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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510225636.0 (22)申请日 2015.05.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104814947 A (43)申请公布日 2015.08.05 (73)专利权人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路800号 (72)发明人 金永生 钱汐晶 刘洪川 陈海生 戚中田 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 巫蓓丽 (51)Int.Cl. A61K 31/122(2006.0。
2、1) A61K 31/704(2006.01) A61K 31/336(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A23L 33/10(2016.01) 审查员 洪梦实 (54)发明名称 二萜类化合物在制备防治肝炎病毒药物中 的应用 (57)摘要 本发明提供了二萜类化合物蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物在 制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用及其在制 备保肝的食品和保健品中的应用。 本发明为蓝萼 甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧 化物提供制备抗丙型肝炎病毒(HCV)药物的用 途， 试验结果发现， 蓝萼甲素、 Minheryi。
3、ns I、 尾 叶戊素和蓝萼甲素环氧化物具有非常显著的抗 HCV活性， 可用于制备抗丙肝病毒的药物、 保健品 和食品。 本发明为寻找抗丙型肝炎病毒药物提供 了新的来源。 权利要求书1页 说明书5页 CN 104814947 B 2017.08.08 CN 104814947 B 1.蓝萼香茶菜中二萜类化合物、 尾叶香茶菜中二萜类化合物及蓝萼甲素环氧化物在制 备抗丙型肝炎病毒药物中的应用， 其特征在于， 所述蓝萼香茶菜中二萜类化合物为蓝萼甲 素和Minheryins I， 其化学结构分别如式1和式2所示； 所述尾叶香茶菜中二萜类化合物为 尾叶戊素， 其化学结构如式3所示； 所述蓝萼甲素环氧化物的。
4、化学结构如式4所示： 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素 和蓝萼甲素环氧化物在制备防治丙型肝炎药物中的应用。 3.一种蓝萼甲素环氧化物， 其特征在于， 所述蓝萼甲素环氧化物化学结构如下所示： 4.如权利要求3所述的蓝萼甲素环氧化物的合成方法， 其特征在于， 以蓝萼甲素为原 料， 经双氧水或间氯过氧化苯甲酸环氧化成蓝萼甲素环氧化物。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104814947 B 2 二萜类化合物在制备防治肝炎病毒药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体地说， 是二萜类化合物蓝萼甲素、 M。
5、inheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物在制备防治肝炎病毒药物中的应用。 背景技术 0002 蓝萼甲素(Glaucocalyxin A， GLA)是从唇形科(Labiatae)香茶菜属(Rabdosia)植 物蓝萼香茶菜中分离出的一种具有15-氧-16贝壳杉烯骨架的二萜类化合物， 分子式为 C20H28O4， 其结构如式1所示。 研究证明： 蓝萼甲素具有抗肿瘤、 抗菌、 诱导细胞凋亡、 抗氧化、 DNA损伤保护以及细胞毒作用等多种生物活性。 Minheryins I为从植物蓝萼香茶菜中提取 得到的二萜类化合物， 其结构如式2所示(姚士等， 蓝萼香茶菜的抗补体活性成分研究， 中国 中。
6、药杂志， 2013,28(4):199-201)。 尾叶戊素为从植物尾叶香茶菜中提取得到的二萜类化合 物， 其结构如式3所示。 蓝萼甲素环氧化物结构式如式4所示， 以蓝萼甲素为原料， 经双氧水 或间氯过氧化苯甲酸环氧化制得。 0003 0004 中国专利文献CN201110041403.7公开了蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用， 发 现蓝萼甲素能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间， 并显著延长小鼠凝血酶时 间 、 凝 血 酶 原 时 间 、 活 化 部 分 凝 血 激 酶 时 间 和 血 浆 覆 盖 时 间 。 中 国 专 利 文 献 CN201310535621.5公开了蓝萼甲素衍生物。
7、在制备治疗白血病药物中的应用。 2006年5月吉 林大学博士学位论文，尾叶香茶菜二萜类成分与抗癌活性研究 对尾叶香茶菜化学成分及 抗癌活性进行了研究， 从尾叶香茶菜地上部分共分得16个贝壳杉烯型二萜类化合物， 其中 化合物5分子式为C26H42O9， 通过小鼠体内移植性肿瘤模型， 对尾叶香茶菜叶总二萜的抗肿瘤 作用进行了实验研究， 结果表明尾叶香茶菜叶总二萜100、 200mg/kg对小鼠肝癌H22、 Lewis肺 癌以及黑色素瘤B16具有较强的生长抑制作用。 关于上述4种化合物的抗丙型肝炎病毒作用， 目前还未见报道。 发明内容 说 明 书 1/5 页 3 CN 104814947 B 3 0。
