技术领域
本发明涉及氧化铁组装体的制备领域，具体涉及一种pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体的制备方法及产品和应用。
背景技术
癌症是威胁全球人类生命的最大杀手之一，是当前医学研究领域所面临的一个重大挑战。据统计，癌症已成为中国城市居民第一位死亡原因。有效地诊断早期癌症已是科学研究中的当务之急。
磁共振成像(MRI)技术在癌症临床诊断中被广泛使用。为了提高肿瘤区域与正常区域的对比度往往需要引入造影剂。目前广泛研究的响应型氧化铁组装体能使得肿瘤区域的磁共振信号减弱而达到对比的目的，但其容易同其他的暗区域病变组织相混淆。
近期研究报告的超小氧化铁纳米粒子能显著提高磁共振信号值。然而，传统的手段往往是使用高分子聚合物包裹超小氧化铁纳米粒子形成生物环境响应型纳米胶束载体，由于较厚的高分子层对水穿透的阻碍以及极低浓度下不稳定等因素，其在体内的成像效果和生物利用度受到了极大的限制。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体的制备方法，主要引入亲水的小分子配体使超小氧化铁纳米粒子化学交联成具有pH响应型纳米组装体，使其具备良好的生物利用度和成像效果。
本发明所提供的技术方案为：
一种pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体的制备方法，包括如下步骤：
1)将油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子与具有羧基的小分子进行配体交换反应，得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子；
2)羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子与具有联氨基的小分子进行酰胺化反应，得到联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子；
3)联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子与具有多醛基的化合物进行醛胺缩合反应，得到pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体。
本发明中油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子分别经过配体交换反应和酰胺化反应，使其端部具有-CO-NH-NH2结构，具有多醛基的化合物继续与联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行醛胺缩合反应，通过化学交联形成pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体，其中具有多醛基的化合物起到交联作用，使得相互之间形成-NH-N＝CH-结构，而-NH-N＝CH-结构是组装体具有pH响应的关键。
本发明中化学交联形成的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体能在极低浓度下稳定存在，不受临界胶束浓度的限制，在酸性肿瘤部位获得较高的磁共振信号增强。其次，借助其独特的纳米级尺寸，通过高通透性和滞留效应(EPR效应)可以实现肿瘤组织靶向。入胞后，在酸性环境下刺激超小氧化铁纳米粒子组装体解散开为很多个超小尺寸氧化铁纳米粒子，使得肿瘤部位信号值得到提高；相比于肿瘤部位，滞留在正常组织的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体量很少，因此正常组织的信号值基本不变，从而达到肿瘤部位靶向成像的目的。
本发明中油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子的粒径为3～4nm，由于表面包覆有油酸只能溶于油相溶剂，油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子的制备已经公开在J.Am.Chem.Soc.2011,133,12624–12631。
作为优选，所述油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子的制备方法包括：
(1)将油酸钠和六水合三氯化铁溶解在水、乙醇和己烷的混合溶液中，在50～80℃条件下搅拌2～6小时，油相部分萃取并烘干得到油铁复合物；
(2)将步骤(1)中油铁复合物溶解在油醇、油酸和二苯醚的混合溶液中，氩气保护下在200～280℃下搅拌，经不良溶剂沉淀，得到油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子。
作为优选，所述步骤(1)中油酸钠、六水合三氯化铁、水、乙醇和己烷的投料比为30～80g:10～20g:50～150mL:50～200mL:100～300mL。
作为优选，所述步骤(2)中油铁复合物、油醇、油酸和二苯醚的投料比为0.5～2g:0.5～2g:0.3～0.6g:5～15g。
作为优选，所述步骤(2)中不良溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、乙醚和二甲亚砜中的一种或多种。
作为优选，所述步骤1)中配体交换反应包括：将油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子加入到混合溶剂中，加入具有羧基的小分子，80-120℃下反应，得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子；所述混合溶剂由良溶剂和不良溶剂组成。配体交换反应主要是为了将包覆在超小氧化铁纳米粒子表面的油酸替换为具有羧基的小分子，使得超小氧化铁纳米粒子表面修饰有羧基，由油相转化为水相。具有羧基的小分子是指分子量小于1000道尔顿的含有羧基的化合物。
作为优选，所述步骤1)中油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子与具有羧基的小分子的投料比为10～120mg:100mg～250mg。
作为优选，所述步骤1)中配体交换反应后，产物羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子经不良溶剂沉淀得到。
作为优选，所述步骤1)中良溶剂为三氯甲烷、正己烷、邻二氯苯、石油醚、四氢呋喃、甲苯、苯中一种或多种；所述不良溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、乙醚、丙酮、甲醇中一种或多种。
作为优选，所述步骤1)中具有羧基的小分子为柠檬酸、左旋多巴、乙二酸、琥珀酸、十六碳二酸中的一种或几种。
