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1、10申请公布号CN104099381A43申请公布日20141015CN104099381A21申请号201410356670722申请日20140724C12P7/6420060171申请人宁波大学地址315211浙江省宁波市宁波市江北区风华路818号72发明人朱竹君陈海敏钱飞箭严小军74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称一种生产羟基脂肪酸的方法57摘要本发明的目的在于提供一种生产羟基脂肪酸的方法，是用脂氧化酶催化具有顺，顺1,4戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，该脂氧化酶的氨基酸序列为SEQIDNO2。本发明中使用的克隆酶PHL。
2、OX2具有多种功能，能通过一步反应结合还原反应催化长链多不饱和脂肪酸，特别是C20脂肪酸产生单位点和双位点羟基化脂肪酸，适用于以鱼油等含C20脂肪酸丰富的原料为底物制备多种产物，反应条件温和易控，反应效率高，无有害物质产生，反应成本低，且能与多种底物反应，获得多种羟基化脂肪酸。有望使普通鱼油等原料有升值几百倍的潜力。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表8页附图2页10申请公布号CN104099381ACN104099381A1/1页21一种生产羟基脂肪酸的方法，其特征在于，所述的方法是用脂氧化酶催。
3、化具有顺,顺1,4戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，所述的脂氧化酶包含有1氨基酸序列为SEQIDNO2的酶2在1中酶的氨基酸上经过取代、缺失、添加一个或氨基酸，由1所衍生的，且具有1中酶功能的脂氧化酶。2如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的脂氧化酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO1。3如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括如下的步骤1在脂氧化酶溶液中加入游离的多不饱和脂肪酸原料，混匀形成反应液，将反应液在1520反应15MIN2H；2在步骤1的反应液中加入还原剂或还原体系；3在步骤2的反应液中加入乙酸乙酯，4避光震摇萃取，收集上层乙酸乙酯相，然后在下层相中。
4、再加入乙酸乙酯重复抽提一次或以上后收集上层有机相，合并收集液；4在上述收集液中加入预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴后获得的有机溶剂相，氮气吹干或在旋转蒸发浓缩后,甲醇重溶获得制备的羟基脂肪酸。4如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的脂氧化酶溶液中酶的浓度为1030MG/L；原料加入的浓度为100M400MM。5如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的原料为亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸中的任一种或几种。6如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的原料为C20脂肪酸或包含有C20脂肪酸的油脂。7如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的包含有C20脂肪酸的油脂为鱼油。8。
5、如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的还原剂为硼氢化钠。9如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的还原体系为谷胱甘肽氧化酶和还原型谷胱甘肽。权利要求书CN104099381A1/5页3一种生产羟基脂肪酸的方法技术领域0001本发明属于长链羟基脂肪酸的生产方法技术领域，尤其涉及一种利用单酶生产羟基脂肪酸的方法。背景技术0002羟基脂肪酸是指脂肪酸分子长链中的碳位具有羟基团的脂肪酸，羟基脂肪酸分子中的羟基给予脂肪酸特别的性质，它具有更高的反应活性，可应用于表面活性剂、化妆品中的成分；用于机械工业金属润滑、防锈剂；化学工业中的塑化剂、乳化剂、稳定剂；食品工业中的抗菌剂；医药工业的抗菌、抗炎、抗肿瘤。
