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1、10申请公布号CN104130981A43申请公布日20141105CN104130981A21申请号201410327912X22申请日20140710CGMCCNO879020140221C12N7/00200601A61K39/215200601A61P31/14200601C12R1/9320060171申请人中国农业科学院哈尔滨兽医研究所地址150001黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号72发明人刘胜旺韩宗玺邵昱昊孔宪刚74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨马鑫54发明名称鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用57摘要本发明公开了一。
2、株鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用。本发明将分离得到的传染性支气管炎病毒野生强毒株进行鸡胚适应驯化，获得了高度适应鸡胚且保持良好遗传特性和免疫原性的传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为CK/CH/LLN101135。将其灭活后，进行免疫效力评价实验，结果表明，由本发明的疫苗株制备得到的传染性支气管炎灭活疫苗能够激发机体产生良好的免疫反应，同时显著提升鸡的主动免疫保护效力，对传染性支气管炎强毒的感染起到有效保护作用。本发明涉及的传染性支气管炎病毒疫苗株可应用于制备成鸡传染性支气管炎灭活单苗或联苗等。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书20页序列表3页附图1页19中华。
3、人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书20页序列表3页附图1页10申请公布号CN104130981ACN104130981A1/1页21鸡传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为CK/CH/LLN101135，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是CGMCCNO8790。2权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株在制备鸡传染性支气管炎灭活疫苗中的应用。3一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，其特征在于由灭活后的权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和药学上可接受的免疫佐剂组成。权利要求书CN104130981A1/20页3鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其。
4、在制备灭活疫苗中的应用技术领域0001本发明涉及病毒疫苗株，尤其涉及鸡传染性支气管炎的病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用，本发明属于鸡传染性支气管炎的防治领域。背景技术0002鸡传染性支气管炎AVIANINFECTIOUSBRONCHITIS，IB是由鸡传染性支气管炎病毒INFECTIOUSBRONCHITISVIRUS，IBV引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，其特征是病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。鸡传染性支气管炎自1930年以来在世界各国普遍流行，造成了较大的经济损失。随着病毒的传播和遗传演化，目前IBV。
5、存在多个血清型。0003目前中国大部分地区流行IBV，而且在中国免疫鸡群和非免疫鸡群中均有新型肾致病性IBV在流行。该病作为严重危害我国养鸡业的重大传染病之一，近年来该病原普遍出现许多新的变异株，给我国养殖业带来了新的威胁。为了有效防治该病，有必要研究新型疫苗，现阶段其常规疫苗是世界各国广泛使用的M41血清型的灭活苗或其鸡胚适应弱毒苗H120和H52。但是由于目前IBV血清型众多，现有疫苗均只能提供部分保护或无保护，而IB弱毒疫苗致弱程度难以掌握，可有一定的致病性和传播能力，甚至可能在感染的机体中引起持续的潜伏感染，成为突变的主体或重组变异的供体，加上疫苗的运输、贮存和使用等条件要求较高，使得。
6、致弱活毒疫苗在理论上和实践上都不可能从根本上彻底控制IB的流行。0004灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。目前国内大量应用的M41灭活疫苗在以往的生产中发挥了重要作用，然而，随着我国IB流行态势的复杂化，该灭活疫苗毒株血清型与新的流行毒株已经不能完全匹配，导致传染性支气管炎在免疫鸡群中普遍发生。0005因此，研制对我国流行毒株针对性强的灭活疫苗与相应的活疫苗综合应用迫在眉睫。本发明正是基于以上形势，利用现有研究基础，将筛选并培育的新型鸡传染性支气管炎疫苗株制备成安全、高效的新型疫苗，研究表明，该新型灭活疫苗能够有效抵抗目前我国主要流行传染性支气管炎野。
