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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810417787.X (22)申请日 2018.05.04 (71)申请人 重庆市人民医院 地址 400014 重庆市渝中区枇巴山正街104 号 (72)发明人 李必波 罗治彬 何美 李必强 (74)专利代理机构 重庆启恒腾元专利代理事务 所(普通合伙) 50232 代理人 万建 (51)Int.Cl. A61K 9/127(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 47/12(2006.01) A61K 。
2、47/36(2006.01) A61K 47/22(2006.01) A61K 31/4168(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 33/24(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 49/08(2006.01) A61K 49/12(2006.01) A61K 49/18(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 15/00(2011.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体及其制 备方法 (57)摘要 本发明公开了一种SPIO示踪的pH敏感载。
3、药 脂质体， 采用如下质量配比获得： 原料药110 份， 磷脂酰乙醇胺150份， 胆固醇130份， 亚油 酸130份， 羧甲基壳聚糖010份， 超顺磁性氧 化铁纳米颗粒010份。 本发明还公开了一种 SPIO示踪的pH敏感载药脂质体的制备方法： S1： 取磷脂酰乙醇胺、 胆固醇和亚油酸于烧瓶内， 加 入氯仿进行溶解， 加入水溶性药物溶液进行超声 形成W/O型乳剂； S2： 在减压条件下进行蒸发至凝 胶状态； 加入缓冲液， 继续蒸发形成水性悬浮液； S3： 加入超顺磁性氧化铁纳米颗粒后将脂质体混 悬液冻融3次； 离心除去水性悬浮液未包入的超 顺磁性氧化铁纳米颗粒以及水溶性药物； S4： 加 入羧。
4、甲基壳聚糖溶液， 进行水合。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 108542884 A 2018.09.18 CN 108542884 A 1.一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体， 其特征在于， 包括原料药、 辅料和示踪剂， 所述 原料药为水溶性药物或脂溶性药物中的一种， 所述辅料包括磷脂酰乙醇胺、 胆固醇、 亚油酸 和羧甲基壳聚糖， 所述示踪剂为超顺磁性氧化铁纳米颗粒， 所述SPIO示踪的pH敏感载药脂 质体采用如下质量配比获得： 原料药110份， 磷脂酰乙醇胺150份， 胆固醇130份， 亚油 酸130份， 羧甲基壳聚糖010份， 超顺磁性氧化铁纳米颗粒010份。 2.如权利要。
5、求1所述的一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体， 其特征在于， 所述水溶性药 物包括阿霉素、 表阿霉素、 吡阿霉素、 长春新碱、 依托泊苷、 顺铂、 奈达铂、 卡铂、 吉西他滨、 羟 喜树碱以及米索硝唑； 所述脂溶性药物包括紫杉醇、 多烯紫杉醇、 喜树碱。 3.如权利要求1所述的一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体， 其特征在于， 所述辅料还包 括二油酰磷脂酰乙醇胺、 卵磷脂、 氢化大豆卵磷脂、 磷脂酰肌醇、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 聚 乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 胆固醇半琥珀酸酯、 棕榈酰同型半胱氨酸、 油酸、 维生素 E、 金属络合剂和叔丁基对羟基茴香醚中的一种或者任意几种的组合。 4。
