复合微生物环保肥料及其制备方法.pdf

本发明公开了一种复合微生物环保肥料及其制备方法，所述环保肥料按原料的重量份数比计由60～70份的有机肥、20～25份的无机肥、1～5份的微量元素、0.1～0.5份的发酵复合菌、1～2份的酵素菌、2～5份的腐植酸、0.1～0.5份的壳寡糖和1～2份的生物菌组成。该方法将发酵复合菌与水混合均匀，得到稀释菌液；将稀释菌液加入有机肥中，混合均匀，堆积成堆，循环翻转，得到一级发酵物；再加入酵素菌，发酵至完全腐熟，低温干燥，粉碎得到二级发酵物；最后加入无机肥、微量元素、腐植酸、壳寡糖和生物菌，分拣得到复合微生物环保肥料。本发明以农牧业废弃物为主要原料，制备得到复合微生物环保肥料，从而解决农作物养分供给问题、农产品生产过程中的重金属和有机物污染问题。

1.  一种复合微生物环保肥料，其特征在于：所述环保肥料按原料的重量份数比计由60～70份的有机肥、20～25份的无机肥、1～5份的微量元素、0.1～0.5份的发酵复合菌、1～2份的酵素菌、2～5份的腐植酸、0.1～0.5份的壳寡糖和1～2份的生物菌组成，其中，所述生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌的混合物，所述生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11中任意一种或二种。

2.  根据权利要求1所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：所述生物菌中假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11重量比为1︰1～2。

3.  根据权利要求1或2所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：所述发酵复合菌为枯草芽孢杆菌、酵母菌、里氏木霉和黑曲霉的混合菌，其中，所述枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉重量比为2︰0～4︰1～2︰1～2。

4.  根据权利要求1或2所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：发酵复合菌为枯草芽孢杆菌、酵母菌、里氏木霉和黑曲霉的混合菌，其中，所述枯草芽孢杆菌、黑曲霉和里氏木霉的重量比为3︰2︰3。

5.  根据权利要求1或2所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：所述壳寡糖的分子量≤3000。

6.  根据权利要求1或2所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：所述有机肥为禽畜粪便、麸皮和豆饼的混合物，其中，所述禽畜粪便为牛粪、猪粪和猪粪中任意一种或几种，所述有机肥中禽畜粪便、麸皮和豆饼的重量比10︰1～3︰1～3。

7.  根据权利要求1或2所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：所述无机肥为氮肥、磷肥和钾肥的混合肥，所述无机肥中氮、磷和钾的重量比为2︰1～2︰1～2。

8.  根据权利要求1或2所述的复合微生物环保肥料，其特征在于：所述微量元素包括钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼，其中，钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼的重量比为2︰1～3︰0.5～1︰3～5︰1～2︰7～9︰1～4。

9.  一种权利要求1所述的复合微生物环保肥料制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)按上述的重量份数比计称取有机肥、无机肥、微量元素、发酵复合菌、酵素菌、腐植酸、壳寡糖和生物菌；
2)将发酵复合菌与水按重量比1︰5～50混合均匀，得到稀释菌液；
3)将步骤2)中的稀释菌液加入有机肥中，混合均匀，堆积成堆，循环翻转，发酵10～15天，即可达到基本腐熟状态，得到一级发酵物；
4)向步骤3)中得到的一级发酵物中加入酵素菌，发酵至完全腐熟，低温干燥，粉碎得到二级发酵物；
5)向步骤4)中二级发酵物中加入无机肥、微量元素、、腐植酸、壳寡糖和生物菌，混合均匀造粒成球，分拣得到复合微生物环保肥料。

10.  根据权利要求9所述的复合微生物环保肥料制备方法，其特征在于：所述复合微生物环保肥料中，N、P、K的含量分别≥5％，有机质≥50％，有效活菌数≥1亿/g，pH值为6.5～7.5。

