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1、10申请公布号CN104204202A43申请公布日20141210CN104204202A21申请号201380018485022申请日2013020712000783620120207EPC12N9/90200601C12P7/06200601C12P19/2420060171申请人科莱恩产品（德国）有限公司地址德国美因河畔法兰克福72发明人Z德拉戈维奇C加默夫C赖辛格U克特林74专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限公司11322代理人龙淳54发明名称戊糖发酵微生物57摘要本发明提供能够利用C5糖特别是木糖的微生物真核细胞。本发明的另一目的是提供使得真核细胞能够降解C5糖的改进的蛋白序列。。
2、因此，本发明提供包含与SEQIDNO2或SEQIDNO8具有至少75同一性、优选80同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨基酸序列且在真核细胞中具有木糖异构酶活性的蛋白。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014093086PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0524072013020787PCT国际申请的公布数据WO2013/117631EN2013081551INTCL权利要求书2页说明书13页序列表19页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书13页序列表19页附图5页10申请公布号CN104204202ACN1042。
3、04202A1/2页21一种蛋白，其包括与SEQIDNO2具有至少75同一性、优选80同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨基酸序列且在真核细胞中具有木糖异构酶活性。2根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白由SEQIDNO2的序列组成，或由与SEQIDNO2具有至少75同一性、优选80同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨基酸序列组成并且在真核细胞中具有木糖异构酶活性。3根据权利要求1或2所述的蛋白，其中所述蛋白由SEQIDNO8的序列组成，或由与SEQIDNO8具有至少75同一性、优选80同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨基酸序列组成并且在真核细胞中具。
4、有木糖异构酶活性。4根据权利要求13中的一项或多项所述的蛋白，其在7585的PH范围内显示出最佳的木糖异构酶活性。5根据权利要求14中的一项或多项所述的蛋白，其能通过从真核细胞表达而获得。6一种DNA分子，其包括编码根据权利要求15中的一项或多项所限定的蛋白的DNA序列，其中所述DNA序列可操作地连接至真核调节序列。7根据权利要求6所述的DNA分子，其中所述DNA分子由SEQIDNO1或SEQIDNO7的序列组成。8一种真核细胞，其表达根据权利要求15中的一项或多项所述的蛋白，和/或包含根据权利要求6或7所述的DNA分子。9根据权利要求8所述的真核细胞，其中所述真核细胞为酵母细胞，优选选自毕赤。
5、酵母属PICHIA、管囊酵母属PACHYSOLEN、耶氏酵母属YARROWIA、酵母属SACCHAROMYCES、念珠菌属CANDIDA、ARXULA属、ASHBYA属、德巴利酵母属DEBARYOMYCES、汉逊酵母属HANSENULA、HARTAEA属、克鲁维酵母属KLUYVEROMYCES、许旺酵母属SCHWANNIOMYCES、丝孢酵母属TRICHOSPORON、XANTHOPHYLOMYCES属、裂殖酵母属SCHIZOSACCHAROMYCES、接合酵母属ZYGOSACCHAROMYCES，最优选为酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE。10一种基因改造的酵母细胞，其包。