7、毒株的攻击，对于有效控制鸡传染性支气管炎疫病的持续暴发和流行具有重要意义。发明内容0006本发明所要解决的技术问题是克服现有鸡传染性支气管炎灭活疫苗株M41病毒纤突蛋白S1遗传进化关系上与MASSACHUSETTS相近，本领域技术人员将其归纳为MASS型鸡传染性支气管炎毒株不能够有效防制鸡传染性支气管炎AVIANINFECTIOUSBRONCHITIS，IB流行毒株的攻击，IB的防治效果不理想等缺陷，提供一株新的鸡传染性支气管炎疫苗株病毒纤突蛋白S1遗传进化关系上与LX4株或QX株相近，本领域技术人员将其归纳为LX4型QX样毒株，该疫苗株能够有效抵抗目前我国主要流行传染性支气说明书CN1041。
8、30981A2/20页4管炎野毒株的攻击，可提供良好的免疫保护效力。0007本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的0008本发明将从我国流行的传染性支气管炎流行毒株中筛选出具有典型代表性且经灭活后具有良好抗原性的LX4型QX样鸡传染性支气管炎疫苗株，其形态学观察病毒株尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80120NM的冠状毒，毒病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。0009本发明的一种鸡传染性支气管炎疫苗株，命名为CK/CH/LLN101135，分类命名为传染性支气管炎病毒INFECTIOUSBRONCHITISVIRUS，保藏在中国微。
9、生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年2月21日，其微生物保藏号是CGMCCNO8790。0010本发明所涉及的传染性支气管炎疫苗株CK/CH/LLN101135株其病毒纤突蛋白亚基S1基因序列进化关系分类如附图1所示。S1基因是传染性支气管炎病毒的主要保护性基因，能够刺激机体产生中和抗体，S1基因也是在病毒演化过程中最容易发生变异的基因，且其高变区主要位于S1基因内，因此本发明主要展示本发明涉及毒株的S1基因序列，本发明疫苗株所具有的纤突蛋白S1亚基的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，由SEQIDNO2编码。纤突蛋白亚基。
10、S1基因与SEQIDNO2所示序列相比具有95以上的同源性，且与本发明的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株CK/CH/LLN101135株具有相同或相似免疫效力的病毒株或是本发明所述疫苗株CK/CH/LLN101135株的S1基因突变株，只要突变后的纤突蛋白亚基S1基因与SEQIDNO2所示序列相比具有95以上的同源性就仍落在本发明的保护范围之内。本发明涉及的LX4型QX样疫苗株可在鸡胚或鸡体内持续增殖进化，本领域技术人员可通过分离培育的毒株将S1基因与LX4型QX样毒株的S1基因进行对比，可发现本发明涉及的LX4型QX样疫苗毒株在S1遗传进化关系上的特征。0011将本发明的一种鸡传染性支气管炎疫苗株。
11、CK/CH/LLN101135株灭活后，进行免疫效力评价实验，结果表明，本发明的CK/CH/LLN101135疫苗株经灭活剂灭活处理后仍能保持良好的免疫原性，接种于经MASS型传染性支气管炎活疫苗H120基础免疫的鸡能够显著提升针对LX4型QX样病毒的中和抗体水平，其中10只CK/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度较10只MASS型活疫苗H120基础免疫鸡的血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量不少于6只，且CK/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于MASS型疫苗株H120基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度，说明本发明涉及的CK/CH/。
12、LLN101135株疫苗毒株对鸡传染性支气管炎保护性抗体具有良好的提升效力。同时，CK/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡和MASS型疫苗株H120基础免疫鸡用LX4型QX样强毒攻击后，CK/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体针对LX4型QX样毒株滴度和MASS型活疫苗H120基础免疫鸡的血清中和抗体滴度差异同样显著，其中10只CK/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度较10只MASS型活疫苗H120基础免疫鸡的血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量不少于7只，且CK/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于M。
