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1、10申请公布号CN104212852A43申请公布日20141217CN104212852A21申请号201410409077422申请日20140820CCTCCNOM201372720131229201410195152120140509CNC12P17/18200601C07D487/08200601C12R1/46520060171申请人云南大学地址650091云南省昆明市翠湖北路2号云南大学72发明人李一青戎贺赵立兴徐丽华54发明名称一种酚嗪类抗肿瘤抗生素及其制备方法57摘要本发明是一种新的酚嗪类抗肿瘤抗生素，其特点是通过发酵培养保藏登记号为CCTCCNOM2013727的一株链霉菌。
2、菌株（STREPTOMYCESSP）YIMR4，再对其发酵产物进行分离纯化，得到分子式为C25H16N4O4，分子量为436的一种新的抗肿瘤抗生素，经实验证明，本发明的抗肿瘤抗生素对人胃癌及人宫颈癌肿瘤细胞有抑制作用。66本国优先权数据83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图8页10申请公布号CN104212852ACN104212852A1/1页21一种新酚嗪类抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤1菌种液体种子培养液体种子培养基的制备取酵母膏2060G、葡萄糖2060G、麦芽膏30。
3、70G、复合维生素2545MG、加水至1000ML，PH72，120C灭菌30MIN；发酵将菌株YIMR4接种到灭菌后的培养基中，28C下于转速为190250转分钟的摇床上摇瓶发酵2天；2菌种发酵培养发酵培养基的制备取淀粉200300G、牛肉膏1050G、葡萄糖0515G、酵母膏3070G、蛋白胨1050G、CACO32060G、加水至1000ML，PH70，120C灭菌30MIN；发酵将上述方法L中得到的菌株YIMR4种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10，28C下于转速为190250转分钟的摇床上摇瓶发酵68天；3发酵液处理发酵液经25003500转分钟离心，离心时。
4、间为1525分钟；以等体积乙酸乙醋萃取发酵上清液35次，回收乙酸乙醋，菌丝体用丙酮浸泡并超声破碎，回收丙酮，合并二部分提取物，得到具有活性部位的棕褐色膏状物；进行硅胶柱层析，以三氯甲烷甲醇401至11梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；将粗品一种抗肿瘤抗生素依次进行甲醇凝胶及三氯甲烷甲醇301硅胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；将一种抗肿瘤抗生素较纯品进行甲醇凝胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素纯品，所述抗肿瘤抗生素的结构为。2根据权利要求1所述的一种新酚嗪类抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的酵母膏为40G、葡萄糖为40G、麦芽膏为50。
5、G、复合维生素为35MG。3根据权利要求1所述的一种新酚嗪类抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的淀粉为240G、牛肉膏为30G、葡萄糖为10G、酵母膏为50G、蛋白胨为30G、CACO3为40G。4根据权利要求1所述的一种新酚嗪类抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的摇床转数为220转分钟，所述发酵时间为7天。权利要求书CN104212852A1/4页3一种酚嗪类抗肿瘤抗生素及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种新的酚嗪类抗肿瘤抗生素及其制备方法，属于生物技术领域。背景技术0002不断出现的新疾病及病原菌对抗生素耐药性的增强迫使人们必须加快新药的研发，从微生物中发现高效低毒的天然源新药先。
6、导化合物是近年来研究的热点之一。由于目前对普通土壤环境微生物的研究已有较长历史，从中发现新颖结构活性化合物的难度越来越大，为了寻找新抗生素先导化合物，人们已将目光转向栖息于特殊生境的微生物。0003广泛存在于植物体内的内生菌由于长期与其宿主植物的共同进化，拥有特殊的代谢途径,产生活性新化合物的几率较大，是一类具有较好开发潜力的新微生物资源。云南西双版纳拥有丰富的药用植物资源，其中蕴藏着大量的植物内生菌，开展从中寻找活性新先导化合物的研究，为后续具有自主知识产权的新药研发奠定基础具有重要意义。发明内容0004本发明的目的是提供一种不同于已知酚嗪类抗生素结构的新抗肿瘤抗生素，它对人胃癌及人宫颈癌肿。