6、括在所述酵母细胞中有功能的外源木糖异构酶基因，其中所述外源木糖异构酶基因可操作地连接至在所述酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列，引起根据权利要求15所述的蛋白的表达。11根据权利要求10所述的基因改造的酵母细胞，其中所述外源木糖异构酶基因为根据权利要求6或7所述的DNA分子。12根据权利要求10或11所述的基因改造的酵母细胞，其中所述基因改造的酵母细胞选自毕赤酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属、酵母属、念珠菌属、ARXULA属、ASHBYA属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、HARTAEA属、克鲁维酵母属、许旺酵母属、丝孢酵母属、XANTHOPHYLOMYCES属、裂殖酵母属、接合酵母属，优选为酿酒酵。
7、母。13一种真核细胞，其具有通过用根据权利要求6或7所述的DNA序列转化野生型酵母菌株而得到的增加水平的木糖异构酶活性。14根据权利要求813中的一项或多项所述的真核细胞，其中所表达的蛋白由SEQIDNO2或SEQIDNO8的序列组成。15根据权利要求13或14所述的真核细胞，其中所述酵母菌株选自毕赤酵母属、管囊权利要求书CN104204202A2/2页3酵母属、耶氏酵母属、酵母属、念珠菌属、ARXULA属、ASHBYA属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、HARTAEA属、克鲁维酵母属、许旺酵母属、丝孢酵母属、XANTHOPHYLOMYCES属、裂殖酵母属、接合酵母属，优选为酿酒酵母。16根据权利要。
8、求15中的一项或多项所述的蛋白或根据权利要求815中的一项或多项所述的细胞用于从含木糖碳源的培养基发酵生物质的用途。17根据权利要求15中的一项或多项所述的蛋白或根据权利要求815中的一项或多项所述的细胞作为生物催化剂原位用于或以纯化的形式用于生产异构化的糖产物或中间体的用途，优选生产异构化的糖产物的用途。18根据权利要求6或7所述的DNA分子用于真核细胞转化的用途。19根据权利要求18所述的用途，其中所述转化产生根据权利要求815中任一项所述的真核细胞。20根据权利要求815中的一项或多项所述的真核细胞用于实现增加的木糖消耗率的用途。21使用酵母从木糖或葡萄糖木糖混合物生产乙醇的方法，其中酵。
9、母表达根据权利要求15中的一项或多项所述的蛋白，优选为酿酒酵母。22生产选自乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1,3丙二醇、乙烯、甘油、内酰胺抗生素、头孢菌素、生物燃料、丁醇、乙醇、乳酸、衣康酸的发酵产物的方法，所述发酵产物优选为丁醇，最优选为乙醇，其中所述方法包括以下步骤A以权利要求815中的任一项所限定的细胞发酵含有木糖来源的培养基，和任选地，B回收所述发酵产物。权利要求书CN104204202A1/13页4戊糖发酵微生物技术领域0001木糖是植物生物质的主要基础材料，并与现今生物精炼观点聚焦的大量主要原料紧密相关。这类富含木糖的材料的实例包括麦秸、玉米秸秆或木片或其它木材副产品BLAKEASI。
10、MMONS等人GENOMEBIOL2008；912242。0002因此，通过酶促、化学或化学/酶促方法进行的起始材料的水解产生了其他有价值的糖之外的富含木糖的中间产物DEEPAKKUMAR等人BIOTECHNOLBIOFUELS2011；427。在耦合发酵路线中对富含C5的糖溶液的高效利用对于应用的发酵菌株既是至关重要的，也是必需的SARAFERNANDESANDPATRICKMURRAY,BIOENGBUGS2010；16424。特别地，C6酵母如酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE由于较长历史的培育最终以极端耐乙醇和葡萄糖转化高产量为特点而成为理想的工作平台，使得木糖完全。
11、不受影响，从而降低了潜在产量。已知的几种策略可以避免这种缺陷。此处的关键步骤似乎为通过将木糖异构化为木酮糖以及随后的C5非还原部分分流到酿酒酵母的常规糖酵解途径的修饰级联而成功地供料木糖。虽然对通过特定转运蛋白的跨膜摄取木糖的强度和通过C5旁路可达到的通量密度进行了可能的改进DAVIDRUNQUIST等人MICROBCELLFACT2009；849，但是木糖到木酮糖的关键异构化步骤在整个过程中成为主要问题。为进行该步骤已知有两种主要途径。第一，采用还原成木糖醇通过木糖还原酶和氧化通过木糖醇脱氢酶成木酮糖的后续步骤，导致NADH和NADPH辅因子之间的极大不平衡，并导致木糖醇在发酵条件下的形成增。