6、.一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1： 取磷脂酰乙醇胺150份、 胆固醇130份和亚油酸130份于烧瓶内， 加入氯仿进 行溶解， 然后加入110份的水溶性药物溶液进行超声， 直至形成均匀的W/O型乳剂； S2： 将烧瓶与旋转蒸发仪连接， 在减压条件下进行蒸发， 形成凝胶状态； 向烧瓶内加入1 10份pH为7.4的PBS缓冲液， 继续在减压条件下蒸发形成水性悬浮液； S3： 加入010份的超顺磁性氧化铁纳米颗粒后将水性悬浮液先后置-80、 50进行 冻融， 重复3次； 然后利用高速离心法除去水性悬浮液未包入的超顺磁性氧化铁纳米颗粒以 及水溶性药物。
7、， 得到脂质体混悬液； S4： 向脂质体混悬液中加入010份质量百分数为0.3的羧甲基壳聚糖溶液， 进行水 合30min， 超声并过微孔滤膜得到SPIO示踪的pH敏感载药脂质体。 5.如权利要求4所述的一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体的制备方法， 其特征在于， 步 骤S1中， 还包括维生素E作为氧化剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108542884 A 2 一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及pH敏感脂质体技术领域， 具体涉及一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体 及其制备方法。 背景技术 0002 脂质体(liposome)系指一。
8、种具有类似生物膜结构的双层脂分子微型泡囊体， 直径 251000nm不等， 可用作亲水性或/和疏水性的药物载体。 具有靶向性、 淋巴定向性、 缓释 性、 降低药物毒性、 提高药物稳定性的特点。 0003 实体恶性肿瘤快速无序的生长方式， 使其血管生成不充分， 血氧供应不足， 导致肿 瘤内出现乏氧细胞。 乏氧细胞的存在导致肿瘤间质处的pH值(6.5或以下)较正常组织间质 处的pH值(7.4)低， 这为pH敏感脂质体(pH sensitive liposomes)提供了理论依据。 pH敏感 脂质体是一种对pH敏感的脂质体， 采用具有pH敏感性的膜材制成， 其结构中的脂质双分子 层的稳定性随环境pH。
9、变化而变化， 同时也可称其为酸敏脂质体。 当载药脂质体随血液循环 到达肿瘤部位时， 由于间质处pH的降低导致膜材质子化引起囊泡结构破坏， 药物得以释放， 即可实现肿瘤的靶向性。 0004 早期pH敏感脂质体的研究主要通过选择不同磷脂来实现脂质体pH敏感性。 这种pH 敏感脂质体主要由pH敏感性化合物以及不饱和脑磷脂(phosphatidylethanolamine,PE)组 成的， 其中常用的PE是二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,DOPE)。 而pH敏感脂质化合物的亲水部分多含有羧基等pH敏感性基团， 如油酸(oleicacid,OA)、 。
10、胆 固醇半琥珀酸酯(cholesteryl hemisuccinate,CHEMS)和棕榈酰同型半胱氨酸(Palmitoyl homocysteine,PHC)等。 不饱和脑磷脂为圆锥形， 亲水端小亲油端大， 而pH敏感脂质化合物 的羧酸基在中性条件下， 为倒圆锥形， 亲水端大亲油端小， 于是两者互补形成了脂质体双层 膜并稳定于中性环境。 当pH降低至酸性时， 羧酸基将会发生质子化， 亲水端体积将会相对减 小， 在立体构象上不能与不饱和脑磷脂互补， 导致脂质体不稳定。 各种不同的pH敏感的脂质 体可以通过调节脂质的组成比例或者改变膜材种类而获得。 Zhang hong等采用PE/CHO/OA 。
