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1、10申请公布号CN104126508A43申请公布日20141105CN104126508A21申请号201410356170322申请日20140724CGMCCNO922220140513CGMCCNO924720140609201410307276420140630CNA01H4/00200601C12N1/14200601C12R1/64520060171申请人上海市园林科学研究所地址200232上海市徐汇区龙吴路899号72发明人黄芳张春英王强谢军峰杨慧丽魏翔莺74专利代理机构上海世贸专利代理有限责任公司31128代理人严新德54发明名称一种兰花无菌苗快速菌根化的方法57摘要本发明一。
2、种兰花无菌苗快速菌根化的方法，解决了现有技术中的兰花人工育苗中幼苗生长缓慢、死亡率高等问题，包括一个准备栽培基质及营养液的步骤，所述的栽培基质由草炭和黄沙组成，所述的草炭和黄沙的体积比为1153；一个对无菌苗进行接种的步骤，将组织培养生根幼苗或无菌播种小苗移栽入无菌处理的栽培基质中，在幼苗根部附近接种菌块，菌块是保藏号为CGMCCNO9222或者CGMCCNO9247的菌株，菌块接种处距离根系032CM，接种后幼苗放置在培养室培养。采用本发明的方法使得兰花幼苗形成菌根快速、侵染率高，幼苗生长快，可用于兰花种苗生产。66本国优先权数据83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表1。
3、页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页10申请公布号CN104126508ACN104126508A1/1页21一种兰花无菌苗快速菌根化的方法，其特征在于包括以下步骤1）一个准备栽培基质及营养液的步骤，所述的栽培基质由草炭和黄沙组成，所述的草炭和黄沙的体积比为1153，所述的营养液是液体培养液，在所述的液体培养液中，葡萄糖的质量百分比浓度为015；2）一个对兰花无菌苗进行接种的步骤，将组织培养生根兰花幼苗或无菌播种兰花小苗移栽入无菌处理的栽培基质中，在幼苗根部附近接种至少一个菌块，所述的菌块为保藏号为CGMCCNO9222或者CGM。
4、CCNO9247的菌株，所述保藏号为CGMCCNO9222的菌株属于散囊菌纲EUROTIOMYCETES、散囊菌目ONYGENALES、畸枝霉属（MALBRANCHEA），所述保藏号为CGMCCNO9247的菌株属于伞菌纲（AGARICOMYCETES），鸡油菌目（CANTHARELLALES），胶膜菌科（TULASNELLACEAE），胶膜菌属TULASNELLA，所述的菌块直径在110MM之间，所述的菌块接种处距离根系032CM，接种后幼苗放置在培养室培养，培养条件是温度2226，光照周期1610H/814H，光强度为20004000LUX，培养时间是60100D。2如权利1所述的兰花无菌。
5、苗快速菌根化的方法，其特征在于所述的液体培养液是MMN液体培养液，在所述的MMN液体培养液中，葡萄糖的质量百分比浓度为015。3如权利1所述的兰花无菌苗快速菌根化的方法，其特征在于所述的培养基质中，所述的草炭和黄沙的体积比为12。4一种菌株，保藏号为CGMCCNO9222，属于畸枝霉属（MALBRANCHEA）、散囊菌目ONYGENALES、散囊菌纲EUROTIOMYCETES,分类命名MALBRANCHEASP。5一种菌株，保藏号为CGMCCNO9247，属于伞菌纲（AGARICOMYCETES），鸡油菌目（CANTHARELLALES），胶膜菌科（TULASNELLACEAE），胶膜菌属T。
6、ULASNELLA，分类命名为TULASNELLASP。6权利要求4所述的一种菌株在促进兰花幼苗生长中的用途。7权利要求5所述的一种菌株在促进兰花幼苗生长中的用途。权利要求书CN104126508A1/5页3一种兰花无菌苗快速菌根化的方法技术领域0001本发明涉及农业领域，尤其涉及一种兰花的栽培技术，特别是一种兰花无菌苗快速菌根化的方法。背景技术0002兰科植物，简称兰花，是一类重要的观赏和经济价值的珍贵花卉，常采用组培方法繁殖无菌小苗，但存在着组培困难、增殖系数小，生长缓慢，移栽时存活率低等问题。兰花菌根真菌在兰科植物生长中起着重要的作用，促进种子的萌发，在植株生长阶段促进对N、P等营养元素。