13、ASS型疫苗株H120基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度，说明本发明涉及的CK/CH/LLN101135株疫苗毒株对鸡传染性支气管炎保护性抗体具有良好的提升效力。安全性试验结果表明，本发明涉及的LX4型QX样鸡传染性支气管炎灭活疫苗对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，说明书CN104130981A3/20页5安全性好。0012本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株在制备鸡传染性支气管炎灭活疫苗中的应用。0013本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种防治鸡传染性支气管炎LX4型QX样的疫苗组合物，其由灭活后的本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株命名为CK/CH/L。
14、LN101135株和药物学上可接受的免疫佐剂组成。0014本发明所述的一种防治鸡传染性支气管炎LX4型QX样的疫苗组合物可参考以下方法制备得到1将本发明涉及的疫苗株CK/CH/LLN101135株培养增殖得到生产用毒种；将生产用毒种接种于鸡胚尿囊腔内，培养，收获病毒尿囊液；2经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液加入灭活剂进行灭活处理，制备抗原；3经灭活检验合格的抗原与佐剂进行乳化，制备成LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗。0015本发明涉及的LX4型QX样鸡传染性支气管炎灭活疫苗的使用方法00161接种途径肌肉或皮下接种。00172接种剂量1羽份0308ML。0018本发明LX4型QX样。
15、鸡传染性支气管炎灭活疫苗免疫后20天产生免疫力，一次免疫持续期为4个月。本发明LX4型QX样毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。附图说明0019图1本发明CK/CH/LLN101135株疫苗株与参考毒株基于病毒纤突蛋白S1基因的遗传进化关系图。具体实施方式0020下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0021实施例1鸡传染性支气管毒株CK/CH。
16、/LLN101135的分离鉴定00221、材料和方法002311现地样品和病毒分离在我们对IBV进行持续的流行病学监测过程中，从我国各地疑似IB感染的养殖场鸡群收集肾脏样品，发病鸡表现呼吸道病的早期临床症状，包括喘气、咳嗽、打喷嚏和气管啰音。死亡鸡进行剖检，可见不同程度的气管炎、肾炎和腺胃炎，蛋鸡群主要表现死亡、产蛋下降以及产畸形蛋。本研究收集的样品来源于免疫过MASS型商品化弱毒疫苗的鸡群。0024病毒分离时，将样品研磨混悬于01的PBS缓冲液，于4经1500G离心10MIN后将上清通过022M的过滤膜进行过滤，接种于911日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种后将胚置于37孵育，每天照胚，经过35次盲。
17、传直到鸡胚培养27天出现侏儒胚，发育障碍、卷曲胚等特征性病变。002512电镜观察样品接种鸡胚后出现典型病变，将尿囊液处理后进行电镜观察，将说明书CN104130981A4/20页615ML尿囊液经过低速1500G离心30MIN后，上清以12000G离心30MIN，取上清，用少许去离子水将离心后的沉淀重悬，通过负染法染色在电镜下进行观察。002613IBV疫苗和毒株商品化MASS型疫苗H120用于免疫攻毒保护试验，按照说明书点眼途径进行接种。本研究分离的LX4型QX样代表株CK/CH/LLN101135株用于免疫保护评价试验，通过REEDMUENCH法测定和计算病毒滴度，接种鸡前将病毒稀释至1。
18、048EID50/100微升，100微升/只鸡进行接种。002714IBV分离株S1基因的克隆和序列测定利用DNASTAR软件的MEGALIGN程序对分离株和参考毒株的S1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行对比和分析，利用DNASTAR软件的CLUSTALV方法对S1基因核苷酸序列进行遗传进化分析，本研究选择的参考毒株用于遗传进化分析，这些毒株代表了我国1997年2011年期间不同时间和不同地区的毒株以及部分国外流行的LX4型QX样IBV毒株。002815动物实验设计以一株LX4型QX样IBV代表毒株CK/CH/LLN101135株为例，60只1日龄SPF鸡分为4组，分别饲养于单独的负压隔离。