作为优选，所述步骤2)中酰胺化反应包括：将羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子与催化剂加入到良溶剂中，加入具有联氨基的小分子，常温下反应，得到联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子。具有联氨基的小分子与超小氧化铁纳米粒子表面修饰的羧基通过酰胺化反应，得到-CO-NH-NH2结构。具有联氨基的小分子是指分子量小于1000道尔顿的含有多个联氨基的化合物，至少包含两个联氨基。
作为优选，所述步骤2)中羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子与具有联氨基的小分子的投料比为20～100mg:1～5g。
作为优选，所述步骤2)中具有联氨基的小分子为水合肼、草酰二肼、己二酸二酰肼、氨基甲酰肼、碳酰肼中的一种或多种。
作为优选，所述步骤2)中催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺中一种或多种。
作为优选，所述步骤2)中良溶剂为水、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈中一种或多种。
作为优选，所述步骤2)中酰胺化反应后，产物联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子经透析得到。
作为优选，所述步骤3)中醛胺缩合反应包括：将联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子、催化剂以及具有多醛基的化合物加入到良溶剂中，70-90℃下反应反应，得到pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体。其中具有多醛基的化合物是指含有多个醛基的有机分子，至少包含2个醛基，通过具有多醛基的化合物的交联作用，形成-NH-N＝CH-结构。
作为优选，所述步骤3)中联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子与具有多醛基的化合物的投料比为1～60mg:1～100mg。
作为优选，所述步骤3)中具有多醛基的化合物为戊二醛、丁二醛、己二醛、均苯三甲醛、1,3,5-三(4-苯甲醛)苯、氯化4,4’,4”-(1,3,5-三嗪-2,4,6-三)三-1-(4-苯甲醛)吡啶、2,4,6-三(4-醛基苯基)-1,3,5-三嗪、三醛基间苯三酚中一种或多种。
作为优选，所述步骤3)中催化剂为三氟乙酸、盐酸、硫酸、乙酸中一种或几种。
作为优选，所述步骤3)中良溶剂为水、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇中一种或几种。
本发明还提供一种如上述的制备方法制备得到的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体。pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体具备良好的生物利用度和成像效果，显著提高酸性肿瘤区域的磁共振信号值。
本发明还提供一种如上述的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体在制备肿瘤磁共振成像造影剂中的应用。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明中的反应体系温和，条件可控，所制备的材料均具有良好的生物相容性和利用度，具有良好的临床转化可能性。
(2)本发明中的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体，在酸性环境下刺激介导超小氧化铁纳米粒子组装体解散开为很多个超小尺寸氧化铁纳米粒子，使得肿瘤部位信号值得到提高。
(3)本发明中的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体不受临界胶束浓度的限制，在极低浓度下仍能安全稳定存在。
附图说明
图1为实施例1中油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图2为实施例2中羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图3为实施例3中羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图4为实施例4中羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图5为实施例5中联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图6为实施例6中联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图7为实施例7中联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子的透射电镜图；
图8为实施例8中pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体在pH 7.4和pH5.5时的透射电镜图；
图9为实施例8中pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体在pH 7.4和pH5.5时的动态光散射粒度分布图；
图10为实施例8中水化粒径随着浓度的降低变化图；
图11为实施例8中磁共振信号在pH变化下的可逆变化图；
图12为实施例9中pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体在pH 7.4时的透射电镜图；
图13为实施例10中pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体在pH 7.4时的透射电镜图；
图14为应用例中肿瘤区域磁共振信号随着时间变化图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例和附图作进一步说明。
实施例1：油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子的合成
(1)将10g的六水合三氯化铁和36g的油酸钠溶于80mL乙醇、60mL水和140mL己烷混合溶液中，70℃搅拌4个小时。反应结束后，油相部分经水萃取获得并烘干得到油铁复合物。
(2)取油铁复合物1.8g溶于0.6g油酸、1.6g油醇和10g二苯醚混合溶液中，氩气保护下升温至250℃，并保持该温度搅拌30分钟，反应冷却后加入丙酮沉淀并离心得到油相的超小氧化铁纳米粒子，纳米粒尺寸在3～4nm。
对制备得到的油酸包覆的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图1所示。