7、瘤细胞有抑制作用。0005本发明的另一个目的是提供一种新酚嗪类抗肿瘤抗生素的制备方法。0006本发明的技术方案如下一种新酚嗪类抗肿瘤抗生素，本抗生素的产生菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心；地址中国武汉；保藏日期2013年12月29日；保藏登记入册编号为CCTCCNOM2013727；通过培养一株分离自云南西双版纳药用植物组织内的链霉菌菌株STREPTOMYCESSPYIMR4，再对其发酵产物进行分离纯化，得到本抗肿瘤抗生素；本抗肿瘤抗生素是分子式为C25H16N4O4，分子量为436的化合物，该化合物具有如下结构I。0007本发明的酚嗪类抗肿瘤抗生素的制备方法，包括以下步骤L菌种液体种子培养。
8、液体种子培养基的制备取酵母膏2060G；葡萄糖2060G；麦芽膏3070G；复合维生素2545MG；加水至1000ML，PH72，120C灭菌30MIN；发酵将菌株YIMR4接种到灭菌后的培养基中，28C下于转速为190250转分钟的摇床上摇瓶发酵2天。说明书CN104212852A2/4页400082菌种发酵培养发酵培养基的制备取淀粉200300G；牛肉膏1050G；葡萄糖0515G；酵母膏3070G；蛋白胨1050G；CACO32060G；加水至1000ML，PH70，120C灭菌30MIN；发酵将上述方法L中得到的菌株YIMR4种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的1。
9、0，28C下于转速为190250转分钟的摇床上摇瓶发酵68天。00093发酵液处理发酵液经25003500转分钟离心，离心时间为1525分钟；以等体积乙酸乙醋萃取发酵上清液35次，回收乙酸乙醋，菌丝体用丙酮浸泡并超声破碎，回收丙酮，合并二部分提取物，得到具有活性部位的棕褐色膏状物；进行硅胶柱层析，以三氯甲烷甲醇401至11梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；将粗品一种抗肿瘤抗生素依次进行甲醇凝胶及三氯甲烷甲醇301硅胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；将一种抗肿瘤抗生素较纯品进行甲醇凝胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。0010在液体种子。
10、培养基的制备中最好是酵母膏为40G；葡萄糖为40G；麦芽膏为50G；复合维生素为35MG。0011在发酵培养基的制备中最好是淀粉为240G；牛肉膏为30G；葡萄糖为10G；酵母膏为50G；蛋白胨为30G；CACO3为40G。0012摇瓶发酵时摇床转数为220转分钟为宜，发酵时间以7天为宜。0013发酵液离心时，离心机转速以3000转分钟为宜，所述的离心时间为20分钟为宜，所述的乙酸乙醋的萃取次数以4次为宜。0014一种抗肿瘤抗生素纯品经分析型HPLC检测，色谱柱（25046MM，LUNA5M，PHENOMENEX，C18；甲醇水73等度洗脱，检测波长254NM，流速10ML/MIN，证实一种抗。
11、肿瘤抗生素纯品纯度高于98。0015本发明抗肿瘤抗生素经常规MTT法实验证明，它对人肿瘤细胞株有抑制作用，其抗肿瘤活性如表（1）所示。0016表（1）本发明抗肿瘤抗生素的体外抗肿瘤活性肿瘤细胞IC50（UG/ML）人胃癌细胞株BGC823149人宫颈癌细胞株HELA288附图说明0017图1为本发明抗生素的化学结构式；图2为本发明抗生素的红外吸收光谱；图3为本发明抗生素的氢谱DMSOD6；图4为本发明抗生素的碳谱13CNMR、DEPT；图5为本发明抗生素的HMBC谱；图6为本发明抗生素的HSQC谱；图7为本发明抗生素的HHCOSY谱；图8为本发明抗生素的NOESY谱；图9为本发明抗生素的质谱。。
12、说明书CN104212852A3/4页5具体实施方式0018下面结合具体实施例对本发明作进一步说明实施例1化合物I的制备L菌种液体种子培养液体种子培养基的制备取酵母膏40G；葡萄糖40G；麦芽膏50G；复合维生素35MG；加水至1000ML，PH72，120C灭菌30MIN；发酵将菌株YIMR4接种到灭菌后的培养基中，28C下于转速为220转分钟的摇床上摇瓶发酵2天。00192菌种发酵培养发酵培养基的制备取淀粉240G；牛肉膏30G；葡萄糖10G；酵母膏50G；蛋白胨30G；CACO340G；加水至1000ML，PH70，120C灭菌30MIN；发酵将上述方法L中得到的菌株YIMR4种子液加到。
13、灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10，28C下于转速为220转分钟的摇床上摇瓶发酵7天。00203发酵液处理发酵液经3000转分钟离心，离心时间为20分钟；以等体积乙酸乙醋萃取4次，回收乙酸乙醋，菌丝体用丙酮浸泡并超声破碎，回收丙酮，合并二部分提取物，得到具有活性部位的棕褐色膏状物；进行硅胶柱层析，以三氯甲烷甲醇401至11梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；将粗品一种抗肿瘤抗生素依次进行甲醇凝胶及三氯甲烷甲醇301硅胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；将一种抗肿瘤抗生素较纯品进行甲醇凝胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。。