19、器，第12组每组20只鸡，第3和4组每组10只。第1、3组在1日龄根据疫苗说明书接种H120疫苗；第2、4组鸡接种无菌的空白尿囊液；其中第1组和第2组在20日龄时滴鼻攻击LX4型QX样IBV代表毒株CK/CH/LLN101135株，第3组和第4组分别以相同途经接种无菌的空白尿囊液。002916动物实验样品采集第1、2组在攻毒后5天每组取10只鸡捕杀，第3组和第4组分别取5只捕杀，采集捕杀鸡的气管和肾脏，分别单独处理置于300微升的病毒分离液50甘油，50PBS中，保存于20条件下以备病毒分离，每组剩余鸡进行临床观察，观察30天后捕杀进行剖检，免疫鸡在免疫后3,6,9,12,15和18天采血，分。
20、离血清并测定血清抗体，攻毒鸡攻毒后3,6,9,12和15天同样采血，分离血清进行抗体检测。003017动物实验样品中病毒的分离和RTPCR鉴定攻毒后采集的每只鸡样品均用于病毒分离，每个样品研磨后按10比例加入01PBS，先以1500G在4离心10MIN，上清经022M的滤膜过滤后接种于911日龄SPF鸡胚尿囊腔内，02ML/胚，每个样品接种3枚胚，接种后鸡胚置37继续孵育，每天照胚，每种样品接种后72小时取其中2枚胚尿囊液进行RTPCR扩增，剩余鸡胚一周后观察胚体的特征性病变，如是否出现侏儒胚，发育停滞以及卷曲胚。经过13代盲传，鸡胚死亡或出现IB典型的特征性病变则判为样品IBV阳性。0031。
21、为了确保判断的准确定，将接种鸡胚的尿囊液进行RTPCR扩增鉴定，取200微升尿囊液用于RTPCR扩增，抽提总RNA，利用N引物进行反转录，引物NANDN用来扩增包括大部分N基因和3UTR部分区域在内的约1600BP大小的片段，扩增的PCR产物通过1的琼脂糖凝胶电泳进行分析。003218抗体检测将采集的血清样本利用IDEXX公司的商品化ELISA试剂盒进行检测，并根据试剂盒说明书计算血清抗体阳性比率。00332结果003421病毒检测和分离结果0035从疑似IB感染的样品中分离到IBV病毒，对接种鸡胚后不同代次的尿囊液进行电镜观察，所有分离株均有冠状病毒粒子的典型形态特征，而且样品中无其他外源病。
22、毒存在。0036本发明将分离得到的传染性支气管炎病毒野生强毒株进行鸡胚适应驯化，获得高说明书CN104130981A5/20页7度适应鸡胚且保持良好遗传特性和免疫原性的传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为CK/CH/LLN101135株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年2月21日，其微生物保藏号是CGMCCNO8790。003722IBV分离毒株的遗传进化分析0038通过对分离的IBV毒株CK/CH/LLN101135株和参考毒株的S1基因序列的遗传进化分析，表明我国分离毒株可分为5个不同的基因群或基因型，如。
23、附图1所示，分离的IBV毒株CK/CH/LLN101135株与已公开参考毒株LX4和QX株同属于一个基因型，该群毒株为我国主要流行毒株，主要包括我国1997年2009年期间分离的毒株。并通过对比发现我国分离的LX4型QX样毒株与国外毒株相似性较高，表明不同国家流行的LX4型QX样毒株来源相似。003923动物实验临床观察结果0040试验鸡用病毒攻击后3天开始出现临床症状，表现羽毛蓬乱、不食或少食，但均不表现明显的呼吸道症状，对照鸡表现正常，攻毒鸡则精神不振，聚堆。攻毒后5天鸡群均发病，攻毒后57天，其中CK/CH/LLN101135株病毒攻击组死亡25只，死亡鸡解剖发现均出现肾脏肿大，苍白，输。
24、尿管和肾脏均有尿酸盐沉积，表明CK/CH/LLN101135株毒株为致肾脏病变型，同时还发现攻毒后死亡的SPF鸡盲肠扁桃体均有出血。但是在腺胃和输卵管均未观察到明显病变，发病期为攻毒后310天。004124MASS型疫苗H120对分离毒的保护性0042虽然分离毒攻击H120免疫后的鸡均未发现死亡，但是部分免疫鸡出现临床症状，说明H120疫苗不能对分离的CK/CH/LLN101135株病毒提供完全保护。攻毒后5天采集样品进行病毒学检测，结果见表1。可见非免疫对照鸡的气管和肾脏均分离到病毒，而所有免疫H120的鸡在气管中也同样都分离到了病毒，在大多数免疫鸡的肾脏中也分离到病毒，说明用MASS型疫苗。
25、毒免疫不能对我国分离的CK/CH/LLN101135株毒株攻击提供对肾脏和气管的保护。004325血清学检测结果0044对免疫鸡和攻毒鸡在不同时间采集的血清进行检测，结果见表1。每组免疫鸡在H120免疫后6天均有1只鸡抗体未能转阳，免疫后15天所有H120免疫鸡的抗体均转阳性，从测定的结果来看，野毒感染的抗体转阳要早于疫苗毒免疫后抗体转阳的时间，这也进一步反应CK/CH/LLN101135株毒株免疫原性较强。0045表1CK/CH/LLN101135株攻毒后血清学反应及病毒分离结果0046说明书CN104130981A6/20页800473结论0048从我国不同地区分离到不同的LX4型QX样传。