6、产品等。更重要的是作为单体在合成高分子聚合物时提供最长的单体分子碳链，使合成材料性能更优越，是当今绿色聚合物材料研究开发中最理想的单体成分之一，可作为生物可降解聚合物材料的理想原料。因此，羟基脂肪酸在化学工业、医药、食品及绿色聚合物材料工业具有十分重要的应用前景。0003羟基脂肪酸主要是通过饱和或不饱和脂肪酸的羟基化即分子修饰而得到。目前常用的技术是化学合成法。但化学合成反应路线复杂及给分离带来更大的困难，是一种不经济的方法。国内外研究学者也尝试通过筛选各种微生物生产羟基脂肪酸，比如以芽孢菌属生产羟基脂肪酸。近年来，也有研究采用基因工程的技术制备羟基脂肪酸。到目前为止，羟基脂肪酸的微生物转化研。
7、究开发还很有限。0004可作为底物进行生物转化的长链脂肪酸种类很多，但迄今为止，绝大部分以工业化生产为目的底物都是C1218脂肪酸，且以植物脂肪酸为主，而且形成的位点以1，2，3羟基化脂肪酸为主。例如有研究采用植物油料作物中的油酸、亚油酸及部分酯作为反应底物。但是以长链C20以上的报道很少，国外有研究发现，14,21双羟基DHA能够用于处理糖尿病人的伤口；来源于花生四烯酸和EPA的羟基脂肪酸可作为抗炎症和前消散脂类介质的作用，可以减少抗生素的用量。可见，C20以上的脂肪酸在医药领域有其特殊的应用。由于生产羟基化脂肪酸的酶是一类细胞色素P450酶系统，目前所发现的微生物酶系对底物作用专一性要求有。
8、局限性，产物单一，生产不同的羟基脂肪酸需要利用不同的酶，对工业化生产造成不便。发明内容0005本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种通过一步酶反应结合还原反应获得多种羟基脂肪酸的方法。0006本发明的方法，是用脂氧化酶PHLOX2催化具有顺,顺1,4戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，该脂氧化酶包含有00071氨基酸序列为SEQIDNO2的酶00082在1中酶的氨基酸上经过取代、缺失、添加一个或氨基酸，由1所衍生的，且具有1中酶功能的脂氧化酶。0009用于编码上述脂氧化酶的基因，其一种优选核苷酸序列为SEQIDNO1；说明书CN104099381A2/5页40010本发。
9、明的方法，其一种优选的步骤如下00111在脂氧化酶溶液中加入游离的多不饱和脂肪酸原料，混匀形成反应液，将反应液在1520反应15MIN2H；00122在步骤1的反应液中加入还原剂，或还原体系；硼氢化钠。00133在步骤2的反应液中加入乙酸乙酯，4避光震摇萃取，收集上层乙酸乙酯相，然后在下层相中再加入乙酸乙酯重复抽提一次或以上后收集上层有机相，合并收集液；00144在上述收集液中加入预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴后获得的有机溶剂相，氮气吹干或在旋转蒸发浓缩后,甲醇重溶获得制备的羟基脂肪酸。0015作为实施例的优选，脂氧化酶溶液中酶的浓度为1030MG/L；原料加入的浓度为100M400MM。。
10、0016进一步，所述原料包括亚麻酸GLA、花生四烯酸ARA、二十碳五烯酸EPA、二十二碳四烯酸DHA中的任一种或几种。0017上述的原料，其一种优选为C20脂肪酸或包含有C20脂肪酸的油脂；0018其中包含有C20脂肪酸的油脂，优选为鱼油。0019作为实施例的优选，还原剂为硼氢化钠；或谷胱甘肽氧化酶和还原型谷胱甘肽。0020本发明中使用的克隆酶PHLOX2具有多种功能，能通过一步反应结合还原反应催化长链多不饱和脂肪酸，特别是C20脂肪酸产生单位点和双位点羟基化脂肪酸，适用于以鱼油等含C20脂肪酸丰富的原料为底物制备多种产物，反应条件温和易控，反应效率高，无有害物质产生，反应成本低，且能与多种底。
11、物反应，获得多种羟基化脂肪酸。有望使普通鱼油等原料有升值几百倍的潜力。附图说明0021图1为实施例2中PHLOX2催化亚麻酸的LC示意图，产物、分别为6HOTE、9HOTE、13HOTE；0022图2为实施例3中PHLOX2催化花生四烯酸的LC示意图，产物、分别为8HETE、9,13DIHETE；0023图3为实施例4中PHLOX2催化二十碳五烯酸的LC示意图，产物、分别为8HEPE、9,13DIHEPE。0024图4为实施例5中PHLOX2催化二十二碳四烯酸的LC示意图，产物、分别为7DHE、10DHE、7,14DIDHE、4,20DIDHE；具体实施方式0025申请人在研究中发现，脂氧化酶。