12、加MAURIZIOBETTIGA等人BIOTECHNOLBIOFUELS2008；116。应用木糖异构酶的备选的直接异构化途径问题在于如下的木糖异构酶基因的可得性不足，其兼具有在真核微生物特别是酵母，例如酿酒酵母中的活性表达、高催化效率、与发酵温度相适的温度和最适PH以及副产物尤其是木糖醇的低抑制。本发明的一个方面是满足此需求的蛋白质序列及编码其的核酸的公开内容。0003木糖异构酶途径对于细菌物种和极少的酵母是原生的。相较于氧化还原酶途径，异构酶途径不需要辅因子。异构酶途径最少由单一的酶异源木糖异构酶XI组成，其直接将木糖转化为木酮糖。就氧化还原酶途径而言，通过共表达异源木酮糖激酶XK可以获得。
13、产率的进一步提高。0004首次功能性表达的XI是来源于厌氧真菌PIROMYCES物种E2KUYPERM等人FEMSYEASTRES2003；4169的XYLA基因。构建了在厌氧条件下能发酵作为唯一碳源的木糖的单倍体酵母菌株。大部分木糖异构酶是细菌蛋白并且主要障碍是其在酵母中的表达。然而近期的研究已经证实酵母中的功能性表达表1。由于木糖异构酶活性在C5发酵生物体理念中的关键重要性，希望使用最佳的木糖异构酶。就这方面而言，从先前的报道我们得知CLOSTRIDIUMPHYTOFERMENTANS木糖异构酶提供了较低但却是可得的最高的技术标准。因此非常期待在本发明范围内改进木糖异构酶的有益特性。000。
14、5表1所主张的应用于酵母中的木糖异构酶实例0006说明书CN104204202A2/13页5来源生物体引用CLOSTRIDIUMPHYTOFERMENTASWO2010/000464PIROMYCES物种E2EP1468093B1多形拟杆菌BACTEROIDESTHETAIOTAOMICRONUS2012/0225451A1未知WO2011078262ABIOTROPHIADEFECTIVAWO/2012/0092720007跨膜的糖运输不限制己糖的发酵，尽管其可能限制戊糖代谢，尤其在己糖和戊糖共发酵的情况下更是如此。已对几种戊糖转运蛋白表达进行了研究。发明内容0008本发明的一个目的是提供一。
15、种能够利用C5糖特别是木糖的微生物真核细胞。本发明的另一个目的是提供一种使得真核细胞能够降解C5糖的改进的蛋白质序列。0009令人惊讶地发现，当用携带含有SEQIDNO2蛋白的DNA编码序列的表达盒的载体转化真核微生物细胞特别是酵母例如酿酒酵母时，由所述SEQIDNO2序列此前公开于NCBIGENEBANK检索号ZP_079046961描述的蛋白或缺乏最初18个氨基酸MKTKNNIICTIALKGDIF的N端截短型形式SEQIDNO8在这些微生物细胞中功能性地表达，其中所述的DNA序列例如SEQIDNO1下所描述的DNA分子此前作为检索号NZ_AEPW010000731GI315651683的。
16、部分公开于GENEBANK。0010因此，本发明提供了含有与SEQIDNO2或SEQIDNO8具有至少75同一性、优选80同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨基酸序列且在真核细胞中具有木糖异构酶活性的蛋白质。0011本发明还提供了一种DNA分子，其含有编码本发明蛋白的DNA序列，其中该DNA序列可操作地连接到真核调节序列。0012还发现，当与非转化的细胞相比时，转化细胞显示出增加的木糖消耗速率。因此，本发明还提供表达本发明蛋白和/或含有本发明DNA分子的真核细胞。0013作为又一方面，与转化对照相比，从含木糖碳源的培养基进行的生物质发酵得到改进，并且由这些转化菌株在这些条件下形成。
17、的代谢物的量增加。0014本发明的另一方面涉及所表达蛋白的生物催化特性以及其作为生物催化剂原位用于或以纯化形式用于生产异构化的糖产物或中间体的应用。附图说明0015图1木糖利用途径。0016图2用砂真杆菌EUBACTERIUMSABURREUMESXI、PIROMYCES物种PIXI和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI转化的酿酒酵母之间的菌落生长的比较结果。使用简单表达载体PSCMB454载体转化的菌种作为阴性对照。标尺上的“1”对应于6天后的弱说明书CN104204202A3/13页6生长，而“4”对应于6天后非常强的生长。0017图3酵母表达质粒图谱。0018图4ES。
18、XI的表达质粒。0019图5用砂真杆菌ESSHXI和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI转化的酿酒酵母之间的培养物生长的比较结果。使用简单表达载体PSCMB454载体转化的菌种作为阴性对照。0020图6表达砂真杆菌ESSHXI，菱形和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI，圆形的酿酒酵母的细胞提取物中的木糖异构酶的活性。使用简单表达载体PSCMB454载体转化的菌种作为阴性对照。用于线性曲线拟合的公式ABS340NMV时间ABS3MIN在图的下部示出。为了清楚起见，仅仅对阴性载体对照的曲线拟合制图。0021图7纯化的木糖异构酶砂真杆菌ESSHXI和CLOS。