26、染性支气管炎病毒代表毒株CK/CH/LLN101135株，为典型的LX4型QX样代表毒株，该型毒株致病力强，以往应用于IBV防控的MASS型疫苗株不能有效保护该型毒株CK/CH/LLN101135株的攻击。因此，研究基于我国主要流行的LX4型QX样传染性支气管炎系列疫苗无论对于我国还是其他国家的IB防控程序都具有重要意义。0049实施例2本发明传染性支气管炎灭活疫苗株CK/CH/LLN101135株的免疫效力实验00501、材料与方法005111基础免疫用疫苗0052MASS型传染性支气管炎灭活疫苗H120株，购自哈尔滨维科生物技术开发公司，疫苗保存条件及有效期15以下保存，有效期为12个月。。
27、按瓶签标注羽份用灭菌生理盐水稀释后吸取疫苗，每只鸡点眼滴鼻接种1羽份。005312病毒LX4型QX样传染性支气管炎病毒CK/CH/LLN101135株的增殖0054使用10日龄SPF鸡胚对CK/CH/LLN101135株种毒进行10000倍稀释，每枚胚通过尿囊腔接种，每胚接种100L，培养条件为从37孵育72H，72H后，将鸡胚取出，观察鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液。005513病毒滴度测定0056取增殖的CK/CH/LLN101135鸡胚尿囊病毒液，分别依次作10倍系列稀释；选择4个稀释倍数104107或105108的病毒悬液分别接种5枚10日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚接种100L，将鸡胚。
28、置37温箱内孵育1周，每天照胚，弃去24H之内死亡胚，记录1周内鸡胚的感染数和生存数，按REEDMUENCH法计算EID50。以106EID50/100L尿囊液为合格。80OC保存备用。005714无菌检验0058将CK/CH/LLN101135株病毒尿囊液按现行中华人民共和国兽药典附录进行无菌检验。005915CK/CH/LLN101135病毒液的灭活0060将检验合格的病毒液，加入灭活剂甲醛灭活，使其终浓度为02，随即充分摇匀。然后置37条件下灭活，24小时后灭活完毕，灭活后的病毒液置28保存备用。006116CK/CH/LLN101135病毒液的灭活检验说明书CN104130981A7/。
29、20页90062取灭活后的尿囊液，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚02ML，置37条件下孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过2个，逐个检查鸡胚，应不出现失水、蜷缩、侏儒胚等特征性病痕，并盲传1代，应无失水、蜷缩、侏儒胚等特征性病痕认为灭活完全。006317油乳剂灭活疫苗的制备0064分别利用注射用白油和司班80以及硬脂酸铝制备油相，CK/CH/LLN101135灭活尿囊液与吐温80制备水相，并加入防腐剂采用乳化设备进行充分乳化。将乳化合格疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，28保存，以备检验。006518传染性支气管炎油乳剂灭活疫苗的效力评价006640只1日龄。
30、SPF鸡随机分为2组每组20只，于负压隔离器中饲养并全部免疫MASS型传染性支气管炎活疫苗H120株，1羽份/只。其中一组雏鸡于H120首免后20天皮下免疫接种LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135株,其中每羽份疫苗在灭活前病毒含量为106EID50，每只皮下接种05ML。另一组雏鸡作为H120活疫苗基础免疫对照组。加强免疫组于免疫后20天两组各取10只鸡采血并分离血清，应用血清中和试验方法检测每只鸡的血清中和抗体滴度。同时将2组剩余雏鸡用强毒CK/CH/LLN101135进行点眼和滴鼻攻击，每只攻毒剂量不少于1050EID50，攻毒后5天捕杀加强免疫组及基础免疫对。
31、照组鸡，分别采血并分离血清，同时采集每只鸡的肾脏、气管，对采集的血清分别测定针对CK/CH/LLN101135株的中和效价，同时测定采集的IBV靶器官气管和肾脏，进行病毒分离率测定。通过对比攻毒前和攻毒后加强免疫组血清抗体滴度与基础免疫对照鸡之间的差异，评价传染性支气管炎灭活疫苗的效力。00672结果006821CK/CH/LLN101135株病毒液的病毒滴度测定结果0069增殖的尿囊液中病毒含量为1062EID50/01ML。007022无菌检验结果0071增殖病毒的鸡胚尿囊液经检验无细菌污染。007223LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗免疫效力评价结果0073MASS型活疫苗首免后经L。