7、的吸收和利用，分泌激素促进植株的生长，甚至拮抗致病菌抑制其生长等作用。实现种苗菌根化是克服兰苗生长缓慢、提高移栽存活率的有效方法。选择合适的培养方法特别是培养基直接影响兰花在菌根化效果的重要因素。普通培养基一般更有利于真菌生长，易出现真菌营养过剩造成生长过旺缠绕植株，对植株表现出致病性导致植株生长缓慢甚至死亡的现象。本发明中菌根化方法，通过与目前较为常见的共生培养方法进行比较，从而选择效果更佳的方法。发明内容0003本发明所要解决的技术问题是提供一种兰花无菌苗快速菌根化的方法，所述的这种兰花无菌苗快速菌根化的方法要解决现有技术中使用共生培养基接种法常出现的幼苗生长缓慢、菌株生长过快甚至影响幼苗。
8、生长等技术问题。0004本发明一种兰花无菌苗快速菌根化的方法，包括以下步骤00051一个准备栽培基质及营养液的步骤，所述的栽培基质由草炭和黄沙组成，所述的草炭和黄沙的体积比为1153，所述的营养液是液体培养液，在所述的液体培养液中，葡萄糖的质量百分比浓度为015；00062一个对无菌苗进行接种的步骤，将组织培养生根幼苗或无菌播种小苗移栽入无菌处理的栽培基质中，在幼苗根部附近接种至少一个菌块，所述的菌块为保藏号为CGMCCNO9222或者CGMCCNO9247的菌株，所述保藏号为CGMCCNO9222LH53的菌株属于散囊菌纲EUROTIOMYCETES、散囊菌目ONYGENALES、畸枝霉属M。
9、ALBRANCHEA，所述保藏号为CGMCCNO9247LH94的菌株属于伞菌纲AGARICOMYCETES，鸡油菌目CANTHARELLALES，胶膜菌科TULASNELLACEAE，胶膜菌属TULASNELLA，分类命名为TULASNELLASP，所述的菌块直径在110MM之间，所述的菌块接种处距离根系032CM，接种后幼苗放置在培养室培养，培养条件是温度2226，光照周期1610H/814H，光强度为20004000LUX，培养时间是60100D。0007进一步的，所述的液体培养液是MMN液体培养液，在所述的MMN液体培养液中，葡萄糖的质量百分比浓度为015。0008进一步的，所述的栽培。
10、基质中，所述的草炭和黄沙的体积比为12。0009进一步的，所述的液体培养液中，所述的葡萄糖的质量百分比浓度为015。说明书CN104126508A2/5页40010本发明还提供了上述的一种菌株，保藏号为CGMCCNO9222，属于散囊菌纲EUROTIOMYCETES、散囊菌目ONYGENALES、畸枝霉属MALBRANCHEA。0011本发明还提供了上述的一种菌株，保藏号为CGMCCNO9247，属于伞菌纲AGARICOMYCETES，鸡油菌目CANTHARELLALES，胶膜菌科TULASNELLACEAE，胶膜菌属TULASNELLA，分类命名为TULASNELLASP。0012本发明还提。
11、供了上述的一种保藏号为CGMCCNO9222的菌株在促进兰花幼苗生长中的用途。0013本发明还提供了上述的一种保藏号为CGMCCNO9247的菌株在促进兰花幼苗生长中的用途。0014本发明的兰花菌根真菌LH53，属于散囊菌纲EUROTIOMYCETES、散囊菌目ONYGENALES、畸枝霉属MALBRANCHEA,其分类命名为MALBRANCHEASP，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2014年5月13日，保藏号为CGMCCNO9222。0015本发。
12、明的兰花菌根真菌LH94，其分类命名为TULASNELLASP，属于伞菌纲AGARICOMYCETES，鸡油菌目CANTHARELLALES，胶膜菌科TULASNELLACEAE，胶膜菌属TULASNELLA，分类命名为TULASNELLASP。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2014年6月9日，保藏号为CGMCCNO9247。0016本发明的方法和现有的技术相比较，其效果是积极和明显的。解决了现有技术中的兰花人工育苗中幼苗生长缓慢、死亡率高等问题。。
