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1、(10)授权公告号 CN 102836428 B (45)授权公告日 2014.01.08 CN 102836428 B (21)申请号 201210336051.2 (22)申请日 2012.09.12 A61K 39/39(2006.01) A61K 39/106(2006.01) A61K 9/107(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61K 39/40(2006.01) (73)专利权人 淮海工学院 地址 222000 江苏省连云港市新浦区苍梧路 59 号淮海工学院海洋学院张晓君转 (72)发明人 秦国民 张晓君 闫斌伦 毕可然 陈丽 (74)专利代理机构 南。
2、京众联专利代理有限公司 32206 代理人 刘喜莲 CN 102100911 A,2011.06.22, 权利要求 1， 实施例 1-3. CN 1762387 A,2006.04.26, 全文 . CN 1779462 A,2006.05.31, 权利要求 1， 说 明书第 6 页制备实施例 . Pope EC et alEnhanced cellular immunity in shrimp (Litopenaeus vannamei) after vaccination .Plos one .2011, 第 6 卷 ( 第 6 期 ),1-7. 谈建明等 . 鸡减蛋综合征、 新城疫二联灭。
3、活 油乳剂苗的研制 .上海农学院学报 .1995, 第 13 卷 ( 第 02 期 ),85-89. 裴春生等 . 油乳剂疫苗中硬脂酸铝含量与油 相水相比例关系研究 . 中国兽药杂志 .2005, 第 39 卷 ( 第 02 期 ),21-23. 杨瑛 . 影响油乳剂疫苗稳定性因素的探 讨 .畜牧兽医杂志 .1995,( 第 01 期 ),15-17. (54) 发明名称 用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的 灭活疫苗制法 (57) 摘要 一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗 体的灭活疫苗制法， 该方法先将病原副溶血弧菌 JGB080708-1 菌株灭活、 离心得灭活菌体 ； 然后制 得黄。
4、芪浸出液 ； 再由白油、 硬脂酸铝、 司班 80 制得 油相， 灭活菌体与黄芪浸出液混合制得疫苗水相 ； 最后将油相和水相按体积比 2:1 混合乳化研磨 5min， 制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌 油乳剂灭活疫苗。本发明副溶血弧菌油乳剂灭活 疫苗， 可以用于免疫成年产蛋鸡， 进而得到抗凡纳 滨对虾红体病的高免卵黄抗体， 能增强凡纳滨对 虾对病原副溶血弧菌的免疫力， 提高凡纳滨对虾 养殖的成活率， 增加凡纳滨对虾养殖的产量， 提高 凡纳滨对虾养殖生产的经济效益。从根本上解决 了目前凡纳滨对虾养殖生产过程中易发生副溶血 弧菌所致疾病的问题。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 。
5、王胜佳 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 102836428 B CN 102836428 B 1/1 页 2 1. 一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法， 其特征在于 ： 它以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌 JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus） 作为免疫原， 以白油、 司班 80、 硬脂酸铝作油乳剂， 以及以黄芪浸出液作 为免疫增强剂， 乳化制备成油乳剂灭活疫苗 ； 其具体步骤如下 ： （1） 将病原副溶血弧。
6、菌 JGB080708-1 菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上， 28-30 摇床培养 24h， 加入体积终浓度 0.3% 的甲醛 28灭活 48h， 离心得灭活菌体 ； （2） 取黄芪用蒸馏水浸泡 30-60min 后煎煮， 过滤， 浓缩至终浓度为原药 1g/mL， 得黄芪 浸出液 ； （3） 将白油加热至 50-55， 加入硬脂酸铝， 硬脂酸铝与白油的重量体积比为 1-3 ： 100 g / ml， 继续加热至 65-70， 加入司班 80， 司班 80 与白油的体积比为 5-7 ： 100， 直至终温 度 115-120， 维持 15-20 min， 制得油相， 冷却备用 ； （4）将灭。