14、0021如上所得的本发明化合物，具有下述理化性质1性状黄色粉末。00222分子量分子量为436。00233分子式分子式为C25H16N4O4。00244元素分析C6879、H370、N1284、O1467。00255红外吸收光谱中的特征官能团KBRIR3427，1708，1627，1579CM1波数证明分子结构中有酚羟基，羧羰基和苯环。00266综合1H谱、13C谱、HMBC、HSQC、HHCOSY谱、NOESY谱及质谱ESIMSMNA459分析数据，确定了本发明四聚肽化合物的分子量为436，分子式为C25H16N4O4，其结构如附图1所示。0027实施例2实施例1中制备的化合物（I）对肿瘤细。
15、胞的抑制活性测定采用常规MTT法。0028实验证明，化合物（I）对人肿瘤细胞株有抑制作用。0029对人胃癌细胞株BGC823的IC50（UG/ML）为149。0030对人宫颈癌细胞株HELA的IC50（UG/ML）为288。0031以上肿瘤细胞株均由东北大学保存。0032实施例3化合物I的制备说明书CN104212852A4/4页6L菌种液体种子培养液体种子培养基的制备取酵母膏20G；葡萄糖20G；麦芽膏30G；复合维生素25MG；加水至1000ML，PH72，120C灭菌30MIN；发酵将菌株YIMR4接种到灭菌后的培养基中，28C下于转速为190转分钟的摇床上摇瓶发酵2天。00332菌种发。
16、酵培养发酵培养基的制备取淀粉200G；牛肉膏10G；葡萄糖05G；酵母膏30G；蛋白胨10G；CACO320G；加水至1000ML，PH70，120C灭菌30MIN；发酵将上述方法L中得到的菌株YIMR4种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10，28C下于转速为190转分钟的摇床上摇瓶发酵6天。00343发酵液处理发酵液经2500转分钟离心，离心时间为15分钟；以等体积乙酸乙醋萃取3次，回收乙酸乙醋，菌丝体用丙酮浸泡并超声破碎，回收丙酮，合并二部分提取物，得到具有活性部位的棕褐色膏状物；进行硅胶柱层析，以三氯甲烷甲醇401至11梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，。
17、得到粗品一种抗肿瘤抗生素；将粗品一种抗肿瘤抗生素依次进行甲醇凝胶及三氯甲烷甲醇301硅胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；将一种抗肿瘤抗生素较纯品进行甲醇凝胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。0035实施例4化合物I的制备L菌种液体种子培养液体种子培养基的制备取酵母膏60G；葡萄糖60G；麦芽膏70G；复合维生素45MG；加水至1000ML，PH72，120C灭菌30MIN；发酵将菌株YIMR4接种到灭菌后的培养基中，28C下于转速为250转分钟的摇床上摇瓶发酵2天。00362菌种发酵培养发酵培养基的制备取淀粉300G；牛肉膏50G；葡萄糖15G；酵母膏70G；蛋白胨50。
18、G；CACO360G；加水至1000ML，PH70，120C灭菌30MIN；发酵将上述方法L中得到的菌株YIMR4种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10，28C下于转速为250转分钟的摇床上摇瓶发酵8天。00373发酵液处理发酵液经3500转分钟离心，离心时间为25分钟；以等体积乙酸乙醋萃取5次，回收乙酸乙醋，菌丝体用丙酮浸泡并超声破碎，回收丙酮，合并二部分提取物，得到具有活性部位的棕褐色膏状物；进行硅胶柱层析，以三氯甲烷甲醇401至11梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；将粗品一种抗肿瘤抗生素依次进行甲醇凝胶及三氯甲烷甲醇301硅胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；将一种抗肿瘤抗生素较纯品进行甲醇凝胶柱层析，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。说明书CN104212852A1/8页7图1图2说明书附图CN104212852A2/8页8图3说明书附图CN104212852A3/8页9图4说明书附图CN104212852A4/8页10图5说明书附图CN104212852A105/8页11图6说明书附图CN104212852A116/8页12图7说明书附图CN104212852A127/8页13图8说明书附图CN104212852A138/8页14图9说明书附图CN104212852A14。