13、采用本发明的方法将会促进兰花幼苗菌根化效果快、侵染率高，幼苗生长质量高，是一种促进效果更为明显的兰花无菌苗快速菌根化的方法，可用科学研究，也可用于兰花种苗生产。附图说明0017图1是本发明的一种与兰花幼苗高效共生的菌根真菌菌株菌落形态的照片。0018图2是本发明的一种接种菌株LH53的兰花幼苗根部横切面在光学显微镜100倍下显微结构照片。0019图3是不接种的兰花幼苗根部横切面在光学显微镜100倍下显微结构照片。具体实施方式0020实施例1兰花菌根真菌的分离与鉴定0021一、分离根系材料采取上海市农业科学院盆栽春兰搬至遮荫大棚处待用。0022二、分离与鉴定培养基0023使用麦芽提取物培养基ME。
14、A，配方为麦芽提取物20G、胰蛋白胨1克、葡萄糖20克、琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，然后121高压灭菌20分钟，冷却至60以下时加入003克链霉素。0024三、分离与形态鉴定方法说明书CN104126508A3/5页50025菌根真菌菌株的分离取新鲜健康的兰花植物数段根部，放在自来水下冲洗，直至根部表面无污泥。将根部切成几段长约为10CM的小段，用无菌水清洗3次，滤纸吸干水分后浸入75的酒精60S，接着浸入2次氯酸钠60S，然后再浸入75的酒精30S，最后用无菌水清洗35遍。将消毒完成的根部材料在无菌条件下切成05CM小段，在无菌条件下分别将其接种至灭菌后冷却至室温的MEA培养基含1。
15、00UG/ML青霉素，于26培养箱中黑暗培养325D。0026菌落形态和菌丝体显微特征观察鉴定待菌落从根段中长出来，用接种针挑取菌落至MEA培养基，继续进行菌落形态鉴定，培养715D后观察菌落形态的一致性和均匀性，若菌落形态有差异，进行二次分离和鉴定。菌落形态特征稳定的菌株用接种针挑取至MEA平板22培养箱中黑暗培养715D。本实施例所使用培养箱为赛福恒温恒湿培养箱HWS350。0027四、分子鉴定方法0028菌丝的收集在无菌条件下挑取试管平面上保存的菌株菌丝至灭菌冷却后的MEA培养基上活化，在黑暗条件下培养37D，刮取菌丝，使用CTAB法提取总DNA。0029ITS区段的PCR扩增RDNAI。
16、TS区段的扩增采用通用引物ITS15TCCGTAGGTGAACCTGCGG3，ITS45TCCTCCGCTTATTGATATGC3。PCR反应体系的组成为10BUFFER25L，50MMOL/LMG23L，10MMOL/LDNTP05L，10MOL/L引物各05L，模板DNA1L终浓度在50NG/L左右，TAQ酶1U02L，用无菌纯水定容至25L。PCR反应采用BIORADDNAENGINE型PCR仪，循环参数为预变性95，5MIN，变性95，30S，退火53，30S，延伸72，45S；终末延伸72，5MIN。共进行35个循环。0030产物纯化及测序PCR产物经试剂盒纯化后使用载体是PMD18。
17、T转化连接，测序引物为M13R48，使用测序仪器ABI3730XL进行测序测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。所得序列使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。得到的序列在NCBI上BLAST，使用数据库为GENBANK。0031五、菌株鉴定结果0032本发明发现了两种真菌菌株，其中一种LH53菌株形态特征为菌落米白色，生长之初呈绒毡状，一段时间后呈棉絮状。0033六、分子鉴定结果0034LH53真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区的序列如SEQIDNO1所示，ITS序列经BLAST比对，与MALBRANCHEACINNAMOMEA的ITS序列相似度为96，经IT。
18、S序列比对最相近物种为散囊菌纲EUROTIOMYCETES、散囊菌目ONYGENALES、畸枝霉属MALBRANCHEA的真菌，保藏号为CGMCCNO9222，鉴定为新的兰花菌根真菌菌株。0035七、菌株鉴定结果0036其中一种LH94菌株形态特征为菌落米白色绒毡状，呈圆形。0037八、分子鉴定结果0038LH94真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区的序列如SEQIDNO2所示。LH94ITS序列经BLAST比对，与菌株TULASNELLACALOSPORA的ITS序列相似度85，经ITS序列比对最相近物种为胶膜菌属TULASNELLA，胶膜菌科TULASNELLACEAE，鸡油菌目CANTHA。