12、PHLOX2能催化多种不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，从而促成了本发明。0026以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。0027实施例1脂氧化酶PHLOX2的筛选0028本发明所使用的脂氧化酶PHLOX2基因来自坛紫菜，克隆过程中首先从坛紫菜中提取总RNA，根据坛紫菜转录组相关脂氧合酶基因序列设计特异性引物，通过3RACE和5RACE技术扩增出包含完整开放阅读框的CDNA序列，重组到表达载体PET28A，转化至大说明书CN104099381A3/5页5肠杆菌ECOLIBL21，筛选出阳性克隆，通过诱导表达产生表达量为2MG/L菌液的多功能克隆酶PHLOX2，具体步骤如下00291、采用。
13、TAKARARNAISOPLUSKITTAKARA，日本，以TRIZOL法提取坛紫菜叶状体的总RNA。采用TAKARAPRIMESCRIPTRTREAGENTKITTAKARA，日本，对提取的坛紫菜叶状体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总CDNA。0030对坛紫菜叶状体转录组进行分析，提取坛紫菜脂氧合酶基因相关序列，采用PRIMERPRIMER5软件设计特异性引物对，进行坛紫菜脂氧合酶PHLOX2核心片段的克隆，其中特异性引物序列信息如下0031LOX2F5GCTGACGATGCCCAAGTACTG30032LOX2R5GCTGCTGTTGTTGGGTTCCT3，扩增1879BP片段。以坛紫。
14、菜叶状体CDNA为模板进行PCR扩增，PCR体系为DDH2O172L，10PCRBUFFERMG2PLUS25L，DNTP各25MM20L，PHLOX2F/PHLOX2R10/10L，CDNA10L，RTAQ5U/L03L。PCR程序为955MIN，951MIN，5535S，722MIN，35循环，7210MIN。0033以PHLOX2核心片段为模板，分别设计用于3端和5端延伸的特异性引物，进行RACERAPIDAMPLICATIONOFCDNAENDS，CDNA末端快速扩增技术扩增。00343RACE特异性引物0035LOX23F15GCGGTCGTCTCCATCATCTTCC30036LO。
15、X23F25TCTTCCAGACGCTCTTTGCGCAC3；00375RACE特异性引物0038LOX25R15TGATGCCAATCGTGTCCTGGAAGTG30039LOX25R25AGGGACTTGCCCAGCGAAAAGAGGAGC3。0040克隆5和3端的未知序列，PCR扩增体系为5CDNA/3CDNA25L，UPM10X50L，GSP1/GSP210M10L，10XBUFFER50L，DDH2O345L，DNTPMIX10MM10L，50XADVANTAGE2POLYMERASEMIX10L。PCR扩增程序为955MIN，951MIN，6535S，721MIN，35循环，721。
16、0MIN。0041得到RACE产物序列后，采用MEGA5软件进行比对拼接，总长为3284BPSEQIDNO1，包含一个完整的编码框ORF，编码899AA的氨基酸序列SEQIDNO2。00422、PHLOX2原核表达的重组体系构建0043在PHLOX2的ORF两端设计一对带NDE/HIND酶切位点的特异性引物0044PHLOX2CDSF5GGAATTCCATATGATGGCGCACACCG30045PHLOX2CDSR5CCCAAGCTTCTAAATGTCAATCGACAGGG3。0046以叶状体CDNA为模板，扩增PHLOX2完整ORF。克隆的目的片段首先连接到PMD18T上形成LOX18T的。
17、重组克隆载体，通过转化ECOLIDH5进行测序，以检测目的片段的编码正确性。以PET28A为表达载体，通过NDE/HIND分别对PHLOX218T和PET28A进行双酶切，双酶切体系为10NEBUFFER25L，质粒DNA2G，NDE/HIND2000U/ML10/10L，DDH2O至50L。酶切反应条件为37，4H。切胶回收目的条带，构建重组载体，体系如下10T4DNALIGASEBUFFER25L，PET28AVECTOR50NG，PHLOX218TVECTOR135NG，T4LIGASE25000U/ML1U，DDH2O至25L。16条件下连接过夜。重组质粒于大肠杆菌BL21中转化，挑选。
18、单克隆检测阳性克隆。并送测说明书CN104099381A4/5页6序以确定重组载体的编码正确性。得到的真阳性克隆PHLOX228ABL21于含15甘油的LBKANA50G/ML液体培养基中，70下储存保菌。00473、PHLOX2蛋白的诱导和纯化0048将实施例2中获得的克隆菌株活化、扩培，以01MMIPTG诱导表达。诱导条件为20，100RPM，1420H。诱导完成后，以5000RPM，4，15MIN离心收集菌体。去上清培养液，再用10ML细胞裂解液BUFFERA50MMTRISHCL，PH80，200MMNACL，10V/VGLYCEROL，01TWEEN20充分重悬菌体。以6500RPM。
