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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810546910.8 (22)申请日 2018.05.31 (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人 金维华 钟卫鸿 刘兵 任郎郎 江迪 唐宏 吴万里 何新月 方秋福 (74)专利代理机构 杭州之江专利事务所(普通 合伙) 33216 代理人 朱枫 (51)Int.Cl. A61K 31/702(2006.01) A61K 31/7024(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A23L 33/1。
2、25(2016.01) (54)发明名称 甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物在 制备抗氧化保健品和药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫 酸化衍生物在制备抗氧化保健品和药物中的应 用； 甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物具有 显著的抗氧化作用， 可以消除超氧阴离子自由 基， 有机自由基和羟自由基等， 可以用于制备的 抗氧化药物和保健品。 权利要求书2页 说明书6页 附图8页 CN 108542910 A 2018.09.18 CN 108542910 A 1.甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物在制备抗氧化保健品和药物中的应用； 其特 征在于： 所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖。
3、及其硫酸化衍生物的结构式为下述一般式(I)或(II) 中的一种或二种； 式(I)中， R为SO3Na， SO3H， SO3K或者H的一种或二种以上； R 为H、 Na或K中的一种或二种 以上， n为0-8之间的整数； 式(II)中， R为SO3Na， SO3H， SO3K或者H的一种或二种以上； R 为H、 Na或K中的一种或二种 以上， n为0-8之间的整数。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物具有如下特征： (1)组成糖： 甘露糖和葡糖糖醛酸或其盐； (2)2-连接的甘露糖和4-连接的葡萄糖醛酸或其盐交替连接； (3)其中硫酸化衍生物是指。
4、甘露糖和葡萄糖醛酸残基上均可能有硫酸化取代。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述药物为包含甘露葡萄糖醛酸寡糖及其 硫酸化衍生物以及其它药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述药物的剂型为注射剂、 口服制剂或局 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 108542910 A 2 部给药制剂。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 108542910 A 3 甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物在制备抗氧化保健品 和药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物在抗氧化 。
5、保健品和药物中的应用。 背景技术 0002 自由基是单质均裂产生的带有未成对电子的原子或基团， 是无处不在的， 自由基 对人体攻击的途径是多方面的， 既有来自体内的， 也有来自外界的。 当人体中的自由基超过 一定的量， 并失去控制时， 这些自由基就会乱跑乱窜， 去攻击细胞膜， 去与血清抗蛋白酶发 生反应， 甚至去跟基因抢电子， 对我们的身体造成各种各样的伤害， 产生各种各样的疑难杂 症。 研究表明其与多种疾病的发生有密切的关系， 如神经退行性疾病， 肿瘤， 衰老等。 所以能 够有效抑制自由基的产生在一定意义上具有预防和治愈相关疾病。 0003 寡糖具有多种作用， 如影响机体肠道生态和生理的作用。
6、， 抗凝血， 抗炎， 提高机体 免疫， 抗老年痴呆等活性。 如中国专利201410092395.2， 公开了甘露葡萄糖醛酸寡糖在制备 治疗或预防 帕金森 病和/或老年痴呆药物 和/或 在保健品中的 应 用 ； 中国 专利 201510648272.7， 公开了甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物在制备治疗和/或预防肾病药物 或保健品中的应用。 0004 到目前为止， 未有关于甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物在制备抗氧化保健 品和药物中的应用。 发明内容 0005 甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物在制备抗氧化保健品和药物中的应用。 所 述的硫酸化甘露葡糖醛酸寡糖具有如下特征： 0006 (1)组成糖。
7、： 甘露糖和葡糖糖醛酸或其盐； 0007 (2)2-连接的甘露糖和4-连接的葡萄糖醛酸或其盐交替连接； 0008 (3)其中硫酸化衍生物是指甘露糖和葡萄糖醛酸残基上均可能有硫酸化取代。 0009 (4)其结构式为下述一般式(I)或(II) 说 明 书 1/6 页 4 CN 108542910 A 4 0010 0011 式(I)中， R为SO3Na， SO3H， SO3K或者H的一种或二种以上； R 为H、 Na或K中的一种或 二种以上， n为0-8之间的整数； 0012 0013 式(II)中， R为SO3Na， SO3H， SO3K或者H的一种或二种以上； 0014 R 为H、 Na或K中。
