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1、10申请公布号CN101974097A43申请公布日20110216CN101974097ACN101974097A21申请号201010525618122申请日20101029C08B37/00200601C12S3/0220060171申请人中国药科大学地址210009江苏省南京市童家巷24号72发明人周长林奚涛高宇王慧窦洁74专利代理机构南京苏科专利代理有限责任公司32102代理人孙立冰54发明名称一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法57摘要本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法，其特征是现有的提取分离方法基础上，浓缩步骤采用超滤浓缩，CELLULOSEDE52离子。
2、交换柱层析后再次进行超滤浓缩，SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析后采用透析除杂质。本发明着重于海胆黄多糖的分离纯化方法及其规模化提纯工艺，不仅可以得到高产率、高纯度的海胆黄多糖，也为其进入工业化生产提供技术基础。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN101974101A1/1页21一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法，包括将光棘球海胆黄脱脂、热水浸提、木瓜蛋白酶法去蛋白、浓缩、乙醇沉淀、CELLULOSEDE52离子交换柱层析、SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析、浓缩、干燥，其特征是浓缩步骤采用超滤浓缩，CELLULO。
3、SEDE52离子交换柱层析后再次进行超滤浓缩，SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析后采用透析除杂质。2权利要求1的分离纯化方法，其中超滤步骤采用截流分子量为100K的超滤膜。3权利要求1的分离纯化方法，其中透析用的是截留分子量为14000DA的透析袋。4权利要求1的分离纯化方法，其中木瓜蛋白酶去蛋白时加入06W/W的木瓜蛋白酶。5权利要求1的分离纯化方法，依次包括下列步骤1丙酮脱脂以光棘球海胆黄为原料，加入等体积的丙酮，搅拌，静置，弃上层丙酮，减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉；2热水浸提将海胆黄丙酮粉置于1050倍水中，90煮210H，收集提取液，减压浓缩至原提取液体积的1/2以下；3木。
4、瓜蛋白酶法去蛋白调海胆黄提取液PH65，加入06W/W的木瓜蛋白酶，60保温2024H，90加热15MIN使酶失活，离心收集上清液；4超滤浓缩选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质；经超滤后，浓缩至原溶液体积的1/4；5乙醇沉淀向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入26倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤，真空干燥得海胆黄粗多糖；6CELLULOSEDE52离子交换柱层析将海胆黄粗多糖配成50MG/ML的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱，双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分；7超滤浓缩选择截流。
5、分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20MG/ML；8SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析纯化浓缩后的多糖组分，过平衡好的SEPHACRYLS400HR层析柱，用双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚硫酸法逐管测定糖含量，合并相同组分；9透析除杂质选择截流分子量为14000DA的透析袋对8中收集的组分进一步除杂质，50水浴透析，磁力搅拌，每34H更换水浴，透析13天；10冷冻干燥将9收集的组分浓缩后冷冻干燥，得到海胆黄多糖。权利要求书CN101974097ACN101974101A1/5页3一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法技术领域0001本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种一。