19、TRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI的比活性SPECICACTIVITY。使用无酶的反应混合物仅缓冲液作为阴性对照。比活性表示为酶与底物之比E/S为005W/W时转化的木糖的百分比。0022图8测定纯化的木糖异构酶砂真杆菌ESSHXI，菱形和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI，圆形的最适PH。使用无酶的反应混合物作为阴性对照缓冲液，三角形。活性表示为最大活性的百分比。0023图9测定纯化的木糖异构酶砂真杆菌ESSHXI，菱形和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI，圆形的最适温度。使用无酶的反应混合物作为阴性对照缓冲液，三角形。活性表示为最大。
20、活性的百分比。0024图10测定纯化的木糖异构酶砂真杆菌ESSHXI和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASCPXI的KM。具体实施方式0025定义0026木糖异构酶活性在文中被定义为属于木糖异构酶类EC5315的酶的酶促活性，这类酶由此催化各种醛糖和酮糖糖类的异构化以及这类酶所固有的其他酶促副反应，将酶分配到木糖异构酶是基于活性谱或同源性考虑在各种情况下更相关的一种而进行的。通过利用采用山梨醇脱氢酶的酶联分光光度测定法可以确定木糖异构酶活性。0027表达构建体在文中被定义为如下的DNA序列，该序列包括用于在宿主细胞中建立所包含的开放阅读框ORF的表达而所需的所有序列元件，包括转录起。
21、始序列启动子、终止序列和调节序列、转录起始位点、用于稳定地复制或整合到宿主基因组的区域以及选择性遗传标记物。由此，功能性配置SETUP可能已经通过宿主细胞中的排列整合等事件而建立或实现。在优选的实施方式中，表达构建体含有与其后是任选的终止序列的开放阅读框可操作地连接的启动子。用于在真核细胞中表达的调节序列包括启动子序列、转录调控因子结合位点、翻译起始序列和终止子序列。当发现用于在真核细胞中表达的调节序列仅与编码DNA链连接或与其它调节序列结合时，将其理解为与真核细胞中的编码DNA链的转录和/或翻译过程处于功能性连接。本发明所关注的是与发明的木糖异构酶基因连接从而促使能在所选的真核酵母或真菌细胞。
22、中表达的启动子序列。真核启动子与编码发明的木糖异构酶的DNA序列的结合引起木糖异构酶在转化的真核细胞中的表达。优选的启动子说明书CN104204202A4/13页7是在发酵条件下有活性的酿酒酵母的中强度至高强度的启动子。这类优选启动子的实例是糖酵解途径或糖转运的启动子，特别是已知为PFK1、FBA1、PGK1、ADH1、ADH2、TDH3的基因的启动子以及其截短的或突变的突变体。用于建立有丝分裂稳定性的元件是领域内已知的，包括酿酒酵母2质粒复制起点、着丝粒序列CEN、自主复制序列ARS或者用于通过同源末端连接途径促进染色体整合的任意长度的同源序列。选择性标记物包括将抗生素抗性归于宿主细胞的遗传。
23、元件。实例是KAN和BLE标记物基因。可以使用补充宿主菌株的限定的营养缺陷型的营养缺陷型标记物。要提及的这些标记物的实例是体现亮氨酸LEU2或尿嘧啶URA3途径的基因和突变，但也包括木糖异构酶。0028增强的木糖消耗在文中被定义为，相较于针对所考虑的性状未改造的细胞培养物的木糖消耗率而言任何引起细胞生长和增殖、代谢物形成和/或热能产生的增加的木糖消耗率。可以例如在现象上考虑所形成的细胞密度或集落大小、通过确定氧气消耗率、乙醇形成速率或者通过直接测量生长培养基中一段时间内的木糖浓度来确定消耗率。此上下文中的消耗等同于术语利用、发酵或降解。0029木糖代谢中涉及的基因由不同的作者描述过，这些基因编。
24、码己糖和戊糖转运蛋白、木酮糖激酶、核酮糖5磷酸3差向异构酶、核酮糖5磷酸异构酶、转酮醇酶、转醛醇酶以及同源基因。0030木糖异构酶表达细胞在文中是指经基因改造而携带用于表达所公开的木糖异构酶的表达构建体的微生物真核细胞。在优选的实施方式中，木糖异构酶表达细胞是选自毕赤酵母属PICHIA、管囊酵母属PACHYSOLEN、耶氏酵母属YARROWIA、酵母属SACCHAROMYCES、念珠菌属CANDIDA、ARXULA属、ASHBYA属、德巴利酵母属DEBARYOMYCES、汉逊酵母属HANSENULA、HARTAEA属、克鲁维酵母属KLUYVEROMYCES、许旺酵母属SCHWANNIOMYCE。