8、的一种或二种以上， n为0-8之间的整数。 0015 所述药物为含有甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物和药学可接受的载体和/ 或赋形剂的药物组合物。 0016 载体包括海藻酸钠微球、 脂质体等。 0017 赋形剂： 如甘露醇、 硬脂酸镁、 淀粉、 环糊精等。 0018 所述药物的剂型为注射剂、 口服制剂或局部给药制剂。 0019 本发明的甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物具有显著地抗氧化作用， 毒副作 用小， 安全有效， 可以用于制备抗氧化药物和保健品。 附图说明 0020 图1寡糖制备过程中酒精洗脱液的凝胶色谱图； 说 明 书 2/6 页 5 CN 108542910 A 5 0021 图2。
9、甘露葡萄糖醛酸寡糖G1-G4的ESI-MS图和HPLC图a为G4； b 为G3； c为G2； d为G1； 0022 图3硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM2S1的ESI-MS图； 0023 图4硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM2S2的ESI-MS图； 0024 图5硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM4S1的ESI-MS图； 0025 图6硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM4S2的ESI-MS图； 0026 图7硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM4S3的ESI-MS图； 0027 图8硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM6S1的ESI-MS图； 0028 图9硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM6S2的ESI-MS图； 0029 图10硫。
10、酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM6S3的ESI-MS图； 0030 图11甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的去除羟自由基活活性； 0031 图12甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的去除超氧自由基活性； 0032 图13甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的还原能力活性； 0033 图14甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的去除有机自由基活性 (DPPH)。 具体实施方式 0034 下面用实施例对本发明进行具体说明， 不过本发明并不只限于以下实施案例范 围。 0035 实施例1甘露葡萄糖醛酸寡糖的制备 0036 将干海带采用30倍质量的蒸馏水100下提取3小时， 提取液经过过滤， 浓缩后， 加 乙醇。
11、至终浓度为75沉淀， 静置12小时后收集沉淀， 沉到经真空干燥得到海带多糖。 将海带 多糖样品溶于质量浓度为4的硫酸溶液中(料液比为60mg/mL)加热回流5小时， 用氢氧化 钡中和至PH6-7， 离心， 上清液浓缩至原始体积的五分之一， 浓缩液上活性炭柱层析， 首先 用蒸馏水平衡， 然后用50-90乙醇梯度洗脱， 将50-90乙醇洗脱液浓缩至原始体积 的五分之一， 蒸去乙醇， 直接上Bio-gel P4柱层析， 分离得到五个组分， 对上面收集得到的 样品进行ESI-MS和HPLC分析， 如图1和2所示。 结果进一步确认寡糖的结构。 结果显示， G1-G4 分别为甘露葡萄糖醛酸八糖， 六糖， 。
12、四糖和二糖。 其结构均符合下式所示的结构式： 0037 0038 其中G1为甘露葡萄糖醛酸八糖， 式中n3； 0039 G2为甘露葡萄糖醛酸六糖， 式中n2； 说 明 书 3/6 页 6 CN 108542910 A 6 0040 G3为甘露葡萄糖醛酸四糖， 式中n1； 0041 G4为甘露葡萄糖醛酸二糖， 式中n0。 0042 实施例2硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM2S1的制备 0043 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G4(甘露葡萄糖醛酸二糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入3.30g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 。
13、中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM2S1。 质谱(如下图3)结果显示GM2S1为GlcAMan(SO3H)3-6。 0044 实施例3硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM2S2的制备 0045 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G4(甘露葡萄糖醛酸二糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入1.80g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM2S1。 质谱(如下图4)结果显示GM2S1为Glc。