11、(6:2:3W/W)为膜材， 制备了紫杉醇pH敏感脂质体， 体外试验表明在pH 5.0溶液中的累计释 放度是在pH 7.4溶液的1.3倍。 小鼠体内试验表明： 其t1/2及AUC分别是紫杉醇的1.8倍及2.6 倍。 左甜甜等采用亚油酸替代油酸， 与PE、 CHO按比例结合(16:24:8， W/W)制备了多西他赛pH 敏感脂质体， 体外释放度试验示72h内在pH 5.0溶液及pH 7.4溶液的的累计释放度分别是 87.81及65.21， 表明其具有明显的pH敏感性。 Kim Min-Jung等采用DOPE和CHEMS制备了 以表皮生长因子受体为靶点的pH敏感长循环免疫脂质体， 当DOPE/CH。
12、EMS(摩尔比)为6： 4时， 所得脂质体在pH5.5溶液中显示出较强的酸敏性， 将吉西他滨包裹于带有抗体的pH敏感脂 质体中， 其抑制A549癌细胞增殖的作用为游离药物的2倍。 0005 除pH敏感性化合物和不饱和脑磷脂可实现脂质体的pH敏感性外， 含有氨基和含有 羧酸基的pH敏感性高分材料也可以用来构建pH敏感脂质体， 常通过将pH敏感性高分子材料 修饰在脂质体外表面或者镶嵌在脂质体双层膜内而成。 具有氨基高分子材料如聚组氨酸和 说 明 书 1/5 页 3 CN 108542884 A 3 聚赖氨酸， 需要与负电荷脂质体相互融合才能构建pH敏感脂质体。 含有弱碱阳离子(-NH)基 团， 又。
13、含有弱酸阴离子(-COO-)基团的两亲性聚电解质羧甲基壳聚糖， 通过水化包裹于脂质 体表面， 其修饰后的脂质体体外释药显示了明显的pH敏感性， 其可能原因为羧甲基壳聚糖 上的氨基基团在低pH下的质子化运动， 使得修饰在脂质体表面的羧甲基壳聚糖的结构发生 变化， 挤压脂质体双层并使脂质体重排， 在重排过程中， 将包封的药物快速释放。 杨善祥等 选择羧甲基壳聚糖作为修饰剂， 制备pH敏感阿霉素纳米脂质体， 体外试验表明阿霉素在中 性和弱碱性条件下的药物释放相对缓慢， 8h时药物累积释放率仅40， 在接近肿瘤细胞pH 的弱酸性条件和酸性条件下， 8h时药物累积释放率达60以上， 且药物释放量随缓释介。
14、质 pH降低而增大， 说明阿霉素纳米脂质体经羧甲基壳聚糖修饰后具有pH敏感性。 0006 综上所述， 通过pH敏感性化合物、 不饱和脑磷脂以及pH敏感性高分材料的两两组 合或单独使用， 制成的载药脂质体均具有一定的pH敏感性， 但仍存在所需pH条件值太低、 药 物释放时间太长、 累计释放度不足等特点。 0007 此外， 脂质体的高度pH敏感性是实现肿瘤靶向性的前提， 如何证实肿瘤靶向性又 是另一种挑战。 目前证实肿瘤靶向性的方法包括： 组织药物含量测定、 荧光素显影、 放射性 核素显影等。 国内学者余瑜等制备了高度肺靶向的前体脂质体， 在兔体内进行研究， 通过静 脉注射脂质体后， 处死兔获得各。
15、个脏器组织， 组织匀浆后提取药物成分， 通过HPLC进行组织 中药物浓度的检测， 获得药代动力学及组织分布学数据， 证实该脂质体具有高度的肺组织 靶向性。 国外学者Hong Myo-Sook以荧光剂为显影剂， 采用pH敏感的膜材将其包裹， 制备了 pH敏感脂质体， 并将脂质体置于离体人肺癌组织中考察pH敏感性， 结果显示该脂质体在2h 内将包裹的荧光剂释放达100， 而在离体鼠正常肝组织中8h内释放不足30， 表明其具有 高度pH敏感性。 国外学者Vildete Carmo， 以99mTc作为放射性示踪显影剂， 采用pH敏感的膜 材制备了99mTc-六甲基丙二基胺肟pH敏感脂质体(99mTc-。