复合微生物环保肥料及其制备方法
技术领域
本发明涉及有机肥料领域，具体地指一种复合微生物环保肥料及其制备方法。 
背景技术
目前，食品安全事故频发，农民在已受到污染的土地上，按照常规的种植方法也可能出现重金属超标的事件，如近期发生的大批湖南大米重金属超标现象，而土壤重金属超标是其主要诱因。另外，由于农药和化肥的长期使用，使得土壤中人工有机污染物的含量越来越高，我国农业环境污染和生态失衡现象日趋严重，农作物的产量和质量受到严重影响，进而威胁到人类的生存环境，由此而引发的农产品污染、农产品质量与安全问题越来越受到人们的关注，成为制约新阶段农业生产持续高效发展的瓶颈。 
然而，传统的有机肥料产品并不能较好地解决各种污染问题，因此利用现代生物技术手段，加快新型生物环保肥料的研制迫在眉睫。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种复合微生物环保肥料及其制备方法。本发明以农牧业废弃物为主要原料，制备得到复合微生物环保肥料，从而解决农作物养分供给问题、农产品生产过程中的重金属和有机物污染问题。 
为解决上述技术问题，本发明提供的一种复合微生物环保肥料，所述环保肥料按原料的重量份数比计由60～70份的有机肥、20～25份的无机肥、1～5份的微量元素、0.1～0.5份的发酵复合菌、1～2份的酵素菌、2～5份的腐植酸、0.1～0.5份的壳寡糖和1～2份的生物菌组成，其中，所述生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌的混合物，所述生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11中任意一种或二种。 
进一步地，所述生物菌中假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11重量比为1︰1～2。 
假单胞菌HN103购于华中农业大学，分类命名为Pseudomonas putida HN103，保藏日期为：2011年5月26日，保藏单位为：CCTCC，保藏编号为：CCTCC：M2011184，假单胞菌HN103公开于公布号为CN102286405A的中国发明专利一种假单胞菌及其用途和去除环境中镉污染的方法。 
假单胞菌HN103对重金属Cd²⁺具有较好的钝化效果；考察该菌与枯草芽孢杆菌混合使用钝化镉的影响，发现混合菌钝化镉的效果优于单独使用该菌的效 果，重金属镉的去除率达到86.73％；对该菌钝化其他重金属(Cu²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺)的性能进行研究，发现该菌对不同重金属的耐受能力不同，对Zn²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺的钝化能力较强，对Hg²⁺较弱。 
通过在肥料中添加该重金属钝化菌与枯草芽孢杆菌，对钝化土壤中多种重金属有较好效果，能将土壤中重金属转变为低毒或无毒的形态。 
短小芽孢杆菌Y11购于华中农业大学或北京华农生物工程有限公司。苯酚作为一种常见的人工有机污染物之一，以苯酚残余浓度为指标，短小芽孢杆菌Y11在不同初始pH、温度、重金属离子、苯酚浓度的条件下，降解苯酚的能力，发现该菌可在48h内能快速降解苯酚，最适温度为28℃，最适pH为8.0，对苯酚的耐受浓度最高为400mg/L，低浓度的金属离子对该菌降解苯酚的能力几乎没有影响。 
通过在肥料中添加该短小芽孢杆菌，偏碱性条件下施用该肥料，对降解土壤中有机污染物有很好效果。 
再进一步地，所述发酵复合菌为枯草芽孢杆菌、酵母菌、里氏木霉和黑曲霉的混合菌，其中，所述枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉重量比为2︰0～4︰1～2︰1～2。 
再进一步地，发酵复合菌为枯草芽孢杆菌、酵母菌、里氏木霉和黑曲霉的混合菌，其中，所述枯草芽孢杆菌、黑曲霉和里氏木霉的重量比为3︰2︰3。 
以畜禽粪便(如牛粪)为处理对象，选择枯草芽孢杆菌、酵母菌、里氏木霉、黑曲霉4种菌剂，以堆肥过程中升温和起温的速度、堆肥温度、堆肥时间等为指标，分别考察这四种菌剂对堆肥发酵过程的影响及不同菌剂添加量对堆肥升温效果的影响，确定发酵复合菌的最佳配比为枯草芽抱杆菌︰黑曲霉︰里氏木霉＝3︰2︰3。 
研究表明，采用发酵复合菌，可以令堆肥在10天左右完全腐熟，且使得牛粪堆肥产品的种子发芽指数提高21.7％。 
再进一步地，所述壳寡糖的分子量≤3000。 
研究表明：分子量≤3000的壳寡糖，对其抑制常见植物病原真菌活性和促生长作用进行了研究。 
采用生长速率法研究壳寡糖对植物病原菌的抑制作用。以菌丝生长速率为指标，研究不同浓度壳聚糖对4种常见植物病原菌抑菌活性的影响，确定壳寡糖对大丽轮枝孢、立枯丝核、甘蓝枯萎病原菌、天门冬茎点霉菌的有效中浓度(EC₅₀)分别为0.1580、0.1590、0.1680、0.1970mg/mL，即上述各菌菌丝在壳寡糖有效中浓度下的生长均受到很强抑制。 
以种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数为指标，研究不同浓度壳聚糖 对水稻、甘蓝种子发芽率的影响，确定壳寡糖促进水稻、甘蓝种子萌发的最适浓度为100mg/L。选取水稻和甘蓝进行盆栽实验，研究壳寡糖对水稻白叶枯和甘蓝枯萎病的防治效果，发现喷施100mg/L壳聚糖对防治这两种植物病害有很好效果，且对植物有一定的促生长效果。 
通过在肥料中添加低浓度的壳聚糖，对抑制植物病原真菌及促进种子萌发生长、防治植物病害具有很好效果。 
再进一步地，所述有机肥为禽畜粪便、麸皮和豆饼的混合物，其中，所述禽畜粪便为牛粪、猪粪和猪粪中任意一种或几种，所述有机肥中禽畜粪便、麸皮和豆饼的重量比10︰1～3︰1～3。其中 
再进一步地，所述无机肥为氮肥、磷肥和钾肥的混合肥，所述无机肥中氮、磷和钾的重量比为2︰1～2︰1～2。 
再进一步地，所述微量元素包括钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼，其中，钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼的重量比为2︰1～3︰0.5～1︰3～5︰1～2︰7～9︰1～4。 
