使 -catenin进入细胞核的数量增加。 图中给出增强剂BIO使用方式有 两种： 不同浓度作用相同时间， 即1 M、 0.1 M和0.01 M BIO连续浸泡48小时； 同一浓度 作用在不同的时间窗， 即1 M BIO分别作用在毛细胞再生时期的012h、 1224h、 2436h 和3648h。 0043 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征及本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108524936 A 8 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/1 页 9 CN 108524936 A 9 。