16、SpHL)， 大鼠体内试验结果显 示， 99mTc-SpHL在人工构建的大鼠炎症足部(发生炎症60h后， 发炎组织的局部pH从原来正 常情况下的7.4降低到6.5)累计放射性水平为单纯药物的18倍， 表明该pH敏感脂质体具有 高度pH敏感性及靶向性。 以上三种证实靶向性的方法具有明显缺点， 如活体组织药物浓度 检测， 无法实时进行， 无法检测每个活体内动态的药物浓度变化； 荧光剂为显影剂主要在体 外细胞或离体组织显影； 99mTc具有明显放射性， 且半衰期短(6.02h)。 发明内容 0008 针对上述现有技术的不足， 本发明所要解决的技术问题是： 如何提供一种pH敏感 性明显、 示踪效果好、。
17、 制备工艺简单、 储存稳定的SPIO示踪的pH敏感载药脂质体及其制备方 法。 0009 为了解决上述技术问题， 本发明采用了如下的技术方案： 包括原料药、 辅料和示踪 剂， 所述原料药为水溶性药物或脂溶性药物中的一种， 所述辅料包括磷脂酰乙醇胺、 胆固 醇、 亚油酸和羧甲基壳聚糖， 所述示踪剂为超顺磁性氧化铁纳米颗粒， 所述SPIO示踪的pH敏 感载药脂质体采用如下质量配比获得： 原料药110份， 磷脂酰乙醇胺150份， 胆固醇1 30份， 亚油酸130份， 羧甲基壳聚糖010份， 超顺磁性氧化铁纳米颗粒010份。 0010 其中， 所述辅料还包括二油酰磷脂酰乙醇胺、 卵磷脂、 氢化大豆卵磷脂。
18、、 磷脂酰肌 醇、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 胆固醇半琥珀酸酯、 棕榈 说 明 书 2/5 页 4 CN 108542884 A 4 酰同型半胱氨酸、 油酸、 维生素E、 金属络合剂和叔丁基对羟基茴香醚中的一种或者任意几 种的组合。 0011 其中， 所述示踪剂为葡聚糖包裹的超顺磁性氧化铁纳米颗粒， 氧化铁纳米颗粒粒 径5nm， 包裹葡聚糖后粒径为30nm-35nm， 具有超顺磁性、 水溶性、 生物相容性。 超顺磁氧化铁 纳米颗粒为无放射显影剂， 在磁共振下通过降低组织的T2加权像信号的方式， 使MRI的背景 信号强度降低， 使病变组织得以清晰显像， 从而进行靶。
19、部位显影， 并可通过动态测定不同时 间点的信号值计算出靶向时间分布图。 0012 这样， 本发明SPIO示踪的pH敏感载药脂质体具有pH敏感性明显、 示踪效果好、 制备 工艺简单、 储存稳定的优点， 可作为水溶性或脂溶性药物的载体， 在低pH环境下结构破坏而 释药， 实现肿瘤部位的靶向性， 进而增加癌细胞对药物的吸收， 减少药物毒副作用， 并可实 现无放射性示踪及动态监测。 其中， 脂质体可以是混悬液， 也可以是冻干剂。 0013 本发明还公开了一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体的制备方法， 包括以下步骤： 0014 S1： 取磷脂酰乙醇胺150份、 胆固醇130份和亚油酸130份于烧瓶内，。
20、 加入氯 仿进行溶解， 然后加入110份的水溶性药物溶液进行超声， 直至形成均匀的W/O型乳剂； 0015 S2： 将烧瓶与旋转蒸发仪连接， 在减压条件下进行蒸发， 形成凝胶状态； 向烧瓶内 加入110份pH为7.4的PBS缓冲液， 继续在减压条件下蒸发形成水性悬浮液； 0016 S3： 加入010份的超顺磁性氧化铁纳米颗粒后将水性悬浮液先后置-80、 50 进行冻融， 重复3次； 然后利用高速离心法除去水性悬浮液未包入的超顺磁性氧化铁纳米颗 粒以及水溶性药物， 得到脂质体混悬液； 0017 S4： 向脂质体混悬液中加入010份质量百分数为0.3的羧甲基壳聚糖溶液， 进 行水合30min， 超。
21、声并过微孔滤膜得到SPIO示踪的pH敏感载药脂质体。 0018 其中， 所述水溶性药物为米索硝唑、 阿霉素、 表阿霉素、 吡阿霉素、 长春新碱、 依托 泊苷、 顺铂、 奈达铂、 卡铂、 吉西他滨以及羟喜树碱中任意一种。 0019 其中， 步骤S1中， 还包括维生素E作为氧化剂。 0020 综上所述， 本发明所提供的SPIO示踪的pH敏感载药脂质体具有pH敏感性高、 超顺 磁性好的优点， 为实现肿瘤靶向性、 降低药物毒性、 无放射性示踪奠定基础。 本发明还公开 了SPIO示踪的pH敏感载药脂质体的制备方法， 可以更好的对水溶性或脂溶性药物进行包 裹， 制备方法简单， 粒径分布均匀， 有利于工业化。