本发明还提供了一种复合微生物环保肥料制备方法，包括以下步骤： 
1)按上述的重量份数比计称取有机肥、无机肥、微量元素、发酵复合菌、酵素菌、腐植酸、壳寡糖和生物菌； 
2)将发酵复合菌与水按重量比1︰5～50混合均匀，得到稀释菌液； 
3)将步骤2)中的稀释菌液加入有机肥，混合均匀，循环翻转，发酵10～15天，即可达到基本腐熟状态，得到一级发酵物； 
4)向步骤3)中得到的一级发酵物中加入酵素菌，发酵至完全腐熟，低温干燥，粉碎得到二级发酵物； 
5)向步骤4)中二级发酵物中加入无机肥、微量元素、腐植酸、壳寡糖和生物菌，混合均匀造粒成球，分拣得到复合微生物环保肥料。 
所述复合微生物环保肥料中，N、P、K的含量分别≥5％，有机质≥50％，有效活菌数≥1亿/g，pH值为6.5～7.5。 
本发明的有益效果在于： 
1.本发明的使用效果 
本发明的复合微生物环保肥料对于作物解磷、解钾作用较明显，促苗、促根生长效果好，平均能够提高作物产量5～8％；并且在施用该款环保肥料的作物时，土传病害发生率明显降低，农药用量降低了20％，表明生物活性物质壳寡糖对植物土传病害抑制作用明显，也从推广试验结果验证了壳寡糖的抑菌效果优异。 
2.经济效益 
本发明的复合微生物环保肥料制备工艺简单，具有较好的经济效益。 
3.社会与生态效益 
本发明充分利用畜禽粪便和植物秸秆等农牧业废弃物，并将其转化为生物环保肥料产品，能够实现资源的循环利用，并减少粪便对养殖环境的危害，减轻养殖厂的不良气味，并消耗周边堆积的植物秸秆等农业废弃物，使养殖厂周边环境得到改善，而且变废为宝，将对社会经济发展起到较大的推动作用。 
本发明解决了长期困扰农作物生产过程中重金属和人工有机物污染等问题，通过重金属钝化菌将土壤中重金属转变低毒或无毒的形态，也通过人工有机物降解菌将不同来源的人工有机物降解成为无毒的物质，给环境污染治理方面带来了新的思路。 
本发明采用生物工程技术进行生物环保肥料的生产，降低化肥和农药使用量，倡导了生态型的种植新模式，寻求综合解决无机化肥和高毒农药引起的农业生产环境污染问题，为生产出高产、安全、优质、高效的农产品提供了有力的保障。 
附图说明
图1为30℃下不同镉浓度中的假单胞菌HN103生长情况图； 
图2为添加假单胞菌HN103和空白对照能降低Cd²⁺的最低值图； 
图3A为只加假单胞菌HN103与空白对照的OD₆₀₀对比图； 
图3B为镉浓度降低对比图； 
图4A为假单胞菌HN103在15mg/L Hg²⁺中的生长图 
图4B为假单胞菌HN103在500mg/L Zn²⁺中的生长图； 
图4C为假单胞菌HN103在200mg/L Ni²⁺中的生长； 
图4D为假单胞菌HN103在400mg/L Cu²⁺中的生长； 
图4E为假单胞菌HN103在400mg/L Mn²⁺中的生长； 
图5为pH对苯酚降解的影响图； 
图6为温度对苯酚降解的影响图； 
图7为金属离子对苯酚降解的影响图； 
图8为短小芽孢杆菌Y11对苯酚的耐受浓度及降解速率图； 
图9为短小芽孢杆菌Y11对低浓度苯酚的降解情况图； 
图10为短小芽孢杆菌Y11对湖水中低浓度苯酚的降解情况图； 
图11为低温对苯酚降解的影响图 
图12A为(GlcN)n标样HPLC图； 
图12B为Mw3000寡糖样品的HPLC图； 
图13A为壳寡糖对不同植物病原真菌的抑制效果图， 
其中，A：Phomopsis asparagisacc B：Rhizoctonia solani C：Verticillium daltliae D:Fusarium oxysporum f.sp conglutinans； 
图13B为壳寡糖对不同植物病原真菌的抑制率图； 
图14为不同浓度壳寡糖对水稻黄单胞菌生长的影响图； 
图15为不同浓度寡糖对水稻种子发芽率的影响图； 
图16A为不同浓度壳寡糖对甘蓝种子发芽率的影响图； 
图16B为不同浓度的寡糖对甘蓝种子发芽率的影响图； 
图17为不同菌剂对猪粪发酵升温的效果图； 
图18为枯草芽孢杆菌不同添加量对升温效果的影响图； 
图19为黑曲霉不同添加量对升温效果的影响图； 
图20为里氏木霉不同添加量对升温效果的影响图； 
图21为酵母不同添加量对升温效果的影响图； 
图22为中试试验的单因素分析图； 
图23为发酵剂升温效果试验图。 
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。 
一、本发明中理论基础验证 
1.假单胞菌HN103钝化研究 
1.1 假单胞菌HN103钝化镉的性能研究 
1.1.1 假单胞菌HN103在不同镉浓度下的生长状况 
如图1所示：在抗Cd²⁺实验中，发现假单胞菌HN103在液体LB培养基中最大抗镉浓度为500mg/L。随着Cd²⁺浓度的再增高，菌体的延迟期逐渐增长，代时逐渐变大，达到1000gm/L时，已明显受到抑制。 
1.1.2 添加假单胞菌HN103和空白对照能降低Cd²⁺的最低值 
如图2所示：在假单胞菌HN103对Cd²⁺的抗性小试试验中，与自然环境接触，发现当Cd²⁺的浓度为0.9mg/L左右时，加了假单胞菌HN103能将Cd²⁺的浓度降低到0.572mg/L，而空白对照水样Cd²⁺的浓度降低到了0.684mg/L，这说明空气中有能在低浓度Cd²⁺环境下生长的菌，而加了假单胞菌HN103效果相对较好。 
1.1.3 小试中假单胞菌HN103与空白对照对于降低Cd²⁺浓度的研究结果 
在Cd²⁺浓度为80mg/L左右时，加了假单胞菌HN103比空白对照，菌种生长要多，OD₆₀₀达到0.8，空白只有0.62；加了假单胞菌HN103能将Cd²⁺浓度从84.2mg/L降低到16.48mg/L，去除率达到80.43％，而什么都不加凭借实验室空气中的菌去除率只有51.25％。 
由上可知，假单胞菌HN103能将0.88mg/L的Cd²⁺降低到0.572mg/L，在Cd²⁺ 浓度较高时，能将Cd²⁺浓度从84.2mg/L降低到16.48mg/L。 
1.2对其他金属的钝化实验 
表1 不同Zn²⁺浓度下细胞的生物量 