7、活菌体与黄芪浸出液混合， 制得疫苗水相 ； 水相中病原副溶血弧菌 JGB080708-1 免疫原为 1011cells/mL， 黄芪浸出液为 1g/mL， 水相中还加入了终体积浓度为 4% 的吐温 80 ； （5） 将油相和水相按体积比 2:1 混合乳化研磨 5min， 制得黄芪和白油为联合佐剂的副 溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。 权 利 要 求 书 CN 102836428 B 2 1/4 页 3 用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法 技术领域 0001 本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法， 特别涉及一种用于制备抗凡纳滨对虾红体 病的卵黄抗体的灭活疫苗制法。 背景技术 0002 凡纳滨。
8、对虾(Litopenaeus vannamei)又称白对虾、 万氏对虾等， 是一热带虾种， 其 具有适盐范围广、 耐密养、 生长快、 抗逆能力强等优点， 我国于 1988 年引进后， 现已在全国 沿海各地大规模养殖。 随着凡纳滨对虾养殖规模的扩大， 养殖生态环境日益恶化， 病害发生 频率急剧上升， 由病原副溶血弧菌 （Vibrio parahaemolyticus） 引起的红体病在全国各养 虾地区均广泛流行， 且传播快， 可造成海水养殖凡纳滨对虾毁灭性死亡， 已成为凡纳滨对虾 养殖过程中最常见且是造成经济损失最严重的疾病之一。 0003 目前凡纳滨对虾海水养殖生产中很难控制副溶血弧菌引起的疾病。
9、的发生与流行， 市场上缺乏一种使用方便的抗凡纳滨对虾红体病的灭活疫苗。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足， 提供一种提高凡纳滨对虾针 对副溶血弧菌的免疫力、 降低凡纳滨对虾海水养殖生产中由病原副溶血弧菌所造成的危 害、 以满足凡纳滨对虾养殖生产上的抗病需求的用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体 的灭活疫苗制法。 0005 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。 本发明是一种用于 制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法， 其特点是 ： 它以经甲醛溶液灭活后 的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌 JGB080708-1（Vibrio parah。
10、aemolyticus） 作为免 疫原， 以白油、 司班 80、 硬脂酸铝作油乳剂， 以及以黄芪浸出液作为免疫增强剂， 乳化制备成 油乳剂灭活疫苗 ； 其具体步骤如下 ： 0006 （1）将病原副溶血弧菌 JGB080708-1 菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上， 28-30摇床培养 24h， 加入体积终浓度 0.3% 的甲醛 28灭活 48h， 离心得灭活菌体 ； 0007 （2） 取黄芪用蒸馏水浸泡 30-60min 后煎煮， 过滤， 浓缩至终浓度为原药 1g/mL， 得 黄芪浸出液 ； 0008 （3） 将白油加热至 50-55， 加入硬脂酸铝， 硬脂酸铝与白油的重量体积比为 1-3 。
11、： 100 g / ml， 继续加热至 65-70， 加入司班 80， 司班 80 与白油的体积比为 5-7 ： 100， 直至 终温度 115-120， 维持 15-20 min， 制得油相， 冷却备用 ； 0009 （4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合， 制得疫苗水相 ； 水相中病原副溶血弧菌 JGB080708-1 免疫原为 1011cells/mL， 黄芪浸出液为 1g/mL， 水相中还加入了终体积浓度为 4% 的吐温 80 ； 0010 （5） 将油相和水相按体积比 2:1 混合乳化研磨 5min， 制得黄芪和白油为联合佐剂 的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。 说 明 书 CN 1028364。
12、28 B 3 2/4 页 4 0011 本发明所述的病原副溶血弧菌 JGB080708-1 已经在公开文献 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 病原副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 的表型及分子 特征 中所公开 （菌株 JGB080708-1） ， 上述公开文献发表于 海洋与湖沼 ， 2009， 40（5） ： 654-661。菌株 JGB080708-1 的 DNA 序列长度及 Genebank 登录号见下表 ： 0012 0013 该菌株 JGB080708-1 为公知公用材料， 现保存在淮海工学院海洋学院实验室， 在 本专利申请日起二十。