19、RELLALES，伞菌纲AGARICOMYCETES，分类命名为TULASNELLASP，保藏号为说明书CN104126508A4/5页6CGMCCNO9247，鉴定为新的兰花菌根真菌菌株。0039实施例20040一、兰花组培苗材料采集兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为06G，株高约为8CM。0041二、栽培基质0042选择充分灭菌后晾干的草炭黄沙以一定比例混合作为栽培基质，具体配方为草炭黄沙12，浇入MMN液体培养基，500ML/1500G栽培基质，混合均匀后分装至640ML栽培平内，高压灭菌后冷却至常温。在无菌条件下每瓶移栽3株兰花苗，每个处理接种6瓶兰花苗作为重复，置。
20、于组培室无菌培养。待生长一周后，检查有无污染，在无污染的组培瓶内分别接种供试菌株，即在每个组培瓶的基质中央放置一直径为05CM的菌饼，约在栽培基质下1CM靠近苗的根部，继续在培养室培养，培养室条件为温度2226，光照周期1610H/814H，光强度为20004000LUX，培养80D后，统计幼苗生长量和侵染情况，接种菌株后幼苗平均侵染率、鲜重增长率、株高增长率和干鲜比均高于其他处理组和对照处理组表1。0043结果表明本发明方法能快速菌根化兰花无菌幼苗，接种的菌株对兰花幼苗的生长具有抑制或促进的作用，其中接种菌株LH127对兰花幼苗的生长影响不利，而接种菌株LH53保藏号为CGMCCNO9222。
21、和LH94对兰花幼苗的生长具有一定程度上的促进作用。0044表1不同接种处理组培养80D后兰苗生长情况统计表0045接种菌株平均侵染率鲜重增长率株高增长率干鲜比LH12733742061228853LH53713920432571080LH947434100973040985CK0610427318300046实施例30047兰花组培苗材料采集兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为09G，株高约为10CM。试验设置2种接种条件，一种采用本发明的方法，即栽培基质及接种处理方法同实施案例3；另一种使用DE培养基配方为葡萄糖10克、胰蛋白胨5克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁05克、孟加拉红。
22、0033克，琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，调节PH值至50，然后121高压灭菌20分钟，冷却至60以下时倒平板待用，接种方法类似本发明方法。本案例中接种菌株LH53，培养80D后统计幼苗生长量和侵染情况。结果表明本发明方法中平均侵染率提高3437，鲜重增长率提高1305，株高增长率提高1483，干鲜比提高010均高于其他处理组和对照处理组表2。0048结果表明相比较DE共生培养方法，本发明方法具有接种后侵染率更高、对兰花幼苗生长的促进作用更明显等优良，从而更有利于兰花菌根化生长。0049表2不同接种处理组培养80D后兰苗生长情况统计表说明书CN104126508A5/5页70050接种。
23、菌株LH53平均侵染率鲜重增长率株高增长率干鲜比本发明方法664862503020846DE共生培养方法3211494515378360051实施例40052兰花组培苗材料为兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为09G，株高约为10CM。栽培基质及处理方法同实施案例3，培养80D后，统计幼苗生长量和侵染情况，接种菌株后幼苗鲜重增长量、株高增长量均高于其他处理组和对照处理组表3。0053结果表明本方法能快速菌根化兰花无菌幼苗，接种的菌株对兰花幼苗的生长具有抑制或促进的作用，其中接种菌株LH127对兰花幼苗的生长影响不利，而接种菌株LH53保藏号为CGMCCNO9222和LH94对兰花幼苗的生长具有一定程度上的促进作用。如图1、图2和图3所示0054表3不同接种处理组培养80D后兰苗生长情况统计表0055接种菌株平均侵染率鲜重增长率株高增长率干鲜比LH127132556081685875LH53664862503020846LH94730689762291826CK047062245803说明书CN104126508A1/1页80001序列表CN104126508A1/2页9图1图2说明书附图CN104126508A2/2页10图3说明书附图CN104126508A10。