实施例2：羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子的合成
将100mg的油酸修饰的超小氧化铁纳米粒子溶于7.5ml的邻二氯苯中，加入100mg的柠檬酸和7.5ml N,N-二甲基甲酰胺。在氩气的保护状态下，100度搅拌24小时。反应结束后，加入乙醚和丙酮进行沉淀，离心得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子。
对制备得到的羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图2所示。
实施例3：羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子的合成
参照实施例2的制备工艺进行合成，不同之处在于，所加入的油酸修饰的超小氧化铁纳米粒子改为20mg，同样得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子。
对改变方法制备得到的羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图3所示。
实施例4：羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子的合成
参照实施例2的制备工艺进行合成，不同之处在于，反应过程中所加入的良溶剂改为三氯甲烷，同样得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子。
对改变方法制备得到的羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图4所示。
实施例5：联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子的合成
称取250mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和200mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于20ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，加入20mg羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子。后加入4g水合肼，经透析离心得到联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子。
对制备得到的联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图5所示。
实施例6：联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子的合成
参照实施例5的制备工艺进行合成，不同之处在于，所加入羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子改为50mg，同样得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子。
对制备得到的联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图6所示。
实施例7：联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子的合成
参照实施例5的制备工艺进行合成，不同之处在于，反应中所加入的联氨基的小分子改为己二酸二酰肼，同样得到羧基修饰的超小氧化铁纳米粒子。
对制备得到的联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图7所示。
实施例8：pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体的合成
将20mg的氯化4,4’,4”-(1,3,5-三嗪-2,4,6-三)三-(1-(4-苯甲醛)吡啶和5mg联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子溶于15ml水中，加入50μl的三氟乙酸。在70℃下搅拌8小时。反应结束后，透析得到pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体。
利用透射电子显微镜对得到的纳米组装体在pH 7.4和pH 5.5进行形貌表征，结果如图8所示。
利用动态光散射分析在pH 7.4和pH 5.5时其纳米组装体的粒度分布，结果如图9所示。
利用动态光散射分析其随着浓度降低的粒径变化，结果如图10所示。
利用磁共振图像分析其纳米组装体在pH的变化下信号值的可逆变化，结果如图11所示。
以上结果均证明，该种pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体在不同pH条件下结构可以发生明显的可逆变化，同时能在极低浓度的中性环境中稳定存在。
实施例9：pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体的合成
参照实施例8的制备工艺进行合成，不同之处在于，所加入的联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子改为20mg，同样得到pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体。
对制备得到的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图12所示。
实施例10：pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体的合成
参照实施例8的制备工艺进行合成，不同之处在于，所加入的联氨基修饰的超小氧化铁纳米粒子改为2mg，同样得到pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体。
对制备得到的pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体进行透射电子显微镜进行形貌表征，如图13所示。
应用例：pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体对于肿瘤区域磁共振成像的应用
用雄性裸鼠造皮下肺癌(所选细胞株为A549)模型，瘤尺寸5～6mm。通过尾静脉注射pH响应型超小氧化铁纳米粒子组装体(按照本实施例8方法制得)，之后观察不同时间点肿瘤区域信号变化情况，具体变化如图14所示。随着时间的延长，肿瘤部位逐渐变亮，说明该组装体能很好的富集在肿瘤部位同时对肿瘤的酸性环境有极高的响应性，使其具有良好的磁共振成像效果。
以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。