13、年内， 公众如果需要， 淮海工学院海洋学院实验室可对外发放。 0014 本发明制备方法制得的抗凡纳滨对虾红体病的灭活疫苗的使用方法如下 ： 用制得 的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗， 采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡， 第 1 次免 疫剂量为0.5 mL， 一周后按前述方法加强免疫， 免疫剂量为0.5 mL， 一周后按前述方法继续 加强免疫， 免疫剂量为 1 mL， 一周后按前述方法再加强免疫， 免疫剂量为 0.5 mL， 共免疫 4 次， 收集被免疫鸡所产鸡蛋， 分离出卵黄， 制得卵黄抗体。免疫结束后第 4 周， 卵黄抗体效价 可达 212。然后以上述方法所获得的高免鸡蛋作为原料， 经冷冻。
14、干燥 （蛋黄液厚度 6mm， 冻干 时间 10h） 或喷雾干燥制备成含有抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体的蛋黄粉， 可在育苗 生产中直接投喂， 或按 5% 比例添加在配合饲料中投喂使用。抗凡纳滨对虾红体病的高免卵 黄抗体， 不仅具有良好的抗病作用， 而且使用方便， 同时又具有较高的营养价值。 0015 本发明副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗， 可以用于免疫成年产蛋鸡， 进而得到抗凡纳 滨对虾红体病的高免卵黄抗体， 能增强凡纳滨对虾对病原副溶血弧菌的免疫力， 提高凡纳 滨对虾养殖的成活率， 增加凡纳滨对虾养殖的产量， 提高凡纳滨对虾养殖生产的经济效益。 从根本上解决了目前凡纳滨对虾养殖生产过程中易发生副。
15、溶血弧菌所致疾病的问题。 具体实施方式 0016 以下进一步描述本发明的具体技术方案， 以便于本领域的技术人员进一步地理解 本发明， 而不构成对其权利的限制。 0017 实施例 1， 一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法， 它 以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌 JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus） 作为免疫原， 以白油、 司班 80、 硬脂酸铝作油乳剂， 以及以黄芪浸出液作 为免疫增强剂， 乳化制备成油乳剂灭活疫苗 ； 其具体步骤如下 ： 0018 （1）将病原副溶血弧菌 JGB080708-1 菌株接种在普通营养琼脂肉。
16、汤培养基上， 30摇床培养 24h， 加入体积终浓度 0.3% 的甲醛 28灭活 48h， 离心得灭活菌体 ； 0019 （2） 取黄芪用蒸馏水浸泡 60min 后煎煮， 过滤， 浓缩至终浓度为原药 1g/mL， 得黄芪 浸出液 ； 0020 （3） 将白油加热至 50， 加入硬脂酸铝， 硬脂酸铝与白油的重量体积比为 1 ： 100 g / ml， 继续加热至65， 加入司班80， 司班80与白油的体积比为5 ： 100， 直至终温度115， 维持 15 min， 制得油相， 冷却备用 ； 说 明 书 CN 102836428 B 4 3/4 页 5 0021 （4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合。
17、， 制得疫苗水相 ； 水相中病原副溶血弧菌 JGB080708-1 免疫原为 1011cells/mL， 黄芪浸出液为 1g/mL， 水相中还加入了终体积浓度为 4% 的吐温 80 ； 0022 （5） 将油相和水相按体积比 2:1 混合乳化研磨 5min， 制得黄芪和白油为联合佐剂 的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。 0023 实施例 2， 一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法， 它 以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌 JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus） 作为免疫原， 以白油、 司班 80、 硬脂酸铝作油乳剂， 以及以黄芪浸。
18、出液作 为免疫增强剂， 乳化制备成油乳剂灭活疫苗 ； 其具体步骤如下 ： 0024 （1）将病原副溶血弧菌 JGB080708-1 菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上， 29摇床培养 24h， 加入体积终浓度 0.3% 的甲醛 28灭活 48h， 离心得灭活菌体 ； 0025 （2） 取黄芪用蒸馏水浸泡 30min 后煎煮， 过滤， 浓缩至终浓度为原药 1g/mL， 得黄芪 浸出液 ； 0026 （3） 将白油加热至 52， 加入硬脂酸铝， 硬脂酸铝与白油的重量体积比为 3 ： 100 g / ml， 继续加热至 68， 加入司班 80， 司班 80 与白油的体积比为 5-7 ： 100， 直。