32、X4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135加强免疫后20天的10只鸡血清中和抗体滴度较10只基础免疫对照鸡的最高血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量达到8只，且灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度。同时，灭活疫苗加强免疫后攻毒的10只鸡血清中和抗体滴度较10只攻毒的基础免疫对照鸡血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量达到9只，且灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度。攻毒鸡靶器官病毒分离检测结果显示，加强免疫鸡气管和肾脏中病毒的分离阳性率比基础免疫对照组低203023/10。结果见表2。0074表。
33、2加强免疫组和基础免疫对照组血清抗体中和效价及靶器官病毒分离率0075说明书CN104130981A8/20页1000763试验结论0077MASS型活疫苗首免后以LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗加强免疫能够有效刺激机体提升病毒中和抗体水平，说明了传染性支气管炎灭活疫苗的有效性。0078实施例3本发明LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135的安全性实验00791实验材料008011试验用疫苗0081按照实施例2的方法制备了4个批次疫苗，4个批次的批号分别为2012001、2012002、2012003、2012004，500羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期28保存，。
34、有效期为12个月。按瓶签标注羽份用灭菌注射器吸取疫苗，每只鸡皮下或肌肉接种。008212实验动物00831周龄SPF鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。00842实验方法008521SPF鸡安全试验0086211单剂量接种试验0087单剂量接种安全试验用30只1日龄和30只6日龄雏鸡，2012001和2012002批次疫苗每批疫苗使用10只1日龄雏鸡，另设对照组鸡10只；2012003和2012004批次疫苗每批疫苗使用10只6日龄雏鸡，另设对照组鸡10只，试验组皮下或肌肉接种LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135株,其中每羽份疫苗在灭活前病毒含量10。
35、6EID501羽份05ML，对照组皮下接种等量的生理盐水，观察14日；剖检，观察是否出现因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应或者鸡传染性支气管炎特异病变如鸡气管、鼻窦内有浆液性或卡他性分泌物，肾脏肿胀，或出现典型的“花斑肾”变化。说明书CN104130981A109/20页110088212单剂量重复接种试验0089单剂量重复接种安全试验用50只6日龄雏鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡10只，试验组以皮下或肌肉接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后以相同接种途径接种相同剂量的疫苗。对照组皮下注射等量的生理盐水，观察14日；剖检，观察是否出现因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应或者鸡传染性支气管炎。
36、特异病变。0090213大剂量接种组试验0091大剂量接种试验共用30只6日龄SPF雏鸡，2012001和2012002批次疫苗各用10只，另设对照组鸡10只，试验组皮下或肌肉接种疫苗2羽份1ML，对照组注射等量的生理盐水，观察14日。剖检，观察是否出现因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应或者鸡传染性支气管炎特异病变。009222种鸡的安全试验0093221单剂量接种试验0094单剂量接种安全试验用50只AA种鸡，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，试验组皮下接种疫苗1羽份，对照组皮下注射等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。0095212单剂量重复接种试验0096单剂量。
37、重复接种安全试验用50只AA种鸡，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，试验组皮下或肌肉接种疫苗1羽份05ML，每只鸡于14天后以相同接种途径重复接种相同剂量的疫苗。对照组皮下注射等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。0097213大剂量接种组试验0098大剂量接种试验共用50只AA种鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡10只，试验组皮下或肌肉接种疫苗1ML，对照组注射等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。00993实验结果0100在实验室条件下，4批本疫苗批号2012001、2012002、2012003、2012004的安全性实验结果表明，1日龄和。