19、，20S破碎/2MIN冰浴的程序进行菌体破碎匀浆BERTINTECHNOLOGIESPRECELLYS24DUAL，法国，循环4次。12000RPM，4，10MIN离心匀浆液，并收集上清。0049采用6HISTAGGEDPROTEINPURICATIONKITCWBIO，中国对上清液进行目的蛋白的纯化，并以含10MM、50MM、150MM、500MM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱和收集目的蛋白。0050实施例20051在05ML25MG/L浓度的由实施例1所得的脂氧化酶PHLOX2蛋白纯化溶液中加入100M的亚麻酸，混匀后在20下孵育15MIN，获得酶反应液。加入4U谷胱甘肽氧化酶和3MM还原型谷胱。
20、甘肽作为还原剂，20下继续孵育15MIN。0052产物提取和检测方法为在反应液中加1ML乙酸乙酯色谱纯，4避光振摇1H。12000RPM，4，离心10MIN，收集上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入05ML乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入1ML预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5MIN，以洗去水溶性杂质。12000RPM，4，离心10MIN，取上层乙酸乙酯相。氮气吹干后加入05ML色谱甲醇重溶。利用LCMS分析羟基脂肪酸的产生种类，LC检测条件采用HYPERSILGOLDC18色谱柱21MM100MM，3M，柱温30；流动相乙腈A02乙酸水溶液B；洗脱梯度040MI。
21、N，30100A；流速02MLMIN1；进样量10L。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气N2压力25LMIN1；辅助气N2流量5ARBS，离子传输毛细管温度320，采用选择反应监测SRM扫描模式，采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，压力15MTORR。通过底物积分面积的减少来评价转化率，转化率为7921。从LC图图1中可以看出所得的的羟基脂肪酸包括6HOTE,9HOTE,13HOTE；0053实施例30054在5ML25MG/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PHLOX2蛋白纯化溶液中加入100MM的花生四烯酸，混匀后在20孵育1H，。
22、获得酶解反应液。加入1G/ML硼氢化钠作为还原剂，20下继续孵育20MIN。0055产物提取和检测方法为在反应液中加10ML乙酸乙酯色谱纯，4避光振摇1H，分离上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入5ML乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入10ML预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5MIN，以洗去水溶性杂质。分离上层乙酸乙酯相，25下旋转蒸发至恒重，加入5ML色谱甲醇重容。利用LCMS分析底物转化率，LC检测条件采用HYPERSILGOLDC18色谱柱21MM100MM，3M，柱温30；流动相乙腈A02乙酸水溶液B；洗脱梯度040MIN，30100A；流速02MLMIN1。
23、；进样量10L。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件说明书CN104099381A5/5页7采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气N2压力25LMIN1；辅助气N2流量5ARBS，离子传输毛细管温度320，采用选择反应监测SRM扫描模式，采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，压力15MTORR。如图2所示，发现底物转化率达到100，其中图2中上面的图谱线表示反应后，下面的图谱线表示反应前，图中的数字表示经过PHLOX2催化并经还原剂还原后的产物，包括为8HETE和9,12DIHETE。0056实施例40057在5ML30MG/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PHLOX2蛋白。