14、AMan(SO3H)1-3。 0046 实施例4硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM4S1的制备 0047 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G3(甘露葡萄糖醛酸四糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入3.54g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM4S1。 质谱(如下图5)结果显示GM4S1为GlcA2Man2(SO3H)8-11。 0048 实施例5硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM4S2的制备 0049 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体。
15、G3(甘露葡萄糖醛酸四糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入2.19g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM4S2。 质谱(如下图6)结果显示GM4S2为GlcA2Man2(SO3H)5-9。 0050 实施例6硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM4S3的制备 0051 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G3(甘露葡萄糖醛酸四糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入0.93g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应。
16、 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM4S3。 质谱(如下图7)结果显示GM4S3为GlcA2Man2(SO3H)1-5。 0052 实施例7硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM6S1的制备 0053 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G2(甘露葡萄糖醛酸六糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入2.85g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM6S1。 质谱(如下图。
17、8)结果显示GM6S1为GlcA3Man3(SO3H)8-15。 0054 实施例8硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM6S2的制备 0055 将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G2(甘露葡萄糖醛酸六糖)在氮气保 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入2.09g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM6S2。 质谱(如下图9)结果显示GM6S2为GlcA3Man3(SO3H)4-10。 0056 实施例9硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖GM6S3的制备 0057 将实。
18、施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体G2(甘露葡萄糖醛酸六糖)在氮气保 说 明 书 4/6 页 7 CN 108542910 A 7 护条件下溶于DMF(0.05g/ml)中， 再加入1.17g 三氧化硫吡啶盐， 室温搅拌24小时。 将反应 液倒入4倍冰蒸馏水中， 中和， Sephadex G10脱盐。 将洗脱液浓缩， Bio-gel P4分离纯化得到 GM6S3。 质谱(如下图10)结果显示GM6S3为GlcA3Man3(SO3H)1-6。 0058 实施例10甘露葡萄糖醛酸及其硫酸化衍生物的抗氧化活性 0059 将实施例1-9中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物用于抗氧化活性测 定。。
19、 抗氧化活性包含以下四个方面： 去除羟自由基， 去除超氧阴离子自由基， 去除DPPH自由 基和还原能力来反映甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的抗氧化活性。 1， 去除羟自由 基的作用的测定采用如下方法： 将2mmol/L乙二胺四乙酸-铁盐(0.5mL)， 磷酸钠缓冲液 (150mM,pH7.4,1mL)， 番红花(溶于磷酸缓冲液， 1mL)和3过氧化氢分别按序的加入不 同浓度的样品液中(1mL)， 然后37水浴30min， 520nm测定吸光度。 对照组采用蒸馏水替代 样品。 清除活性A样/A对照100。 2， 去除超氧自由基的作用的测定采用如下方法： 将 0.5mL还原型辅酶(NADH)(。