6、种海胆黄多糖规模化分离纯化方法。背景技术0002各国科学家通过对不同来源的多糖进行广泛研究，发现多糖具有抗肿瘤、心血管疾病治疗、免疫调节等作用。海胆黄多糖是从光棘球海胆中分离纯化得到的多糖，利用物理化学分析和GC分析对其结构进行鉴定，证明为首次从海胆黄中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。药理实验研究表明，海胆黄多糖不但具有免疫调节活性，还有具有天然抗肿瘤活性。1985年香菇多糖首先在日本被开发成注射液成进入临床应用，作为免疫调节剂和肿瘤放化疗治疗的辅助药物，效果显著。从此，关于多糖类药物的研究引起了世界各国科学家的广泛关注，逐渐成为新药研究与开发的一个热门领域。多糖本身结构多样，分离方法复杂，需要。
7、经过多个步骤多种方法并用才能得到较为理想的纯度要求，但在分离过程中样品的损失也不可避免。0003据刘纯慧海胆黄多糖SEP的制备及其抗肿瘤作用研究，刘纯慧，叶亮，林亲雄，奚涛等，JPHARMACEUTICALBIOTECHNOLOGY2006，136429432等人报道，海胆黄多糖的提取流程一般为丙酮脱脂、热水浸提20倍水，90煮6H，反复提取3次、木瓜蛋白酶W/V05SEVAG法10次去蛋白、减压浓缩、乙醇沉淀、CELLULOSEDE52离子交换柱层析、SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析纯化、减压浓缩、冷冻干燥。其中SEVAG法是根据蛋白质在氯仿和正丁醇等有机溶剂中变性的特点，将氯仿。
8、和正丁醇按51配成混合试剂加入多糖提取液，或先将氯仿按多糖提取液1/5体积加入，随之再加入氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈振摇1520MIN，蛋白质变性成胶状，存在于水相与溶剂相的交界面，离心除去水层与溶剂层交界处的变性蛋白。此法条件温和，缺点是效率不高，多糖收率低，一般要重复5次甚至更多次数才能去尽蛋白。这种方法需要使用大量的有机试剂，操作要求严格，周期长。此外减压浓缩只能减少样品体积，不能出去杂质，这些对于海胆黄多糖的工业规模化生产造成不便。经研究，海胆黄多糖具有多种药理作用，因此，改进海胆黄多糖分离纯化技术和规模，才能更好的开发利用。发明内容0004本发明公开了一种分离纯化海胆黄多糖规模化分。
9、离纯化方法，本发明的方法分离得到海胆黄多糖产率高，纯度好，提取成本低，规模化生产价值高。0005目前文献公开的制备方法主要包括将光棘球海胆黄脱脂、热水浸提、木瓜蛋白酶法去蛋白、浓缩、乙醇沉淀、CELLULOSEDE52离子交换柱层析、SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析、浓缩、干燥，本发明在此技术上进行改进，将现有的减压浓缩改进成采用超滤浓缩，并且CELLULOSEDE52离子交换柱层析后再次进行超滤浓缩，在SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析后增加透析除杂质步骤。0006其中超滤步骤优选采用截流分子量为100K的超滤膜。说明书CN101974097ACN101974101A2。
10、/5页40007优选透析用的是截留分子量为14000DA的透析袋。0008木瓜蛋白酶去蛋白时优选加入06W/W的木瓜蛋白酶。优选的去蛋白方法为调海胆黄提取液PH65，加入06W/W的木瓜蛋白酶，60保温2024H，90加热15MIN使酶失活，离心收集上清液。0009实验发现，加入木瓜蛋白酶的量对海胆黄多糖的收率有一定影响，对比文件中采用05，其收率大概80，发明人曾尝试过不同的酶浓度进行去蛋白，加入考马斯亮蓝试剂在595NM处检测溶液的吸光度，结果如附图1所示，在2H时，酶浓度是07的提取液中蛋白含量为0441，低于06的蛋白含量0447，但是2H后蛋白含量总体水平明显高于06。10H木瓜蛋白。
11、酶去蛋白基本达到平衡。只有当酶浓度为06时，海胆黄多糖提取液中的蛋白含量在10H内最低，相对于04、05、07、08去蛋白效果最好，多糖收率能达到89。0010现有技术采用的是减压浓缩，本发明进一步研究发现，采用超滤将大大提高海胆黄多糖的收率，并且有效节约生产时间，降低生产成本。0011超滤在工业生产中普遍使用，超滤不但能快速截留多糖分子，在浓缩体积的同时还能将样品中的杂质和小分子蛋白，包括本提取方法中使用的分子量为21000的木瓜蛋白酶都可以较为彻底的清除。文献中报道的使用木瓜蛋白酶SEVAG法组合去蛋白，多糖回收率约为70，本发明使用木瓜蛋白酶超滤组合法，多糖回收率为95，最大限度的降低除。
12、蛋白过程中多糖的损失，并避免使用大量有机试剂，多糖的生物活性得以保护。0012更详细更优选的制备方法如下00131丙酮脱脂以光棘球海胆黄为原料，加入等体积的丙酮，搅拌，静置，弃上层丙酮，减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉；00142热水浸提将海胆黄丙酮粉置于1050倍水中，90煮210H，收集提取液，减压浓缩至原提取液体积的1/2以下；00153木瓜蛋白酶法去蛋白调海胆黄提取液PH65，加入06W/W的木瓜蛋白酶，60保温2024H，90加热15MIN使酶失活，离心收集上清液；00164超滤浓缩选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质；经超滤后，浓缩至原溶液体积的。