如图4和表1～2所示：在假单胞菌HN103对其他金属的耐性研究中，发现其对不同金属的耐受能力不同，对Hg²⁺的耐受性较弱，只有15mg/L；对Ni²⁺，菌体可以在200mg/L的金属浓度下生长；Cu²⁺和Mn²⁺的浓度在400mg/L下时，菌体可以生长；对Zn²⁺可以在500mg/L下生长。说明该菌可能能在复杂的金属环境中生长。 
研究表明；该菌能够较好的钝化多种有毒的重金属，进而很好地将土壤中重金属转变低毒或无毒的形态。 
2.短小芽孢杆菌Y11降解研究 
2.1 实验方法2.1.1培养基 
(1)贫营养细菌分离培养基 
贫营养细菌分离培养基：将牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释1000倍，加1.5％的水洗琼脂制成。 
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,NaCl 0.5g，水100mL，pH 7.2-7.4。(2)种子液的培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。121℃高压蒸汽灭菌30min备用。(3)基础发酵培养基碳源的添加量是2％，氮源是1％，无机盐：NaCl 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.02％，CaCl₂ 0.01％，KH₂PO₄ 0.1％。 
(4)计数培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4，琼脂1.6％(调节PH后添加)，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。 
2.1.2 短小芽孢杆菌Y11苯酚降解能力的研究 
由于苯酚是人工有机污染物中挥发酚的主要代表之一，经唯一碳源试验，初步表明短小芽孢杆菌Y11具有苯酚降解的能力，故对其降解苯酚的能力以及影响条件进行了进一步的的研究。 
2.1.2.1 苯酚含量的测定 
苯酚浓度的测定：当浓度大于0.5mg/L时，采用4-氨基安替比林直接分光光 度法；当小于0.5mg/L时，采用4-氨基安替比林氯仿萃取分光光度法(GBT7490-1987)。 
2.1.2.2 初始pH对短小芽孢杆菌Y11降解苯酚性能的影响 
试验中苯酚模拟土壤设置的初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。将配制好的浓度为100mg/L的苯酚模拟土壤各取200mL置于500mL的三角瓶中，按试验设置的梯度分别调节pH，再按10⁷cfu/mL接种量接入菌体，置于28℃200r/min摇床中培养。每隔12h测定苯酚的残余浓度，连续测定48h。 
2.1.2.3 温度对短小芽孢杆菌Y11降解苯酚性能的影响 
将配制好的浓度为100mg/L的苯酚模拟土壤各取200mL置于500mL的三角瓶中，调节pH至8.0，再按10⁷cfu/ml接种量接入菌体，分别置于温度不同的摇床中，摇床温度分别为20℃、28℃、37℃，转速均为200r/min。每隔12h测定苯酚的残余浓度，连续测定48小时。 
2.1.2.4 重金属离子对短小芽孢杆菌Y11降解苯酚性能的影响 
选择水体中常见的重金属离子Fe³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺，其浓度分别为：Fe³⁺(0.1mg/L-5.0mg/L)，Mn²⁺(0.1mg/L-0.5mg/L)，Zn²⁺(0.5mg/L-2mg/L)，Cu²⁺(0.1mg/L-1.0mg/L)，Cd²⁺(0.01mg/L-0.1mg/L)。pH 8.0，其它同2.1.4.3。 
2.1.2.5 Y11对高浓度苯酚的降解能力研究 
分别配制初始浓度为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的苯酚模拟土壤。将配制好的不同浓度的苯酚模拟土壤各取200mL置于500mL的三角瓶中，调节pH至8.0，再按2％接种量接入菌体，置于28℃200r/min摇床中培养。每隔12h测定苯酚的残余浓度，连续测定120h。根据降解情况确定其最大耐受浓度。 
2.1.2.6 Y11对低浓度苯酚的降解能力研究 
设定苯酚的浓度是10mg/L，氮源是(NH4)₂SO₄、磷源KH₂PO₄。TN、TP添加量分别是2mg/L、0.2mg/L。将配好的低浓度苯酚模拟土壤各取200mL置于500mL的三角瓶中，调节pH至8.0，按10⁷cfu/mL接种量接入菌体后，置于28℃200r/min的摇床中培养。每隔12h取样测定一次，连续测定48h。 
2.1.2.7 Y11对天然土壤中低浓度苯酚的降解能力研究 
用取自武汉紫阳湖公园旁边土壤与苯酚混合配制成含有10mg/L苯酚的土壤。将制备好的含有低浓度苯酚的土壤取200mL置于500mL的三角瓶中，调节最佳pH 8.0，再按10⁷cfu/ml接种量接入菌体，置于28℃，200r/min摇床中培养，每隔12h取样测定一次，连续测定48h。 
2.1.2.8 Y11对低温条件下苯酚的降解能力研究 
分别配制初始浓度为100mg/L的和10mg/L苯酚模拟土壤。其中10mg/L低浓度 度苯酚模拟土壤按2.1.4.6配制。将配好的低浓度苯酚模拟土壤各取200mL置于500mL的三角瓶中，调节最适pH8.0，按2％接种量接入菌体后，置于10℃，200r/min的摇床中培养。每隔一段时间取样测定一次，连续测定7天。 
2.2 实验结果 
2.2.1 短小芽孢杆菌Y11对污染土壤中苯酚降解能力的研究 
2.2.1.1 pH对短小芽孢杆菌Y11降解苯酚性能的影响 
在初始pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下对短小芽孢杆菌Y11进行降解试验，48h后试验结果如图5所示。 
pH是微生物生长的一个重要因素之一。当超过微生物的适应范围后，微生物的生理代谢就会受到抑制，从图中可以看出菌株在偏碱性条件下苯酚的降解性能更好，在偏酸性的环境中代谢受到了一定的抑制。从图6中可以看出菌株在pH＝8.0对苯酚的降解效果最好。从对照CK可以看出起始浓度为100mg/L的苯酚，挥发并不是很多。48h后苯酚的残留浓度是97.2mg/L。 
2.2.1.2 温度对短小芽孢杆菌Y11降解苯酚性能的影响 
对于任何微生物，在其温度适应范围内，随着温度的升高，代谢活性也会提高。当超过一定范围，反而会降低。这主要是微生物代谢所需要的酶的活性受温度的影响较大。温度越低，酶活越低。超过最适的温度，酶活也会减小。所以只有在最适温度下，微生物的代谢活性最强。 
对短小芽孢杆菌Y11在20℃、28℃、37℃在三种温度下进行降解试验，48h后试验结果如图6所示。 