38、6日龄SPF鸡颈部皮下注射05ML该疫苗，接种14日后，注射部位和全身无任何不良反应，证明雏鸡可安全使用该疫苗；6日龄的SPF鸡，以不同途径接种颈部皮下或胸部肌肉注射，每只注射1ML2羽份本疫苗后，观察14日，注射部位吸收良好，鸡只无全身不良反应，证实不同途径接种均安全；用6日龄SPF鸡在间隔1周后连续接种2次，观察14日，鸡只注射部位和全身无任何不良反应，说明该疫苗可重复安全使用；本疫苗以1ML/羽2羽份接种高产期种鸡，观察2个月，结果发现，鸡群对疫苗的应激反应较小，产蛋量影响不大，与非免疫组对照，各种生产性能指标无明显差异P005。010131SPF雏鸡安全试验0102从SPF雏鸡单剂量接。
39、种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，鸡传染性支气管炎活疫苗对3日龄的SPF雏鸡安全可靠，生理活动正常，剖检无传染性支气管炎特异病变；证明了该疫苗对疫苗推荐最小日龄鸡安全可靠，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验数据无明显差异。试验数据详见表3、表4和表5。0103表3鸡传染性支气管炎灭活疫苗雏鸡单剂量接种安全试验说明书CN104130981A1110/20页12010401050106表4鸡传染性支气管炎灭活疫苗雏鸡单剂量重复接种安全试验01070108表5鸡传染性支气管炎灭活疫苗雏鸡大剂量安全试验0109说明书CN104130981A1211/20页1301103。
40、2种鸡安全试验从AA种鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，鸡传染性支气管炎灭活疫苗对种鸡安全可靠，生理活动正常，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验产蛋数及孵化率无明显差异。试验数据详见表6、表7和表8。0111表6鸡传染性支气管炎灭活疫苗种鸡单剂量接种安全试验01120113表7鸡传染性支气管炎灭活疫苗种鸡单剂量重复接种安全试验0114说明书CN104130981A1312/20页140115表8鸡传染性支气管炎灭活疫苗种鸡大剂量安全试验011601174实验结论011841本发明鸡传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135株对雏鸡是安全的。0。
41、11942本发明鸡传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135株对产蛋种鸡是安全的。0120实施例4本发明疫苗株CK/CH/LLN101135株的免疫持续期实验01211材料和方法012211疫苗0123按照实施例2所述的方法制备的鸡传染性支气管炎灭活疫苗批号为2012001；基础免疫用MASS型传染性支气管炎活疫苗H120购自哈尔滨维科生物技术开发公司。012412试验用鸡01251日龄SPF雏鸡。012613攻击用强毒0127CK/CH/LLN101135株强毒1060EID50/01ML保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是CGMCCNO8790。01281。
42、4实验动物分组01291日龄SPF雏鸡200只，随机分为10组，每组20只，其中灭活疫苗加强免疫组10组，基础免疫对照组10组。说明书CN104130981A1413/20页15013015免疫0131用MASS型传染性支气管炎活疫苗H120免疫所有10组小鸡，按照疫苗使用说明书接种，1羽份/只；活疫苗基础免疫后30天以2012001批次灭活疫苗加强免疫其中5组，剩余5组雏鸡作为基础免疫对照组。加强免疫组免疫疫苗的剂量为一个羽份05ML，对照组鸡于活疫苗基础免疫后30天颈部皮下接种05ML生理盐水。013216免疫后病毒中和抗体动态监测01331组加强免疫鸡和1组基础免疫对照鸡分别在加强免疫后。
43、20天各组捕杀10只鸡，采血并分离血清，用病毒中和试验方法测定相同日龄的加强免疫鸡和基础免疫对照组鸡的中和抗体滴度，统计结果。捕杀当日将剩余鸡攻击CK/CH/LLN101135株强毒，攻毒剂量不少于1050EID50/只，攻毒后5天捕杀这两组所有剩余鸡，分别收集血清，测定针对CK/CH/LLN101135株病毒的中和效价，统计结果，同时采集每只鸡肾脏和气管，进行病毒分离检测，统计病毒重新分离率。0134剩余4组加强免疫鸡和4组基础免疫对照鸡按上述方法和程序分别在加强免疫后60、90、120、150日测定血清中和抗体效价和攻毒后肾脏和气管病毒重新分离率，评价传染性支气管炎灭活疫苗免疫后提供的免疫。