19、至终温度 118， 维持 18 min， 制得油相， 冷却备用 ； 0027 （4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合， 制得疫苗水相 ； 水相中病原副溶血弧菌 JGB080708-1 免疫原为 1011cells/mL， 黄芪浸出液为 1g/mL， 水相中还加入了终体积浓度为 4% 的吐温 80 ； 0028 （5） 将油相和水相按体积比 2:1 混合乳化研磨 5min， 制得黄芪和白油为联合佐剂 的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。 0029 实施例 3， 一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法， 它 以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌 JGB080708-1（Vibri。
20、o parahaemolyticus） 作为免疫原， 以白油、 司班 80、 硬脂酸铝作油乳剂， 以及以黄芪浸出液作 为免疫增强剂， 乳化制备成油乳剂灭活疫苗 ； 其具体步骤如下 ： 0030 （1）将病原副溶血弧菌 JGB080708-1 菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上， 28摇床培养 24h， 加入体积终浓度 0.3% 的甲醛 28灭活 48h， 离心得灭活菌体 ； 0031 （2） 取黄芪用蒸馏水浸泡 45min 后煎煮， 过滤， 浓缩至终浓度为原药 1g/mL， 得黄芪 浸出液 ； 0032 （3） 将白油加热至 55， 加入硬脂酸铝， 硬脂酸铝与白油的重量体积比为 2 ： 100。
21、 g / ml， 继续加热至70， 加入司班80， 司班80与白油的体积比为6 ： 100， 直至终温度120， 维持 20 min， 制得油相， 冷却备用 ； 0033 （4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合， 制得疫苗水相 ； 水相中病原副溶血弧菌 JGB080708-1 免疫原为 1011cells/mL， 黄芪浸出液为 1g/mL， 水相中还加入了终体积浓度为 4% 的吐温 80 ； 0034 （5） 将油相和水相按体积比 2:1 混合乳化研磨 5min， 制得黄芪和白油为联合佐剂 的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。 0035 实施例 4， 实施例 3 制得的抗凡纳滨对虾红体病的灭活疫苗的应用实验。
22、。 0036 1副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡。 说 明 书 CN 102836428 B 5 4/4 页 6 0037 副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡， 第 1 次免疫剂量为0.5 mL， 一周后按前述方法加强免疫， 免疫剂量为0.5 mL， 一周后按前述方法 继续加强免疫， 免疫剂量为 1 mL， 一周后按前述方法再加强免疫， 免疫剂量为 0.5 mL， 共免 疫 4 次， 收集被免疫鸡所产鸡蛋， 分离出卵黄作高免卵黄抗体， 并测定其抗体效价。免疫结 束后第 1 周至第 2 周卵黄抗体效价维持在 211， 第 3 周以后卵黄抗体效价为 212。 003。
23、8 2用上述方法制得的抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体进行的免疫实验及其 结果。 0039 实验时间 ： 2012 年度 4 月 5 月。 0040 实验地点 ： 江苏省淮海工学院水产动物病害实验室。 0041 实验动物 ： 凡纳滨对虾蚤状幼体及糠虾幼体。 0042 （1） 使用抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体。使用时以所获得的高免鸡蛋作为 原料， 经冷冻干燥 （蛋黄液厚度 6mm， 冻干时间 10h） 制备成含有抗凡纳滨对虾红体病病原副 溶血弧菌高免卵黄抗体的蛋黄粉。 0043 （2） 实验组凡纳滨对虾蚤状幼体投喂用含有抗凡纳滨对虾红体病病原副溶血弧菌 高免卵黄抗体的蛋黄粉及市售虾片， 对照。
24、组凡纳滨对虾蚤状幼体投喂市售普通蛋黄粉及市 售虾片。 0044 （3） 投喂 4d 后， 对实验组与对照组凡纳滨对虾幼体进行保护力检验， 分别取幼体 100 尾， 用副溶血弧菌进行浸浴感染， 菌体终浓度均为 1.8106CFU/mL。试验期间继续按上 述 （2） 进行投喂， 试验期为 72h。 0045 （4） 实验结果 ： 实验组凡纳滨对虾幼体投喂实验例 1 所述的抗凡纳滨对虾红体病 的高免卵黄抗体后， 可获得较高的抗副溶血弧菌感染能力， 幼体感染 72h 后存活率达 78， 幼体存活率为 26%。实验结果表明抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体可使凡纳滨对虾获 得较高的免疫保护力。 说 明 书 CN 102836428 B 6 。