从图6中可以看出，最适的温度是28℃。48h后，20℃、28℃、37℃下苯酚的降解率分别是74.80％、95.69％、86.88％。说明低温对苯酚降解的影响很大。 
2.2.1.3 重金属离子对短小芽孢杆菌Y11降解苯酚性能的影响 
贫营养细菌对重金属离子很敏感。有研究者认为寡营养细菌可以用于重金属的污染生物监测，用重金属(Ag、Hg、Cd、Cr、Pb、Zn、Cu)处理来自土壤中的寡营养细菌发现其Ed50(生态剂量)可以达到10^–3-10^–5mmol·L^-1。有些研究表明，加入一定量Pb和Cd，不会影响苯酚的降解情况，而加入少量的Fe、Cu、Pb、Zn、Mn等离子，会促进苯酚的降解。 
对短小芽孢杆菌Y11进行降解试验，48h后测定的苯酚的残留量并计算降解率，结果如图7所示。 
从图7中可以看出，Fe³⁺(0.1mg/L-5.0mg/L)可以提高对苯酚的降解速率，但是并不明显；Mn²⁺(0.1mg/L-0.5mg/L)、Cd²⁺(0.01mg/L-0.1mg/L)的加入不影响苯酚的降解；而Cu²⁺(0.1mg/L-1.0mg/L)、Zn²⁺(0.5mg/L-2mg/L)虽然对苯酚降解有一定的抑制，但是却不明显。试验结果与已有的研究不同。上述试验结 果说明在自然土壤中，低浓度的金属离子对该菌降解苯酚的能力几乎没有影响。 
2.2.1.4 对高浓度苯酚的降解能力的研究 
从图8中可以看出，苯酚的降解都有一个迟滞期和快速降解期，该菌株对苯酚的耐受浓度最高为400mg/L。随着苯酚浓度的增加，菌株需要适应的时间越长，所以表现为迟滞期的延长。从100mg/L到400mg/L，每个浓度之间的滞期间隔在12h左右。随着时间的延长，菌株在土壤中的大量增殖，苯酚的降解速率快速提高，这可能是因为苯酚作为碳源，它的浓度决定了菌株在土壤中的最终生物量。而当苯酚的降解到达末期时，苯酚的降解速率总是起始浓度高的大于起始浓度低的。100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L到达降解末期时的降解速率分别是1.99mg/L·h、2.64mg/L·h、2.99mg/L·h、3.22mg/L·h。 
2.2.1.5 对低浓度苯酚的降解能力研究 
从图9中可以看出，菌株在苯酚起始浓度10mg/L的模拟土壤中，并没有出现迟滞期。而是随着时间的延长，降解曲线逐渐趋于平缓，这是由于随着作为碳源的苯酚在逐渐降解过程，可供维持菌株利用的碳源逐渐减少，从而影响了菌株的代谢。 
2.2.1.6 对天然湖水中低浓度苯酚的降解能力研究 
从图10中可以看出，加入短小芽孢杆菌Y11的实验组苯酚降解速率明显高于对照组。虽然对照组的土壤中也有内源性的微生物，但是降解速率明显较低。24h后测得湖水中的苯酚残留浓度是0.48mg/L，对照组CK是3.42mg/L。48h后湖水中的苯酚残留浓度为0.0068mg/L。 
2.2.2.7 对低温条件下苯酚的降解能力的研究 
从图11中可以看出，该菌可以在10℃的低温下，对苯酚进行降解。但是其适应期较长，从4天左右降解速度开始加快。7天后，100mg/L苯酚降解率为87.3％，10mg/L苯酚的降解率为82.4％。 
3.壳寡糖抑制病原真菌和促进植物生长试验 
3.1壳寡糖的分析结果 
Mw3000壳寡糖样品的HPLC分析 
用HPLC法测定寡糖标品及样品中的糖成分如图12A、12B。 
图12A示的是(GlcN)n系列标样的HPLC图，(GlcN)₂、(GlcN)₃、(GlcN)₄、(GlcN)₅、(GlcN)₆的保留时间分别为14.598min、24.047min、30.338min、38.259min、41.289min。 
图12B显示的是Mw≤3000壳寡糖样品的HPLC图，从图中可以看出，以二糖、三糖、四糖居多，基本与TLC分析的结果相符。 
3.2壳寡糖抑制植物病原菌的影响因素 
壳寡糖的抑菌活性已得到了不少报道，然而在不同的研究中壳寡糖抑菌活性存在着很大的差异，有些甚至是完全相反的结果。导致这些差异的原因主要是壳寡糖的抑菌活性受到多种因素的影响。 
3.2.1壳寡糖对不同植物病原菌的抑制情况 
引起经济作物土传真菌病害的病原物主要集中在腐霉菌属(Pythium)、镰刀菌属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)和疫霉属(Phytopthora)。常见农作物的真菌病害如稻梨孢(Pyricularia oryzae)、链铬孢菌(Alternaria alternate)、尖镰胞菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis snyder et hansen)、立枯丝核(Rhizoctonia solani)、大丽轮枝孢(Verticillium daltliae)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、天门冬茎点霉菌(Phomopsis asparagisacc)、甘蓝枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp conglutinans)。 
对稻梨孢、链铬孢菌、尖镰胞菌甜瓜专化型、立枯丝核、大丽轮枝孢，尖孢镰刀菌、天门冬茎点霉菌、甘蓝枯萎病原菌进行抑菌实验。结果如图13A和13B所示。 
图13B表明，与对照相比，经过壳寡糖处理过的病原菌菌丝体生长受到明显抑制，说明壳寡糖具有良好的抑菌活性。抑菌圈直径的测定结果发现，Mw≤3000的壳寡糖对以上各供试植物病原菌均有一定程度的抑制作用，但不同的病原菌的抑制效果差异很大，其中对立枯丝核、大丽轮枝孢，天门冬茎点霉菌、甘蓝枯萎病原菌的抑制效果尤为明显，抑制率分别达到了33.89％、36.72％、31.67％、33.23％。 
3.2.3不同浓度的壳寡糖对水稻黄单胞菌生长的影响 
从图14中可以看出，随着壳寡糖浓度的增加，吸光度的值是越来越小，这就说明壳寡糖对水稻白叶枯是有抑制作用的，并且随着浓度的增加，抑制率作用是增强的，当壳寡糖浓度为0.1mg/mL时，抑制作用不明显，但当壳寡糖浓度为0.75mg/mL时，对水稻白叶枯的抑制率可达到100％。 
3.2.4壳寡糖促发芽促生长实验结果 
壳寡糖除了具有防病抗病作用，还具有促进种子萌发的作用，采用不同浓度梯度(0、50、100、200、500、1000mg/L)的寡糖，对水稻、甘蓝进行促进种子萌发的最适浓度研究。 
(1)壳寡糖对水稻种子发芽率的影响 
从图15中可以看出，每隔24h测量一次发芽率，相比于CK，在一定浓度内添加壳寡糖会一定程度的促进发芽，当浓度为100mg/L的寡糖所对应的发芽率最高，继续增大寡糖浓度时，发芽率会有一定下降，说明浓度并不是越大越好。 
表3 不同浓度壳寡糖对水稻种子萌发的影响 