25、S、丝孢酵母属TRICHOSPORON、XANTHOPHYLOMYCES属、裂殖酵母属SCHIZOSACCHAROMYCES、接合酵母属ZYGOSACCHAROMYCES的酵母，最优选为酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE。0031本发明提供了具有增强的木糖代谢、木糖存在下改善的生物质形成和/或改善的代谢物形成的真核细胞的基因构建方案。这些是期望的特性和当前许多工业生产菌株特别是酵母属SACCHAROMYCES生产菌株的瓶颈，提及酿酒酵母作为非限制性的实例。本发明通过提供在低等真核细胞特别是酵母概述的实例为酵母属的酵母菌，同样提及酿酒酵母作为非限制性的实例中功能性表达的木糖异。
26、构酶基因的蛋白和DNA序列而解决该问题。产生的菌株是显示出潜在地增强的木糖消耗的木糖异构酶表达细胞。通过领域内已知的途径难以以令人满意的方式实现由木糖异构酶表达细胞产生的木糖异构酶活性的期望特性。0032因此，本发明提供包含与SEQIDNO2或SEQIDNO8具有至少75同一性，例如至少80同一性、优选85同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨基酸序列且在真核细胞中具有木糖异构酶活性的蛋白。在优选实施方式中，蛋白由这样的氨基酸序列构成。在另一优选实施方式中，蛋白由这样的氨基酸序列融合到其它蛋白的另一部分而构成，优选融合到显示出对于已知木糖异构酶的高度同一性水平或自身表现出木糖异构酶。
27、活性的此种蛋白的部分。0033在优选的实施方式中，蛋白由SEQIDNO2的序列组成，或者由与SEQIDNO2具有至少有75同一性、优选80同一性、最优选90同一性、最高度优选95同一性的氨说明书CN104204202A5/13页8基酸序列组成并且在真核细胞中具有木糖异构酶活性。0034同源蛋白应该还包括具有保留的木糖异构酶活性的截短的蛋白序列。这种截短蛋白序列的专用实例提供为SEQIDNO8或其显示出与SEQIDNO8具有至少75、80、85、90或95同一性的变体。0035本发明的蛋白或含有所述蛋白的组合物，优选不同于通过原核细胞表达得到的蛋白或组合物。因此，蛋白通常是能通过从真核细胞表达得。
28、到的蛋白。0036本发明的蛋白优选显示出由实施例中所描述的方法确定为在7585范围内的最佳木糖异构酶活性。0037同一性水平可以通过由LIFETMTECHNOLOGY以VECTORNTIPACKAGE出售的计算机程序ALIGNX来确定。应用版本1030的软件包组件的默认设置。0038对于本领域技术人员而言明显的是，许多不同的DNA分子翻译成相同的蛋白序列，且它们应该涵盖在本发明内。因此本发明还提供一种DNA分子，其包含优选由其组成编码本发明蛋白的DNA序列，该蛋白即为包含与SEQIDNO2具有至少75例如至少80同一性、优选85同一性、最优选90同一性、最高优选95同一性且在真核细胞中具有木糖。
29、异构酶活性的氨基酸序列的蛋白，或上文示出的优选实施方式，其中DNA序列可操作地连接到真核调节序列，即允许从真核细胞表达的调节序列。DNA序列的非限制性实例在SEQIDNO1或SEQIDNO7中给出。针对蛋白生产水平对DNA序列的计算上的改进的方法是已知的。它们非限定性地包括采用优选密码子的统计学评估密码子使用表、MRNA二级结构预测算法和基于HMM或NN的知识基础模型的方法。按这种方式，根据目标蛋白序列计算的经优化的DNA序列是优选的，并包含在本发明中。本发明也包含通过诱变和对改进变体的选择或筛选的重复或非重复步骤而得到的DNA序列。这是改进DNA和蛋白序列的常规技术，并且通过这些方法获得的序。
30、列不能被排除在本发明之外。考虑这一点应当独立于这样的实验所得到的DNA序列是否未影响所翻译的蛋白序列或在蛋白序列中翻译出突变，只要对于SEQIDNO2或SEQIDNO8的同一性水平不落入低于优选75、80、85、90或95的值即可。本发明的优选实施方式对于特定问题确实应用了这样的改进方法来调节已公开的核酸分子和蛋白序列。0039本发明的另一方面涉及本发明的木糖异构酶序列的部分与其他蛋白的部分优选显示出相对于已知木糖异构酶的高同一性水平或自身显示出木糖异构酶活性的部分融合而产生的嵌合序列，以及编码这样的嵌合蛋白的核酸分子。特别地，SEQIDNO2或SEQIDNO8蛋白的N端部分或SEQIDNO1。
31、或SEQIDNO7核酸分子的5部分应当突出作为本发明的优选实施方式。发明人注意到，本发明解决的木糖异构化的步骤是需要的一步中心变化，对于建立有效的以木糖为起始原料的碳流量，对木糖异构酶表达细胞的进一步改变可能是必需的。作者知晓的问题包括木糖跨膜转运蛋白、特别是自生长培养基的摄取、磷酸化以及C5旁路戊糖磷酸旁路的非氧化部分的代谢步骤。因此，向细胞中引入的额外改变，特别是体现已知问题的修正和改变参与木糖代谢的基因的表达水平的那些改变代表本发明的优选实施方式。这些改变引入细胞中的顺序可以以随机或有序的方式先后或并行地进行不必在这一点加以区分开，所有可行的策略都视为本发明的组成部分和具体实施方式。00。