13、1/4；00175乙醇沉淀向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入26倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤，真空干燥得海胆黄粗多糖；00186CELLULOSEDE52离子交换柱层析将海胆黄粗多糖配成50MG/ML的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱，双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分；00197超滤浓缩选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20MG/ML；00208SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析纯化浓缩后的多糖组分，过平衡好的SEPHACRYLS400HR层析柱，用双蒸水进行洗脱，分部收集，。
14、苯酚硫酸法逐管测定糖含量，合并相同组分；00219透析除杂质选择截流分子量为14000DA的透析袋对8中收集的组分进一步除杂质，50水浴透析，磁力搅拌，每34H更换水浴，透析13天；说明书CN101974097ACN101974101A3/5页5002210冷冻干燥将9收集的组分浓缩后冷冻干燥，得到海胆黄多糖。0023本发明采用超滤和透析，并且找到了木瓜蛋白酶的最佳浓度进行除蛋白，使得海胆黄粗多糖的收率由056提高到082，海胆黄多糖的收率由63提高到10，一次纯化后的海胆黄多糖纯度由879提高到936。分离纯化周期减少至原周期1/2，收率提高近一倍。本发明着重于海胆黄多糖的分离纯化方法及其规。
15、模化提纯工艺，不仅可以得到高产率、高纯度的海胆黄多糖，也为其进入工业化生产提供技术基础。附图说明0024图1是木瓜蛋白酶解时蛋白酶用量与去蛋白效果图0025图2是CELLULOSEDE52离子交换柱50CM75CM洗脱曲线0026图3是SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析58CM50CM洗脱曲线0027图4是海胆黄多糖精品HPLC图谱，纯度为936具体实施方式0028实施例10029以新鲜的光棘球海胆50KG为原料，取黄称重约10KG，切成小块，置于搅拌罐中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30MIN，弃上层丙酮，反复8次至丙酮层基本无色为止，最后将丙酮减压挥干，研磨制成。
16、海胆黄丙酮粉15KG。将15KG海胆黄丙酮粉置于30倍水112L中，90煮6H，提取2次，收集提取液，减压浓缩至56L。木瓜蛋白酶法去蛋白，调整海胆黄提取液PH65，加入06W/W的木瓜蛋白酶，60保温24H，90加热15MIN使酶失活，离心收集上清液。选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质。经超滤后，浓缩至14L。向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入4倍体积56L的无水乙醇，4放置过夜，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，最后经真空干燥得海胆黄粗多糖043KG。将海胆黄粗多糖配成50MG/ML的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱50CM75CM。
17、。双蒸水洗脱，流速5ML/MIN，每管5MIN分部收集，苯酚硫酸法在490NM处逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分。选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20MG/ML。浓缩后的多糖组分，过平衡好的SEPHACRYLS400HR层析柱58CM50CM，双蒸水洗脱，流速05ML/MIN，每管10MIN分部收集。苯酚硫酸法在490NM处逐管测定糖含量，合并相同组分。选择截流分子量为14000DA的透析袋对SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析中收集的相同组分进一步除杂质，50水浴透析，磁力搅拌，每34H更换水浴，透析3天。将去除杂质后组分浓缩至一定体积冷冻干燥。
18、，得到精品海胆黄多糖00422KG。AGILENT高效液相色谱系统，采用SHODEXSUGARKS805色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为乐百氏纯净水，样品浓度为50MG/ML，进样量20UL，流速10ML/MIN，柱温30，记录样品色谱曲线，检测纯度为934。各步骤收率见表10030表1海胆黄多糖分离纯化收率说明书CN101974097ACN101974101A4/5页600310032实施例20033以新鲜的光棘球海胆100KG为原料，取黄称重约20KG，切成小块，置于搅拌罐中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30MIN，弃上层丙酮，反复数次至丙酮层基本无色为止约68次。