*数据统计后用LSD检验，表中字母相同的表示无显着差异(P＝0.05)。 
从表3中比较出处理组与对照组的参数，可以看出壳寡糖能够显著影响水稻种子的萌发，其中壳寡糖处理浓度为100mg/L时，水稻种子发芽率、发芽势、发芽指数还有活力指数均为最高，50mg/L、200mg/L和500mg/L浓度的壳寡糖溶液处理里的水稻种子发芽率、发芽势力、发芽指数和活力指数与对照组没有显著差异，而浓度高于500mg/L壳寡糖处理的水稻种子其发芽势、活力指数明显低于对照组，可见低浓度的壳寡糖对水稻种子的萌发具有促进作用，最适浓度为100mg/L。 
(2)壳寡糖对甘蓝种子发芽率的影响 
从图16A、图16B可以看出，在一定范围内添加壳寡糖会促进植物种子发芽，但是一旦超过最适浓度，不仅没有起到促进作用，相比于CK来说，还起到抑制作用，所以选择适宜浓度的壳寡糖作为种子萌发剂还是极其重要的。 
表4 不同浓度壳寡糖对甘蓝种子萌发的影响 

*数据统计后用LSD检验，表中字母相同的表示无显着差异(P＝0.05)。 
从表4中可以看出，低浓度壳寡糖对甘蓝种子萌发有促进作用，其中浓度为100mg/L的壳寡糖浓度处理的甘蓝种子促进效果最好，其发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数显著高于不添加壳寡糖的对照组。浓度为50mg/L、200mg/L和500mg/L的壳寡糖处理的甘蓝种子在发芽率、发芽指数和活力指数与对照相比没有显著差异。浓度为1000mg/L的壳寡糖处理的甘蓝种子其发芽率、发芽势、活力指数显著低于对照组。 
4.发酵复合菌最佳菌剂组合的研究 
4.1 实验材料与方法 
4.1.1 试验菌株 
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，酵母菌Saccharomyces cerevisiae，里氏 木霉Trichoderma reesei，黑曲霉Aspergillus niger，以上菌株均由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供。 
4.1.2 畜禽粪便 
牛粪由武汉瑞泽园生物环保科技有限公司提供。 
4.1.3 不同菌剂对牛粪发酵升温效果的研究 
将牛粪170g及玉米秸秆粉80g装入罐头瓶中混合均匀，调节含水量60％左右，封口，115℃灭菌15min，自然冷却后放入冰箱中使其温度降到8℃后接种，分别接入枯草芽孢杆菌、黑曲霉、里氏木霉和酵母，接种量4‰。酵母在2％蔗糖溶液中用40℃复水15min，然后降温到30℃活化2h后接入。对照组以蒸馏水代替。置于保温杯中于8℃冰箱中培养，每隔12h记录温度。 
4.1.4 功能菌剂不同添加量对牛粪发酵升温效果的影响 
共准备28个罐头瓶。每个罐头瓶内装畜禽粪便170g，玉米秸秆粉80g，混合均匀，封口后于115℃灭菌15min。 
取其中1～7号瓶，各加入黑曲霉1.0g、里氏木霉1.0g、酵母1.0g，再分别加入芽孢杆菌0g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g。 
取其中8～14号瓶，各加入芽孢杆菌1.0g、里氏木霉1.0g、酵母1.0g，再分别加入黑曲霉0g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g。 
取其中15～21号瓶，各加入黑曲霉1.0g、芽孢杆菌1.0g、酵母1.0g，再分别加入里氏木霉0g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g。 
取其中22～28号瓶，各加入黑曲霉1.0g、里氏木霉1.0g、芽孢杆菌1.0g，再分别加入酵母0g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g。 
将28个罐头瓶置冰箱中8℃条件下发酵，间隔12小时记录温度，考察功能菌剂不同添加量对升温效果的影响。 
4.1.5 不同菌剂对牛粪发酵升温效果的工厂化验证试验 
工厂化验证试验在武汉瑞泽园生物环保科技有限公司进行。以新鲜牛粪为主要原料，添加玉米秸秆粉作为堆肥发酵的辅料，调节含水量60％左右，采用机械方式混合及翻堆。堆高1m，圆锥状。当温度升高到30℃以上开始翻堆，每天14：00翻堆一次。堆肥量为1.0吨，共设5个试验组，分别添加酵母、枯草芽孢杆菌、木霉和黑曲霉，接种量1‰，对照组用玉米秸秆粉代替菌剂。翻堆前测量堆体温度，每隔24小时测定表层下15cm温度，分别取锥状堆肥每边中部及顶部5点测定。在堆肥起始和终止时取样，取样点在表层下25cm，分别为锥状堆肥每边中部及顶部5点，样品量200g左右，存于4℃冰箱中保存。当无明显恶臭时终止发酵。 
4.1.6 最佳菌剂组合的工厂化验证试验 
以武汉瑞泽园生物环保科技有限公司的新鲜牛粪为主要原料，添加玉米秸秆粉为辅料，调节含水量60％左右，采用机械方式混合、人工翻堆。堆肥量0.5吨/堆，共设4个处理，2个重复，分别为：A组为接种最佳菌剂组合发酵剂；B组为空白对照；C组为接种平均配方发酵剂；D组为接种无酵母的发酵剂。具体配方如表1。堆高0.5m，圆锥状。当温度升高到30℃以上开始翻堆，每天14：00翻堆一次，接种量1‰，对照组用玉米秸秆粉代替菌剂。 
表5 最佳菌剂组合的效果验证试验设计 