32、40本发明由此还提供了表达本发明的蛋白和/或含有本发明的DNA分子的真核细说明书CN104204202A6/13页9胞。该蛋白优选由SEQIDNO2或SEQIDNO8的序列组成。真核细胞优选地为酵母细胞，更优选为选自毕赤酵母属PICHIA、管囊酵母属PACHYSOLEN、耶氏酵母属YARROWIA、酵母属SACCHAROMYCES、念珠菌属CANDIDA、ARXULA属、ASHBYA属、德巴利酵母属DEBARYOMYCES、汉逊酵母属HANSENULA、HARTAEA属、克鲁维酵母属KLUYVEROMYCES、许旺酵母属SCHWANNIOMYCES、丝孢酵母属TRICHOSPORON、XANT。
33、HOPHYLOMYCES属、裂殖酵母属SCHIZOSACCHAROMYCES、接合酵母属ZYGOSACCHAROMYCES的细胞，最优选为酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE。因此本发明还提供基因改造的酵母细胞，其包括在所述酵母细胞中有功能的外源木糖异构酶基因，优选地，其中外源木糖异构酶基因可操作地连接到在所述酵母细胞中有功能呢的启动子和终止子序列。在优选的实施方式中，外源木糖异构酶基因是根据本发明的DNA分子。外源木糖异构酶基因优选选自毕赤酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属、酵母属、念珠菌属、ARXULA属、ASHBYA属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、HARTAEA属、克鲁维酵母。
34、属、许旺酵母属、丝孢酵母属、XANTHOPHYLOMYCES属、裂殖酵母属、接合酵母属，优选为酿酒酵母。0041具有增加的木糖异构酶活性水平的真核细胞优选通过用本发明的DNA序列转化野生型酵母菌株而获得。本发明的另一方面涉及本发明的木糖异构酶或本发明的木糖异构酶表达细胞基于含木糖原料通过例如发酵生物质而生产生化制品的应用。生化制品包括生物燃料如乙醇或丁醇以及用于散装化学品如作为示例提及的乳酸和衣康酸的生物类原料。一系列可能的生化制品已由美国能源部公开。本发明的蛋白或本发明的细胞也可以作为生物催化剂原位用于或以纯化的形式用于生产异构化的糖产物或中间体，优选生产异构化的糖产物。0042本发明的又一。
35、方面涉及分离自真核宿主特别是酵母表达宿主的木糖异构酶的用途，其中所述的木糖异构酶不含细菌污染物或细菌物质的片段。这种木糖异构酶的可能应用包括食品和饲料应用，对这样的应用而言所提及的即使极低水平污染物的存在也意味着产品安全风险。在这点上对直接应用砂真杆菌作为生产宿主的担忧需要提升。在提议的真核宿主优选酵母中应用本发明的木糖异构酶明显是有优势的。0043实施例00441鉴定具有木糖异构酶功能的候选基因序列0045为在GENEBANK中找到木糖异构酶序列，选择NCBI基因组BLAST网址HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/SUTILS/GENOM_TABLECGI的程序BLASTPSTEPH。
36、ENFALTSCHUL,等人,NUCLEICACIDSRES1997；2533893402。作为测试序列，将大肠杆菌K12木糖异构酶基因的蛋白序列SEQIDNO3用作查询序列。程序的标准参数未做改变，将查询序列与基于生物体鸟枪序列结果检索号NZ_AEPW01000000建立的包括砂真杆菌DSM3986数据库的细菌蛋白数据库进行比对。将在整个序列长度上具有明显同源性水平的序列纳入考虑。搜索显示出许多潜在的候选基因，这些基因随后被克隆到酿酒酵母并测试功能表达。所有这样的候选基因同条目ZP_079046961SEQIDNO2那样处理，其是如在以下段落中描述的来自砂真杆菌DSM3986的木糖异构酶ES。
37、XI。关联的编码序列条目NZ_AEPW01000073REGION25833956SEQIDNO1被用作构建克隆引物的基础。00462扩增砂真杆菌DSM3986木糖异构酶基因ESXI0047操纵核酸分子的方法一般为本领域技术人员所知并在此引入以作参考说明书CN104204202A7/13页101MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,JOSEPHSAMBROOK,DAVIDWILLIAMRUSSELL；2CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYLASTUPDATEJANUARY11,2012PAGECOUNTAPPROX5300PRINT。