22、。 附图说明 0021 图1为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体在不同pH条件下米索硝唑的累积释放 度。 0022 图2为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体在不同pH条件下超顺磁性氧化铁纳米颗 粒的累计释放度。 0023 图3为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体粒径分布图。 0024 图4为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体电位图。 0025 图5为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体扫描电镜图。 0026 图6为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体透射电镜图。 0027 图7为SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体磁化曲线。 说 明 书 3/5 页 5 CN 108542884 A 5。
23、 具体实施方式 0028 下面列举部分配方实施例。 0029 实施例1： 一种SPIO示踪的pH敏感载药脂质体， 采用如下质量配比获得： 米索硝唑 2.5份， 磷脂酰乙醇胺30份， 胆固醇10份， 亚油酸10份， 羧甲基壳聚糖0.5份， 超顺磁性氧化铁 纳米颗粒0.5份， 维生素E 2份。 其中SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体在不同pH条件下米 索硝唑的累积释放度如说明书附图图1所示， SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体在不同pH 条件下超顺磁性氧化铁纳米颗粒的累计释放度如说明书附图图2所示， SPIO示踪的米索硝 唑pH敏感脂质体粒径分布图如说明书附图图3所示， SPIO示踪的米索硝唑。
24、pH敏感脂质体电 位图如说明书附图图4所示， SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体扫描电镜图如说明书附图 图5所示， SPIO示踪的米索硝唑pH敏感脂质体透射电镜图如说明书附图图6所示， SPIO示踪 的米索硝唑pH敏感脂质体磁化曲线如说明书附图图7所示。 0030 一种SPIO示踪的pH敏感脂质体及其制备方法， 包括以下步骤： 0031 S1： 取磷脂酰乙醇胺30份、 胆固醇10份和亚油酸10份于烧瓶内， 加入氯仿进行溶 解， 然后加入含2.5份的米索硝唑的水溶液后进行超声2min， 直至形成均匀的W/O型乳剂； 0032 S2： 将烧瓶与旋转蒸发仪连接， 在减压条件下进行蒸发， 形成凝胶状。
25、态； 向烧瓶内 加入8ml pH为7.4的PBS缓冲液， 继续在减压条件下蒸发形成水性悬浮液； 0033 S3： 加入0.5份SPIO后将水性悬浮液先后置-80、 50进行冻融， 重复3次； 随后， 利用高速离心法除去水性悬浮液未包入的米索硝唑及SPIO， 得到脂质体混悬液； 0034 S4： 向脂质体中加入0.5份质量百分数为0.3的羧甲基壳聚糖溶液， 进行水合 30min， 超声并过微孔滤膜得到SPIO示踪的pH敏感脂质体。 0035 进一步地， 步骤S1中， 还包括一定质量配比的维生素E作为抗氧化剂。 0036 实施例二： 0037 一种SPIO示踪的pH敏感脂质体及其制备方法， 包括以。