4.1.7 种子发芽率的测定 
样品浸出液的制备：150mL的三角瓶中取10g堆肥试验样品，加入90mL的蒸馏水，加入大约10～20颗玻璃珠，120r/min的摇床上震荡30min，沉淀30min，取上清液。 
培育白菜种子：在洁净培养皿中铺上一层滤纸，滤纸大小与平皿大小相吻合。平皿中注入5mL的样品浸出液，使滤纸充分湿润。然后在滤纸上均匀的放置10粒颗粒完整的白菜种子，放入25℃培养箱箱中培养3d后取出检测。采用蒸馏水代替样品浸出液作为对照组。 
种子发芽指数的测定：使用直尺分别测量并记录种子发芽后的根长和茎长，并且记录没有发芽的种子数。计算公式：种子发芽指数GI(Germination Index)＝(浸提液种子发芽率×发芽根长)/(空白液种子发芽率×发芽根长)×100％。 
4.1.8 含水量的测定 
将玻璃平皿105℃烘干0.5h，冷却后记录质量m₀。取待测样品10g左右加入上述烘干的玻璃平皿中，称重m₁。在105℃烘干4h～6h称量m₂。含水量按照以下公式计算：W＝(m₁-m₂)/(m₁-m₀)×100％。 
4.2 结果与分析 
4.2.1 不同菌剂对牛粪发酵升温效果的小试研究 
在供试的4种功能菌剂中，对牛粪发酵升温效果的顺序依次是芽孢杆菌、黑曲霉、木霉、酵母。 
从图17中可以看出，升温效果最好的是枯草芽孢杆菌，升温可达5℃， 可能是因为芽孢在萌发时产生大量的生物热，使系统快速升温，而酵母菌在8℃下活性不高，与空白对照的升温差别不大。 
4.2.2 枯草芽孢杆菌不同添加量对堆肥升温的效果 
枯草芽孢杆菌在固体发酵的过程中，产生大量的芽孢。芽孢在适宜条件下萌发，能产生大量的热量使得系统升温。而且枯草芽孢杆菌能产生大量的蛋白酶和淀粉酶，分解牛粪中的粗蛋白和淀粉。 
从图18中可以看出，混菌培养中芽孢杆菌的添加量为1.5g时，发酵剂表现的活性最强。 
4.2.3 黑曲霉不同添加量对堆肥升温的效果 
黑曲霉属于霉菌，在固体发酵生产黑曲霉菌剂的过程中形成大量黑色孢子，孢子在适宜温度和湿度条件下萌发。在试验材料中加入的辅料秸秆粉含有大量难以被其它类型的微生物分解和利用的纤维素与半纤维素，却可作为黑曲霉孢子萌发及菌丝生长的碳源物质。黑曲霉在利用原辅料中纤维素和半纤维素的过程中产生大量的热。 
从图19中可以看出，混菌中添加1.0g黑曲霉时，发酵剂表现的活性最强。 
4.2.4 里氏木霉不同添加量对堆肥升温的效果 
从图20中可以看出，混菌中木霉的最佳剂量为1.5g，即添加1.5g木霉时，发酵剂表现的活性最强。试验所用里氏木霉为纤维素酶高产菌株，固体发酵的菌剂中含有大量的纤维素酶，能够分解原辅料中的纤维素作为碳源。 
4.2.5 酵母不同添加量对堆肥升温的效果 
从图21中可以看出，酵母的添加量与升温关系不大，进一步验证了单因素试验的结果：酵母的添加对堆肥升温效果不明显。试验所用酵母为高温型酿酒酵母。一般的酵母只能利用单糖或低聚糖作为碳源，而不能利用淀粉。测得试验所用牛粪中还原糖的含量为2.413mg/g，不能够为酵母的生长提供足够的碳源，所以升温缓慢。 
综合上述的单因素实验结果可知，牛粪堆肥中四种试验菌株的最佳比例为枯草芽孢杆菌︰黑曲霉︰木霉＝3︰2︰3。 
4.2.6 不同菌剂对牛粪发酵升温效果的工厂化中试结果 
堆肥中嗜热微生物的最适温度为55℃～60℃，在此温度下能大量降解有机质并且快速分解纤维素。堆肥过高的温度会快速消耗有机质，降低堆肥产品的质量。然而温度过低也不利于堆肥的腐熟，堆肥中的微生物在40℃左右时的活性只有最适温度的2/3左右，这会使得有害物质分解缓慢，堆肥时间延长，并且不利于堆肥的腐熟。所以在提高堆肥温度的同时，采用翻堆的方 式对堆肥进行通气和降温，使其温度在55℃～60℃，达到最高的生物降解活性。 
由图22可见，堆肥开始一天内，各组升温效果差别不大。但一天以后添加菌剂的试验组温度加速上升，而未添加任何菌剂的空白对照组升温持续平缓。并且，添加黑曲霉和木霉对升温效果最明显，黑曲霉在早期升温效果显著，而添加木霉在升温中后期有明显的加速升温作用。这可能由于黑曲霉和木霉菌剂中有大量未萌发的孢子，孢子在堆肥系统中萌发产生热量导致升温加速。试验中枯草芽孢杆菌升温效果低于其他三种菌剂，这与实验室小试的结果存在差异。可能是由于小试的起始温度为8℃，而中试的起始温度在14℃，此时更加利于真菌孢子的萌发，从而使得黑曲霉和木霉的升温效果好于枯草芽孢杆菌。酵母在升温过程中也体现出了一定的活性，可能是因为堆肥中的土著微生物将淀粉等分解为单糖或低聚糖，作为酵母生长的碳源。 
4.2.7 最佳菌剂组合的效果验证 
4种发酵剂配比对堆肥的升温效果试验如图23所示，在A组中最佳菌剂组合之后，在堆肥的第二天温度可以达到60℃的高温，而B、C、D三组均在第四天达到60℃高温。由此可见使用优化配方的发酵接种剂可以缩短堆肥初期升温时间，令堆肥快速进入高温期。 
到目前为止学者们从堆肥的物理、化学、生物学变化提出了多种评价堆肥腐熟度的指标。用生物学方法测定堆肥的植物毒性是检验堆肥腐熟度的有效方法。发芽指数(GI)是通过检验堆肥对植物发芽是否产生抑制作用来评价堆肥无害化程度的指标，它不但能检测堆肥样品的植物毒性水平，而且能预测堆肥植物毒性的变化。 
有机肥是应用于作物生产的。种子发芽指数作为生物学指标，能够很客观的反映出堆肥产品的应用安全性，是比较可靠的腐熟度评价指标。有研究者认为，在试验中，如果GI>50％，表明堆肥已腐熟并达到了可接受的程度，即基本没有毒性。本试验中试产品的种子发芽指数见表2。 
表6 最佳菌剂组合的效果验证试验的发芽指数测定 