38、ISSN19343639；。砂真杆菌DSM3986的基因模板DNA购自DSMZDEUTSCHESTAMMSAMMLUNGFRMIKROORGANISMENUNDZELLKULTUREN。设计侧翼引物对以匹配SEQIDNO1的N末端和C末端。为扩增SEQIDNO1的N端截短形式，正义引物的结合区向下游移动54BP开始于A55。按照供应商对DNTP、引物和缓冲液浓度的推荐使用FINNZYMESPHUSIONTMHIGHFIDELITY聚合酶HF缓冲剂体系来进行PCR反应。在EPPENDORFTHERMOCYCLER中使用PHUSION聚合酶的标准程序98下30”预变性，接着是35个循环的9820”。
39、6020”72120”步骤，最终是在72下10分钟的延伸期进行PCR产物的扩增。将预期大小的PCR产物经过制备型溴化乙锭染色的TAE琼脂糖凝胶电泳纯化并使用PROMGAWIZARDSVPCR和凝胶纯化试剂盒从凝胶中回收。对于C端6XHISTAG的融合，在等同的条件下利用具有对应的5延伸区的延伸反义引物，使用初始PCR产物作为模板以进行全DNA片段的再扩增6XHISTAG融合PCR。得到的PCR产物再经过琼脂糖凝胶电泳纯化并使用PROMGAWIZARDSVPCR和凝胶纯化试剂盒回收。其分别含有ESXI基因的C端6XHISTAG形式或截短的ESXIESSHXI基因基因的C端6XHISTAG形式。0。
40、048从定购自德国GENEARTREGENSBURG的优化基因模板进行对经密码子优化的木糖异构酶基因的扩增。使用的序列优化的优化算法由该公司所提供。00493将ESXI和ESSHXIORF克隆到酿酒酵母表达质粒0050通过XMNI核酸内切酶的限制性酶切将从大肠杆菌培养物分离的PSCMB454质粒的质粒制备物线性化，并通过琼脂糖凝胶电泳从未处理的物种分离消化片段。按照PROMGAWIZARDSVPCR和凝胶纯化试剂盒的说明书从凝胶中回收线性化的载体骨架。使用标准的克隆方法将扩增的PCR产物克隆到XMNI消化的载体骨架中。根据供应商的方案转化到化学感受态大肠杆菌WMACH1细胞中。转化子在LB氨苄。
41、青霉素平板上过夜生长，并通过质粒MINIPREP试剂盒和对照消化以及DNA测序来测试正确性。使用PROMEGAPUREYIELDTMPLASMIDMIDIPREP体系从经验证的克隆制备大量的质粒DNA。所得的包含GPD启动子序列和CYC1终止子的表达盒的序列的实例在SEQIDNO6中给出。00514酿酒酵母中的转化0052将酿酒酵母菌种ATCC204667MATA，URA352，MALGAL，CUPR用作所有转化实验的宿主。0053使用本领域技术人员已知的标准方法进行转化例如，参见GIETZ,RDANDRAWOODS2002TRANSFORMATIONOFYEASTBYTHELIAC/SSCA。
42、RRIERDNA/PEGMETHODMETHODSINENZYMOLOGY3508796。使用表达载体中包含的酿酒酵母URA3基因的完整形式作为选择标记物，并选择在无尿嘧啶的最低限培养基上生长的转化子。最低限培养基由20GL1葡萄糖、67GL1无氨基酸的酵母氮源、40MGL1L酪氨酸、70MGL1L苯丙氨酸、70MGL1L色氨酸、200MGL1L缬氨酸和各50MGL1的腺嘌呤半硫酸盐、L精氨酸盐酸盐、L组氨酸盐酸盐一水合物、L异亮氨酸、L亮氨酸、L赖氨酸盐酸盐、L蛋氨酸、L丝氨酸和L苏氨酸。将PH调至56，加入15GL1琼脂用于固体培养基。00545表达木糖异构酶的酵母属菌株在木糖培养基上的生。
43、长说明书CN104204202A108/13页110055A将转化有砂真杆菌的木糖异构酶ESXI和CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTAS的木糖异构酶CPXI的表达载体以及简单表达载体PSCMB454的酵母属菌株的单克隆转移至具有葡萄糖作为单一碳源的最低限培养基平板上。然后将单个克隆转移至具有木糖作为单一碳源20GL1的最低限培养基平板上并在30培育。7天后，仅具有木糖异构酶表达载体的转化子有可见的生长图2。0056检视表达不同木糖异构酶的酵母属菌株的平均菌落大小表明，观察到ESXI具有最强的效果，CPXI和PIXI在该生理试验中具有相似的强效果，但效果看起来比ESXI要弱。阴性对照仅。