20、0.0365)， 0.5mL四唑氮蓝(NBT)(0.0246)和0.5mL吩嗪硫酸甲 酯(0.002)按序列加入不同浓度的样品液(3mL， 样品以16mmol/L， pH8的三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐缓冲液溶解)。 对照组， 采用缓冲液替代样品液。 清除活性(1-A样/A对照) 100。 3， 去除DPPH自由基的作用的测定采用如下方法： 将1mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加 入到不同浓度的样品溶液中(3mL， 样品用50乙醇溶解)， 剧烈摇动， 室温放置20min， 最后 在517nm测定。 对照组， 采用50乙醇替代样品液。 清除活性 (1-A样/A对照)100。 4， 还 原能。
21、力的测定采用如下方法， 将1.25mL 铁氰化钾(1)加入到不同浓度的样品溶液中 (1mL)， 然后50水浴 20min， 加入三氯乙酸(2.5mL)停止反应， 最后加入三氯化铁(1.5mL), 700nm测定吸光度。 0060 对羟基自由基的清除作用说明了样品对Fenton体系产生的自由基的清除作用。 图 11说明了所有样品都具有明显的对羟基自由基的清除作用， 且呈现一定的浓度依赖性。 比 较甘露葡萄糖醛酸寡糖的抗羟自由基活性， 可以发现四糖的活性好于二糖和六糖。 在硫酸 化程度方面， 低硫酸化二糖和四糖的活性要高于高硫酸化二糖和四糖； 但是高硫酸化六糖 的活性要高于低硫酸化二糖和四糖的活性。
22、。 整体来讲， 四糖和低硫酸化四糖的活性最好。 比 较褐藻多糖硫酸酯(7mg/ml浓度下， 其活性只有30)， 可以发现寡糖的羟自由基活性要远 远高于褐藻多糖硫酸酯。 有文献报道了两种去除羟自由基的机制： 第一种机制为抑制羟基 自由基的产生， 第二种为去除已产生的羟自由基。 前者的机制与螯合金属离子有关， 这取决 于分子量， 硫酸根含量和糖醛酸含量。 因此推测其主要可能与抑制羟自由基的产生有关。 0061 尽管超氧化物在机体中是一个弱的氧化剂， 但是它可以持续的降解， 产生一系列 新的活化的活性氧， 从而间接地导致脂质的过氧化反应或直接地导致疾病的发生， 如关节 炎， 老年痴呆等。 因此有必要。
23、讨论清除超氧阴离子自由基的活性和神经保护活性的关系。 图 12显示了甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的清除超氧阴离子作用。 从图中可以看 出， 多糖的浓度与活性呈现一定的浓度依赖性。 相比于硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖衍生物， 甘露葡萄糖醛酸寡糖单体的羟自由基活性要远远小于硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖衍生物； 且硫酸化程度越高， 在一定程度上抗超氧自由基活性也越强， 聚合度为2时， 这种情况最明 显， 但是在聚合度为4和6时， 抗超氧自由基活性的变化相对较小。 最后， 寡糖单体的抗超氧 自由基活性与寡糖的聚合度有关， 聚合度越大， 抗超氧自由基活性越强； 因此推测寡糖的聚 合度与硫酸化程度在一定程度。
24、上与抗超氧自由基存在一定关系。 相比较褐藻多糖硫酸酯， 说 明 书 5/6 页 8 CN 108542910 A 8 可以发现褐藻多糖硫酸酯(50 g/ml的浓度时， 其活性可以达到80)的活性远远好于寡糖 及其硫酸化衍生物(GM4S3样品在 0.22mg/ml的浓度时， 其活性可以达到98)。 0062 还原能力实验主要用于测定样品对三价铁和铁氰化物的还原能力， 作为抗氧化能 力的一个重要指标。 图13显示： 甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物的还原能力与样品 的浓度呈正线性相关。 比较甘露葡萄糖醛酸寡糖， 可以发现其与聚合度有关， 聚合度越大， 相对活性越强。 比较硫酸化程度， 可以发现在。
25、低硫酸化二糖和四糖的活性相对高于高硫酸 化二糖和四糖， 然而六糖及其硫酸化衍生物活性的现象仍无法解释。 比较褐藻多糖硫酸酯 (2.5mg/ml浓度时其还原能力约为0.1)， 甘露葡萄糖醛酸寡糖的活性略高于褐藻多糖硫酸 酯。 0063 与上述三种抗氧化活性方法相比， 对DPPH自由基的清除作用实验(图 14)相对省 时和快速。 其结果并不与还原能力实验呈线性相关。 但是所有样品呈现浓度正依赖性。 比较 甘露葡萄糖醛酸寡糖， 可以发现其与聚合度有关， 聚合度越大， 相对活性越强。 比较硫酸化 程度， 可以发现在低硫酸化二糖和四糖的活性相对高于高硫酸化二糖和四糖， 然而六糖及 其硫酸化衍生物活性的现。
26、象仍无法解释。 比较低分子量褐藻多糖硫酸酯(7mg/ml浓度时其 去除有机自由基的能力约为80)， 甘露葡萄糖醛酸寡糖的活性略高于褐藻多糖硫酸酯。 说 明 书 6/6 页 9 CN 108542910 A 9 图1 说 明 书 附 图 1/8 页 10 CN 108542910 A 10 图2 说 明 书 附 图 2/8 页 11 CN 108542910 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 3/8 页 12 CN 108542910 A 12 图5 图6 说 明 书 附 图 4/8 页 13 CN 108542910 A 13 图7 图8 说 明 书 附 图 5/8 页 14 CN 108542910 A 14 图9 图10 说 明 书 附 图 6/8 页 15 CN 108542910 A 15 图11 图12 说 明 书 附 图 7/8 页 16 CN 108542910 A 16 图13 图14 说 明 书 附 图 8/8 页 17 CN 108542910 A 17 。