24、纯化溶液中加入200MM的二十二碳六烯酸DHA，混匀后在20下孵育15H，获得酶解反应液。加入50U谷胱甘肽氧化酶和50MM还原型谷胱甘肽作为还原剂，20下继续孵育30MIN。0058产物提取和检测方法为在反应液中加10ML乙酸乙酯色谱纯，4避光振摇1H，分离上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入8ML乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入15ML预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5MIN，以洗去水溶性杂质。分离上层乙酸乙酯相，25下旋转蒸发至恒重，加入5ML色谱甲醇重容。利用LCMS分析底物转化率，LC检测条件采用HYPERSILGOLDC18色谱柱21MM100MM，3。
25、M，柱温30；流动相乙腈A02乙酸水溶液B；洗脱梯度040MIN，30100A；流速02MLMIN1；进样量10L。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气N2压力25LMIN1；辅助气N2流量5ARBS，离子传输毛细管温度320，采用选择反应监测SRM扫描模式，采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，压力15MTORR。如图3所示，发现底物转化率达到95，其中图3中上面的图谱线表示反应后，下面的图谱线表示反应前，图中的数字表示经过PHLOX2催化并经还原剂还原后的产物，包括为7HDHE、10HDHE、7,14DIDHE和4,20DIHDH。
26、E。0059实施例50060在05ML10MG/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PHLOX2蛋白纯化溶液中加入400M的EPA，混匀后在20下孵育15MIN，获得酶解反应液。后加入08G/ML硼氢化钠作为还原剂，20下继续孵育15MIN。0061产物提取和检测方法为在反应液中加1ML乙酸乙酯色谱纯，4避光振摇1H。12000RPM，4，离心10MIN，收集上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入05ML乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入1ML预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5MIN，以洗去水溶性杂质。12000RPM，4，离心10MIN，取上层乙酸乙酯相，氮气吹干后加入0。
27、5ML色谱甲醇重容。利用LCMS分析底物转化率，LC检测条件采用HYPERSILGOLDC18色谱柱21MM100MM，3M，柱温30；流动相乙腈A02乙酸水溶液B；洗脱梯度040MIN，30100A；流速02MLMIN1；进样量10L。目的产物，进行二级LC/MS分析。质谱条件采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2500V，鞘气N2压力25LMIN1；辅助气N2流量5ARBS，离子传输毛细管温度320，采用选择反应监测SRM扫描模式，采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，压力15MTORR。如图4所示，发现底物转化率达到490，其中图4中上面的图谱线表示反应后，下面的图谱线表示反应前，图中。
28、的数字表示经过PHLOX2催化并经还原剂还原后的产物，包括8HEPE和9,12DIHEPE。0062上述的结果表明，本发明所筛选的脂氧化酶PHLOX2能催化具有顺,顺1,4戊二烯结构的多不饱和脂肪酸原料来生产羟基化脂肪酸，具有应用的前景。说明书CN104099381A1/8页800010002序列表CN104099381A2/8页90003序列表CN104099381A3/8页100004序列表CN104099381A104/8页110005序列表CN104099381A115/8页120006序列表CN104099381A126/8页130007序列表CN104099381A137/8页140008序列表CN104099381A148/8页15序列表CN104099381A151/2页16图1图2图3说明书附图CN104099381A162/2页17图4说明书附图CN104099381A17。