26、下步骤： 0038 A1： 取紫杉醇5份、 磷脂酰乙醇胺30份、 胆固醇10份和亚油酸10份于烧瓶内， 然后加 入氯仿进行溶解， 将烧瓶与旋转蒸发仪连接， 并在37， 100r/min， 减压条件下将氯仿挥干， 在烧杯内壁形成薄膜； 0039 A2： 向烧杯内加入含0.5份SPIO的水溶液， 旋转蒸发仪在501， 100r/min， 避光 条件下水化60min得到脂质体溶液； 0040 A3： 利用高速离心法除去脂质体未包入的紫杉醇及SPIO， 得到脂质体混悬液； 0041 A4： 向脂质体中加入0.5份质量百分数为0.3的羧甲基壳聚糖溶液， 进行水合 30min得到SPIO示踪的pH敏感脂质。
27、体。 0042 进一步地， 步骤A1中， 还包括一定质量配比的维生素E作为抗氧化剂。 0043 实施例三： 0044 一种SPIO示踪的pH敏感脂质体及其制备方法， 包括以下步骤： 0045 B1： 取磷脂酰乙醇胺30份、 胆固醇10份和亚油酸10份于烧瓶内， 加入二甲基亚砜混 合作为A相， 将纯水、 甘油、 顺铂5份以及SPIO 0.5份混合作为B相， 将A相与B相混合后， 倒入 搅拌机内， 在55搅拌3分钟， 然后取出放入乳化机中乳化30秒， 之后放入高压乳化剂中乳 化4次； 说 明 书 4/5 页 6 CN 108542884 A 6 0046 B2： 将步骤B1经过高压乳化剂中乳化后的。
28、产物放入超声波振荡机消泡后， 加入pH 为7.4的PBS缓冲液， 形成脂质体混悬液； 0047 B3： 利用高速离心法除去脂质体未包入的顺铂及SPIO， 得到脂质体混悬液； 对脂质 体混悬液进行超声， 并过微孔滤膜得到脂质体； 0048 B4： 向脂质体中加入0.5份质量百分数为0.3的羧甲基壳聚糖溶液， 进行水合 30min得到SPIO示踪的pH敏感脂质体。 0049 进一步地， 步骤B1中， 还包括一定质量配比的维生素E作为抗氧化剂。 0050 实施例四： 0051 一种SPIO示踪的pH敏感脂质体及其制备方法， 包括以下步骤： 0052 C1： 取阿霉素5份、 磷脂酰乙醇胺30份、 胆固。
29、醇10份和亚油酸10份于烧瓶内， 加入叔 丁醇进行溶解， 然后加入200份海藻糖水溶液， 0.5份质量百分数为0.3的羧甲基壳聚糖溶 液， 0.5份SPIO溶液， 并经微孔滤膜过滤后分装于100ml灭菌西林瓶中， 置于冷冻干燥机中冷 冻干燥， 封口， 得到SPIO示踪的pH敏感前体脂质体； 0053 C2： 临用前， 取SPIO示踪的pH敏感前体脂质体1瓶， 加入生理盐水100ml， 于37摇 床， 振摇30min， 得到SPIO示踪的pH敏感脂质体。 0054 进一步地， 步骤C1中， 还包括一定质量配比的维生素E作为抗氧化剂。 0055 临床使用时， 可以采用针剂或者冻干剂。 本发明所提供。
30、的SPIO示踪的pH敏感载药 脂质体具有pH敏感性高、 超顺磁性好的优点， 为实现肿瘤靶向性、 降低药物毒性、 无放射性 示踪奠定基础。 本发明还公开了SPIO示踪的pH敏感载药脂质体的制备方法， 可以更好的对 水溶性或脂溶性药物进行包裹， 制备方法简单， 粒径分布均匀， 有利于工业化。 0056 最后应说明的是： 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解； 其依然可 以对前述实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分或者全部技术特征进行等同 替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范 围， 其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108542884 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 8 CN 108542884 A 8 图3 说 明 书 附 图 2/4 页 9 CN 108542884 A 9 图4 说 明 书 附 图 3/4 页 10 CN 108542884 A 10 图5 图6 图7 说 明 书 附 图 4/4 页 11 CN 108542884 A 11 。