8、005 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供蓝萼香茶菜中二萜类化合物、 尾叶 香茶菜中二萜类化合物及蓝萼甲素环氧化物在制备防治肝炎病毒药物中的应用。 0006 本发明的另一的目的是， 提供所述的新化合物蓝萼甲素环氧化物及其合成方法。 0007 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是： 0008 蓝萼香茶菜中二萜类化合物、 尾叶香茶菜中二萜类化合物及蓝萼甲素环氧化物在 制备防治肝炎病毒药物中的应用， 所述蓝萼香茶菜中二萜类化合物为蓝萼甲素和 Minheryins I， 其化学结构分别如式1和式2所示； 所述尾叶香茶菜中二萜类化合物为尾叶 戊素， 其化学结构如式3所示； 所述蓝萼甲素环氧化。
9、物的化学结构如式4所示。 0009 0010 所述的蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物在制备抗丙型肝 炎病毒药物中的应用。 0011 所述的蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物在制备抑制HCV入 侵靶细胞的药物中的应用。 0012 为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是： 0013 所述的蓝萼甲素环氧化物的合成方法， 以蓝萼甲素为原料， 经双氧水或间氯过氧 化苯甲酸环氧化成蓝萼甲素环氧化物。 0014 本发明优点在于： 0015 本发明为二萜类化合物蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物 提供一种。
10、制备抗丙型肝炎病毒(HCV)药物的用途， 通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝 炎病毒(HCVcc)， 利用HCV易感染细胞人肝癌Huh7细胞系， 对上述四种二萜类化合物的抗HCV 活性进行了体外实验。 结果发现， 这四种二萜类化合物均具有显著的抗HCV活性， 尤其能抑 制HCV入侵靶细胞， 可用于制备抗丙型病毒的药物。 本发明不仅为二萜类化合物蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物提供了新用途， 也为寻找抗丙型肝炎病毒药 物提供了新的来源。 具体实施方式 0016 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0017 实施例1蓝萼甲素环氧化物的制备(一) 。
11、说 明 书 2/5 页 4 CN 104814947 B 4 0018 蓝萼甲素80mg， 加入到8ml乙醇中， 室温下加入20NaOH 1ml， H2O2 1ml， 搅拌反应 48h后， TLC， 原料点消失， 反应完全。 将反应液倒入到20ml水中， 然后用CH2Cl2萃取， 每次5ml， 萃取3次。 合并CH2Cl2萃取液， Na2SO4干燥3h， 然后过滤除去Na2SO4， 减压蒸去溶剂。 剩余物硅 胶柱层析(石油醚： 乙酸乙酯3:2)。 得到目标化合物蓝萼甲素环氧化物。 ESI-MSM+H+ 349.3； 1H-NMR： 3.16(1H,d,J6.0,H-17)； 2.92(1H,d。
12、,J6.0,H-17)； 4.30(1H,dd,J 11.4,3.6Hz,H-7)； 4.98(1H,s,H-14)； 2.29(1H,s,H-13)。 0019 实施例2蓝萼甲素环氧化物的制备(二) 0020 蓝萼甲素80mg， 加入到8ml CH2Cl2中， 室温下加入间氯过氧化苯甲酸532mg室温搅 拌反应24h后， TLC， 原料点基本消失， 反应基本完全。 用保护亚硫酸氢钠溶液5ml洗涤1次， 然 后用水5ml洗涤3次。 CH2Cl2液Na2SO4干燥3h， 然后过滤除去Na2SO4， 减压蒸去溶剂。 剩余物硅 胶柱层析(石油醚： 乙酸乙酯3:2)。 得到目标化合物萼甲素环氧化物。 。
13、0021 实施例3蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物的抗丙型肝病毒 试验 0022 一、 实验药物、 试剂及材料 0023 1.化合物： 蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素和蓝萼甲素环氧化物 0024 2.细胞系Huh7， 人肝癌细胞株(详见： Yimin Tong,Yongzhe Zhu,Xueshan Xia, Yuan Liu,et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,JOURNAL OF VIROLOGY,2011； 。
14、85(6):27932802； Jin Zhong,Pablo Gastaminza,Guofeng Cheng,et al.Robust hepatitis C virus infection in vitro， PNAS,2005； 102(26):9294-9299)。 0025 3.细胞系293T， 人胚肾细胞系(详见： Yimin Tong,Yongzhe Zhu,Xueshan Xia, Yuan Liu,et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,JOURNA。