试验结果显示，所有实验组的种子发芽指数均大于50％，基本腐熟。A组(接种最佳菌剂组合)种子发芽指数88.9％，腐熟最完全，基本上消除了由于腐熟不完全对植物发芽的抑制作用。这是因为A组升温快，高温期时间相对较长，腐熟更加完全。所以，添加优化配方的发酵接种剂对堆肥的成熟 起到了良好的促进作用。在实际生产中，可以缩短生产时间，降低生产成本，提高堆肥场地利用率，降低堆肥场的建设费用。 
分别研究了酵母、枯草芽孢杆菌、木霉与黑曲霉四种微生物对牛粪堆肥发酵的促进作用，并探讨几种微生物在堆肥发酵时的相互作用，同时得到一组能令牛粪堆肥快速升温腐熟的高效微生物组合。试验结果显示，此高效微生物组合的配比为枯草芽孢杆菌︰黑曲霉︰里氏木霉＝3︰2︰3，酵母在升温过程中所起作用不明显。中试结果显示，用此微生物组合，可以令堆肥在10天左右腐熟，并且使得牛粪堆肥产品的种子发芽指数分别提高21.7％。 
实施例1 
复合微生物环保肥料的制备方法，包括以下步骤： 
1)按上述的重量份数比计称取60份的有机肥、25份的无机肥、1份的微量元素、0.5份的发酵复合菌、1份的酵素菌、5份的腐植酸、0.1份的壳寡糖和1份的生物菌；其中，生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11组成，假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11重量比为1︰1； 
枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉重量比为2︰2︰1︰1；壳寡糖的分子量≤3000；有机肥中牛粪、麸皮和豆饼的重量比10︰1︰1；无机肥中氮、磷和钾的重量比为1︰1︰1；微量元素中钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼的重量比为2︰2︰1︰5︰2︰7︰4； 
2)将发酵复合菌与水按重量比1︰5混合均匀，得到稀释菌液； 
3)将步骤2)中的稀释菌液加入有机肥，混合均匀，堆积成堆，循环翻转，发酵10～15天，即可达到基本腐熟状态，得到一级发酵物； 
4)向步骤3)中得到的一级发酵物中加入酵素菌，发酵至完全腐熟，低温干燥，粉碎得到二级发酵物； 
5)向步骤4)中二级发酵物中加入无机肥、微量元素、腐植酸、壳寡糖和生物菌，混合均匀造粒成球，分拣得到复合微生物环保肥料。 
实施例2 
复合微生物环保肥料的制备方法，包括以下步骤： 
1)按上述的重量份数比计称取70份的有机肥、20份的无机肥、5份的微量元素、0.1份的发酵复合菌、2份的酵素菌、2份的腐植酸、0.5份的壳寡糖和2份的生物菌；其中，生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11组成，假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11重量比为1︰2； 
枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉和里氏木霉重量比为2︰4︰2︰2；壳寡糖的分子量≤3000；有机肥中牛粪、麸皮和豆饼的重量比10︰3︰3；所述无机肥中氮、磷和钾的重量比为2︰1︰1。 
微量元素中钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼的重量比为2︰1︰0.5︰3︰1︰9︰1； 
2)将发酵复合菌与水按重量比1︰50混合均匀，得到稀释菌液； 
3)将步骤2)中的稀释菌液加入有机肥，混合均匀，堆积成堆，循环翻转，发酵10～15天，即可达到基本腐熟状态，得到一级发酵物； 
4)向步骤3)中得到的一级发酵物中加入酵素菌，发酵至完全腐熟，低温干燥，粉碎得到二级发酵物； 
5)向步骤4)中二级发酵物中加入无机肥、微量元素、腐植酸、壳寡糖和生物菌，混合均匀造粒成球，分拣得到复合微生物环保肥料。 
实施例3 
复合微生物环保肥料的制备方法，包括以下步骤：1)按上述的重量份数比计称取65份的有机肥、22份的无机肥、3份的微量元素、0.3份的发酵复合菌、2份的酵素菌、3份的腐植酸、0.3份的壳寡糖和2份的生物菌；其中，生物菌为假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11组成，假单胞菌HN103和短小芽孢杆菌Y11重量比为1︰1； 
枯草芽孢杆菌、黑曲霉和里氏木霉的重量比为3︰2︰3；壳寡糖的分子量≤3000；有机肥中牛粪、麸皮和豆饼的重量比10︰2︰2；所述无机肥中氮、磷和钾的重量比为2︰1︰1；微量元素中钙、镁、硫、硼、锌、硒和钼的重量比为2︰2︰0.8︰4︰1︰8︰3； 
2)将发酵复合菌与水按重量比1︰50混合均匀，得到稀释菌液； 
3)将步骤2)中的稀释菌液加入有机肥，混合均匀，堆积成堆，循环翻转，发酵10～15天，即可达到基本腐熟状态，得到一级发酵物； 
4)向步骤3)中得到的一级发酵物中加入酵素菌，发酵至完全腐熟，低温干燥，粉碎得到二级发酵物； 
5)向步骤4)中二级发酵物中加入无机肥、微量元素、腐植酸、壳寡糖和生物菌，混合均匀造粒成球，分拣得到复合微生物环保肥料。 
二、实施例3制备得到复合微生物环保肥料进行大田实验 
1、材料与方法 
1.1试验地点；新洲区潘塘舒祠村。 
1.2供试土壤 
试验地土壤属潮土田，肥力中等。土壤理化基本形状如下：pH 6.35(水提取)、有机质24.1g/kg、碱解氮142mg/kg、有效磷10.8mg/kg、速效钾84mg/kg、Cd 0.34mg/kg、Pb 7.04mg/kg、As 1.38mg/kg Hg 0.51mg/kg。 
土壤测试方法：有机质-重络酸钾容量法，碱解氮-1N氢氧化钠扩散法，速 效磷-0.5M碳酸氢钠浸提、钼锑抗比色法，速效钾-1N醋酸铵浸提、火焰光度法，pH值-电位法，铅、砷、镉、汞-火焰光度法 
1.3供试肥料 
复合微生物环保肥料中(粉剂，N、P、K含量≥5％，有机质≥50％，有效活菌数≥1亿/克，壳寡糖含量≥0.1％，pH 7.1，) 
1.4供试作物 
水稻(品种：金优402) 
1.5试验方法 
采用随机区排列，共设4个处理，四次重复，计15个小区，小区面积20m²。处理如下： 
处理1：常规施肥+施药2次 
处理2：常规施肥+等量细沙(200kg/667m²)+施药2次 
处理3：常规施肥+复合微生物环保肥料(200kg/667m²)+施药2次 
处理4：常规施肥+复合微生物环保肥料(200kg/667m²)+施药1次 
复合微生物环保肥料在水稻移栽前基施，等量细沙用量相同。 
1.6栽培管理 
常规施肥为每亩基施早稻配方肥(总养分25％，12-6-7)，返青期追尿素5kg。大量元素水溶肥料在分蘖期(5月15日)、孕穗期(5月25日)、灌浆期(6月15日)各喷一次，用量为大量元素水溶肥料6g兑水1.8kg。处理2喷等量清水。其他田间管理相同。早稻于4月25日移栽，每亩1.8万穴，5月6日追施尿素，7月22日收割。 
2、结果与分析 
2.1产量分析与讨论 
7月20日取样考种，每小区随机取5穴，考察项目包括株高、穗长、每穴穗数、没穗粒数、空秕率、干粒重、小区产量等。处理3比处理2增产22kg/667m²，增幅为5.74％，处理间差异达显著水平；处理4产量略低于处理3，但差异不显著，未达到0.05水平。 
试验表明施用复合微生物环保肥料，每穴穗数、每穗粒数和饱粒数有所增加，固有一定的增产作用；处理3与处理4的试验结果表明，减少1次施药对水稻产量影响不明显，说明复合微生物环保肥料具有一定的抗病虫害的能力。 
2.2水稻重金属分析与讨论 
种植试验结束后，对不同处理后的土壤中Pb、As、Cd、Hg有效态重金属含量进行了检测，从处理1来看，土壤中的重金属污染物符合土壤环境标准GB15618-1995中的二级标准，符合维护人体健康的土壤限制值；处理3、4与处 理1相比，施用复合微生物环保肥料后，能降低土壤中Pb含量8-9％，降低土壤中Cd含量8.8％，对As和Hg作用不明显。 
本次试验还对不同处理下对大米中的Pb、As、Cd、Hg重金属含量进行了检测，试验发现各处理组的大米均未超过GB2762中大米的污染物限量标准，但各处理Pb、As和Cd都处于比较高的水平，存在着超标的风险；试验还发现，施用复合微生物环保肥料后，能降低大米中Pb和Cd含量12％左右，对As和Hg作用不明显。 
复合微生物环保肥料，对水稻有明显的增产作用。每667m²增产22kg，增产率5.74％。 
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。