44、转化有PSCMB454简单载体的酵母属菌株显示出与未转化的酵母属的背景生长区分不开的弱背景生长。0057B还在液体培养基上对菌株生长进行了评价。对具有20GL1木糖作为单一碳源且被调节至PH56的最低限培养基接种单一菌落。7天后，将培养物分成等份，储存在80并作为起始培养物用于生长实验。在相同的最低限培养基上进行生长实验并接种起始培养物。在摇瓶中进行10天的培养250RPM，30。通过测定OD600NM对生长进行评估图5。0058从图5中可以推断ESXI转化的酵母属菌株的生长稍微强于CPXI转化的酵母属菌株。误差条代表每种菌株3个测量的摇瓶的一个标准偏差，并指示测量的统计显著性。00596制备。
45、无酵母细胞的提取物0060将表达ESXI、CPXI的酵母属菌株的单菌落转移到含有20GL1木糖和67GL1无氨基酸酵母氮源的最低限培养基中。将PH调至56。将培养物在30下250RPM有氧培养7至10天。通过离心收获细胞，在室温用无菌水洗涤一次，在无菌DD水中重悬使OD600NM200并在80冷冻。0061将冷冻的细胞悬浮液在冰上解冻，并调节至OD600NM200。对1000L细胞悬浮液添加100LNMDT缓冲储液250MMNACL，10MMMNCL2，1MMDTT，250MMTRIS/HCLPH75和11LPMSF储液在异丙醇中100MM。将500L缓冲的细胞混悬液转入PRECELLYSGL。
46、ASSKIT0,5MMORDER91PCSVK05并在PRECELLYS24PEQLAB均质器HOMOGENISATOR中以机械方式裂解。裂解在5500RPM下进行2X15秒。通过在13200G/4条件下离心而除去细胞碎片。将得到的裂解物分成等份，在液氮中冷冻并在80贮存。00627分析木糖异构酶活性的测量结果0063A对于一些木糖异构酶活性的测量，我们应用了基于山梨醇脱氢酶SD的分光光度法测定。作为木糖异构酶的产物，形成了异构糖木酮糖。在酶检定中，测定木酮糖的生成量。为了测量在总细胞裂解物中的异构酶活性，以联合XISD检定的形式进行酶法测定图6。对于所有其它实验，酶法测定以两步进行，第一步为。
47、木糖异构化，随后是木酮糖浓度测定作为第二步。在两步骤方案中，在第一步骤之后进行木糖异构酶的失活95，10MIN。下面给出酶法测定混合物的组成0064说明书CN104204202A119/13页120065在96孔微量滴定板中进行测定，并于340NM追踪动力学。0066对表达不同XI的酿酒酵母的细胞提取物中的酶活性进行评价图6，显示使用砂真杆菌XI获得最高活性。CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASXI活性是可测量的且高于无XI的细胞提取物的背景水平，但与另两种提取物相比显著更低。0067B对于一些木糖异构酶活性的测量，应用基于HPLC的方法。通过木糖浓度降低而间接测量所产生的木酮糖的。
48、量图7。使用H柱和DIONEXULTIMATE3000仪器进行测定。00688大肠杆菌中木糖异构酶的表达、木糖异构酶纯化和活性测量0069通过使用标准分子生物学技术，使所有木糖异构酶在阿拉伯糖诱导型启动子下在大肠杆菌K12TOP10细胞中表达。用002阿拉伯糖在25和200RPM诱导XI表达14小时。通过离心收集培养物，弃上清并将细胞在100MM磷酸盐缓冲液PH70中重悬，OD600NM在200和300之间。按照标准提纯方法通过超声使细胞裂解。裂解的细胞在20000G在4离心30分钟。将澄清的上清液分成等份并冻存于80。在纯化之前，将裂解物在冰上解冻，并添加咪唑至最终10MM。纯化在500LN。
49、INTA离心柱SPINCOLUMNBIORAD上进行。柱子用100MM磷酸盐缓冲液PH70平衡，并将细胞裂解物装载到柱子上。柱子用具有20MM咪唑的100MM磷酸盐PH70洗涤，并用含250MM咪唑的相同缓冲液洗脱。根据指导手册用MICROBIOSPIN柱BIORAD进行咪唑去除和缓冲液交换磷酸盐向TRISCL。根据指导手册在10凝胶BIRADCRITERIONXT上进行SDSPAGE分析。将所有蛋白纯化至同质性99。根据指导手册通过来自BIORAD的BRADFORD试剂来确定蛋白浓度。使用牛血清蛋白作为标准物。获得所有纯化蛋白的最终浓度约为2G/L。0070使用基于终点HPLC的方法请参见上文进行对纯化蛋白的初步活性测量。测量在酶与底物之比E/S比为005的条件下在60进行2H。如前所述，在异构化后使反应失活。0071使用测定法来了解纯化酶的比活性。如图7所示，使用砂真杆菌XI观察到最高比活性119。使用CLOSTRIDUMPHYTOFERMENTASXI得到最低的比活性21。所得的数据与粗细胞提取物中的XI活性测量结果一致。在两种情况下，本发明描述的两种新的异构酶具有高于参照CPXI的活性。00729测定纯。