15、L OF VIROLOGY.2011； 85(6):27932802； Graham,F.L.,Smiley, J.,Russell,W.C.&Nairn,R.J.Gen.Virol 1977； 36:5974)。 0026 4.细胞培养液， 配制， 其含10胎牛血清、 0.03谷氨酰胺、 非必需氨基酸、 氨苄青 霉素和链霉素100U/ml， 调pH至7.4。 0027 5.细胞消化液， 配制， 其含0.25胰蛋白酶， 用磷酸缓冲液配制。 0028 6.HCVcc： 细胞培养的感染性丙型肝炎病毒(详见： Yimin Tong,Yongzhe Zhu, Xueshan Xia,Yuan Liu,。
16、et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,JOURNAL OF VIROLOGY,Mar.2011； 85(6):27932802； Jin Zhong,Pablo Gastaminza,Guofeng Cheng,et al.Robust hepatitis C virus infection in vitro， PNAS,2005； 102(26):9294-9299)。 0029 二、 实验方法： 0030 (一)HCVcc的制备 0031 1.病毒扩增 0032 。
17、J6、 JFH-1嵌合HCVcc(105ffu/ml)， 取50 l感染接种于24孔板的Huh 7.5细胞， 次日 换液， 随后根据细胞生长密度传代培养， 观察细胞生长状态， 待病毒快速增殖导致的细胞病 变效应(CPE)出现后， 收集第720天的培养上清， 取适量用于病毒滴度测定， 其余8,000rpm 离心5min弃细胞碎片后分装保存于-70备用。 说 明 书 3/5 页 5 CN 104814947 B 5 0033 2.病毒滴定 0034 以空白Huh 7.5(1104cells/孔)， 12h后， 弃培养上清， 每孔加入100 l经10倍梯 度稀释的HCVcc上清液， 共孵育5h， 换。
18、新鲜DMEM全培养液继续培养72h， 行免疫荧光法检测 HCV阳性细胞， 一抗用1:100稀释的HCV抗体阳性病人血清， 二抗为1:100稀释的FITC标记羊 抗人IgG。 在荧光显微镜下观察发光细胞， 并记录最后一个可观察到绿色荧光阳性细胞的孔 内绿色荧光阳性细胞数及相应的稀释梯度， 计算出focus forming unit/ml(ffu/ml)数值， 以此代表HCVcc滴度。 0035 (二)HCVcc感染性的检测 0036 取处于对数生长期的Huh7细胞， 调整细胞浓度为1105个/ml， 取100 l种96孔板； 培养24h后分别加入四种化合物以及HCVcc， 化合物按0.2、 1、。
19、 5、 20ug/ml浓度稀释， 37度培养 4小时后去除化合物及HCVcc混液， 换培养基继续培养； 48h后进行免疫荧光检测， 在荧光显 微镜下读取各孔HCVcc阳性克隆数。 0037 (三)结果(见表1) 0038 表1四种化合物对细胞培养丙肝病毒(HCVcc)的抑制活性() 0039 化合物20 g/ml5 g/ml1 g/ml 蓝萼甲素(-)(-)62.5 Minheryins I513626 尾叶戊素(-)(-)74.5 蓝萼甲素环氧化物5218.25.4 蓝萼丙素NNN 蓝萼戊素NNN 冬凌草甲素NNN 0040 注： (-)表示该浓度下细胞死亡； N表示无活性。 0041 由表。
20、1可见， 4个化合物都具有显著抑制丙肝病毒(HCVcc)作用， 说明它具有抗丙型 肝炎病毒和保肝作用。 上述实验结果表明， 蓝萼甲素(1)、 Minheryins I(2)、 尾叶戊素(3)和 蓝萼甲素环氧化物(4)具有显著的抗丙型肝炎病毒活性， 可用于制备抗丙型肝炎病毒的药 物和保肝的药物。 0042 本发明通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝炎病毒(HCVcc)模型， 利用HCV易感 染细胞人肝癌Huh7细胞系， 对二萜类化合物蓝萼甲素、 Minheryins I、 尾叶戊素及蓝萼甲素 环氧化物的抗HCV活性进行了体外实验。 结果发现， 它具有显著的抗HCV活性， 尤其能抑制 HCV入侵靶细。
21、胞。 同时发明人在对蓝萼甲素进行化学修饰的过程中， 意外的发现蓝萼甲素环 氧化物同样具有丙肝病毒抑制作用。 因此这四种二萜类化合物可用于制备抗丙肝病毒HCV 的药物。 0043 同时， 发明人从蓝萼香茶菜干燥地上部分提取了化合物蓝萼丙素、 蓝萼戊素(参见 文献： 中国医药教育协会第三届三次理事大会年会论文专辑，蓝萼香茶菜化学成分及抗肿 瘤和抗乙肝病毒作用研究 ， 2013年； 文献： 抗感染药学，蓝萼香茶菜化学成分和生物活性 研究近况 ， 2011年)及化合物冬凌草甲素， 并按照上述实验方法测试了这三种化合物对于 丙肝病毒的抑制活性， 结果表明这三类化合物对丙肝病毒均无抑制作用。 说 明 书 4/5 页 6 CN 104814947 B 6 0044 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104814947 B 7 。