19、，最后将丙酮减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉3KG。将3KG海胆黄丙酮粉置于30倍水225L中，90煮6H，提取2次，收集提取液，减压浓缩至112L。木瓜蛋白酶法去蛋白，调整海胆黄提取液PH65，加入06W/W的木瓜蛋白酶，60保温20H，90加热15MIN使酶失活，离心收集上清液。选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质。经超滤后，浓缩至28L。向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入4倍体积112L的无水乙醇，4放置过夜，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，最后经真空干燥得海胆黄粗多糖084KG。将海胆黄粗多糖配成50MG/ML的水溶液，过平衡好的DE52纤。
20、维素离子交换柱58CM100CM。双蒸水洗脱，流速5ML/MIN，每管5MIN分部收集，苯酚硫酸法在490NM处逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分。选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20MG/ML。浓缩后的多糖组分，过平衡好的SEPHACRYLS400HR层析柱58CM50CM，双蒸水洗脱，流速05ML/MIN，每管10MIN分部收集。苯酚硫酸法在490NM处逐管测定糖含量，合并相同组分。选择截流分子量为14000DA的透析袋对SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析中收集的相同组分进一步除杂质，50水浴透析，磁力搅拌，每34H更换水浴，透析3天。将去除。
21、杂质后组分浓缩至一定体积冷冻干燥，得到精品海胆黄多糖0084KG。AGILENT高效液相色谱系统，采用SHODEXSUGARKS805色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为乐百氏纯净水，样品浓度为50MG/ML，进样量20UL，流速10ML/MIN，柱温30，记录样品色谱曲线，检测纯度为94。各步骤收率见表20034表2海胆黄多糖分离纯化收率0035说明书CN101974097ACN101974101A5/5页70036实施例30037以新鲜的光棘球海胆200KG为原料，取黄称重约40KG，切成小块，置于搅拌罐中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30MIN，弃上层丙酮，反复数次。
22、至丙酮层基本无色为止约68次，最后将丙酮减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉6KG。将3KG海胆黄丙酮粉置于30倍水450L中，90煮6H，提取2次，收集提取液，减压浓缩至224L。木瓜蛋白酶法去蛋白，调整海胆黄提取液PH65，加入06W/W的木瓜蛋白酶，60保温22H，90加热15MIN使酶失活，离心收集上清液。选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质。经超滤后，浓缩至56L。向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入4倍体积224L的无水乙醇，4放置过夜，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，最后经真空干燥得海胆黄粗多糖165KG。将海胆黄粗多糖配成50MG/ML的。
23、水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱75CM75CM。双蒸水洗脱，流速5ML/MIN，每管5MIN分部收集，苯酚硫酸法在490NM处逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分。选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20MG/ML。浓缩后的多糖组分，过平衡好的SEPHACRYLS400HR层析柱58CM50CM，双蒸水洗脱，流速05ML/MIN，每管10MIN分部收集。苯酚硫酸法在490NM处逐管测定糖含量，合并相同组分。选择截流分子量为14000DA的透析袋对SEPHACRYLS400HR凝胶过滤柱层析中收集的相同组分进一步除杂质，50水浴透析，磁力搅拌，每34H更换水浴，透析3天。将去除杂质后组分浓缩至一定体积冷冻干燥，得到精品海胆黄多糖0173KG。AGILENT高效液相色谱系统，采用SHODEXSUGARKS805色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为乐百氏纯净水，样品浓度为50MG/ML，进样量20UL，流速10ML/MIN，柱温30，记录样品色谱曲线，检测纯度为936。各步骤收率见表30038表3海胆黄多糖分离纯化收率0039说明书CN101974097ACN101974101A1/2页8图1图2说明书附图CN101974097ACN101974101A2/2页9图3图4说明书附图CN101974097A。