44、持续期。01352实验结果013621抗体持续期01372012001批次疫苗以1羽份的剂量免疫雏鸡后20、60、90、120日，灭活疫苗加强免疫鸡血清中和抗体滴度均较相同日龄的基础免疫对照鸡的最高血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量达到69只，且灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度。同时，灭活疫苗加强免疫后攻毒的10只鸡血清中和抗体滴度较10只攻毒的基础免疫对照鸡血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量达到69只，且灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度。攻毒鸡靶器官病毒分离检测结果显示，加强免疫鸡气管和肾脏中病毒的分。
45、离阳性率比基础免疫对照组低203023/10。而灭活苗加强免疫雏鸡后150日，灭活疫苗加强免疫鸡血清中和抗体滴度较相同日龄的基础免疫对照鸡的最高血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量仅达到4只，灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度。同时，灭活疫苗加强免疫后攻毒的10只鸡血清中和抗体滴度较10只攻毒的基础免疫对照鸡血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量达到5只，且灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度。攻毒鸡靶器官病毒分离检测结果显示，加强免疫鸡气管和肾脏中病毒的分离阳性率比基础免疫对照组低101/10。结果见表913，从。
46、结果可见传染性支气管炎灭活疫苗加强免疫后150天中和抗体滴度高于对照组2倍以上的鸡数量达不到5只，说明疫苗免疫后中和抗体滴度下降，免疫保护效率降低，鉴于此，将传染性支气管炎灭活疫苗的免疫持续期定为4个月。0138表9免疫后20天加强免疫组和基础免疫对照组血清抗体中和效价及靶器官病毒分离率0139说明书CN104130981A1514/20页1601400141表10免疫后60天加强免疫组和基础免疫对照组血清抗体中和效价及靶器官病毒分离率0142说明书CN104130981A1615/20页170143表11免疫后90天加强免疫组和基础免疫对照组血清抗体中和效价及靶器官病毒分离率01440145。
47、说明书CN104130981A1716/20页180146表12免疫后120天加强免疫组和基础免疫对照组血清抗体中和效价及靶器官病毒分离率01470148表13免疫后150天加强免疫组和基础免疫对照组血清抗体中和效价及靶器官病毒分离率0149说明书CN104130981A1817/20页19015001513实验结论0152本发明疫苗免疫持续期为4个月。0153实施例5本发明LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗株CK/CH/LLN101135株与MASS型传染性支气管炎灭活疫苗株M41株的免疫效力对比实验01541、材料与方法015511基础免疫用疫苗0156MASS型传染性支气管炎活疫苗H1。
48、20株和传染性支气管炎灭活疫苗M41株均购自哈尔滨维科生物技术开发公司，疫苗保存条件及有效期15以下保存，有效期为12个月。按瓶签标注羽份用灭菌生理盐水稀释后吸取疫苗，每只鸡点眼滴鼻接种1羽份。015712LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗的制备0158按照实施例2方法制备。015913传染性支气管炎灭活疫苗的效力评价016040只1日龄SPF鸡随机分为4组每组20只，于负压隔离器中饲养并全部免疫MASS型传染性支气管炎活疫苗H120株，1羽份/只。其中第1组雏鸡于H120首免后20天皮下免疫接种LX4型QX样传染性支气管炎灭活疫苗CK/CH/LLN101135株,其中每羽份疫苗在灭活前病毒。
49、含量为106EID50，每只皮下接种05ML。第2组于H120首免后20说明书CN104130981A1918/20页20天皮下免疫接种MASS型传染性支气管炎灭活疫苗M41株，每只皮下接种05ML，另外第3和4组雏鸡分别作为作为H120活疫苗基础免疫对照组。加强免疫组于免疫后20天两组各取10只鸡采血并分离血清，应用血清中和试验方法检测每只鸡的血清中和抗体滴度。同时将第1和3组剩余雏鸡用强毒CK/CH/LLN101135或进行点眼和滴鼻攻击，每只攻毒剂量不少于1050EID50，攻毒后5天捕杀加强免疫组及基础免疫对照组鸡，分别采血并分离血清，同时采集每只鸡的肾脏、气管，对采集的血清分别测定针对CK/CH/LLN101135株的中和效价，同时测定采集的IBV靶器官气管和肾脏，进行病毒分离率测定。通过对比攻毒前和攻毒后加强免疫组血清抗体滴度与基础免疫对照鸡之间的差异，评价传染性支气管炎灭活疫苗的效力。与此相对应，将第2和4组剩余雏鸡用强毒M41或进行点眼和滴鼻攻击后以同步方法测定针对CK/CH/LLN101135株的中和效价通过对比攻毒前和攻毒后加强免疫组血清抗体滴度与基础免疫对照鸡之间的差异，评价MASS型传染性支气管炎灭活疫苗对LX4型QX样毒株的免疫效力。01612结果016221LX4型QX样。