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1、10申请公布号CN104195112A43申请公布日20141210CN104195112A21申请号201410436949622申请日20140901C12N5/10200601C12N15/6320060171申请人昆明市第一人民医院地址650000云南省昆明市青年路504号昆明市第一人民医院实验中心72发明人杨柳苏晓三王翼寅陈睿张蕾54发明名称一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法57摘要本发明公开一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法，采用BGL和NOT酶切位点以及NOT和ECOR酶切位点在PT/HB转座子载体上加入长度为589BP的CMV启动子和长度。
2、为720BP的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）基因，构建为全长4849BP的PTCMVEGFP重组载体；利用脂质体转染PTCMVEGFP转座子及辅助转座酶SB11，脂质体的用量为总DNA质量的34倍，转座酶SB11与转座子PTCMVEGFP质量比14体系转染贴壁细胞3T3，悬浮细胞H22和原代培养DC细胞。本发明方法经3648小时培养后，利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测，筛选得到一个较通用的转染体系，可高效稳定的转染各种细胞系，并具有较好的适用性和可操作性。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图6页10申请公布。
3、号CN104195112ACN104195112A1/1页21一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法，其特征在于（1）利用BGL和NOT酶切位点以及NOT和ECOR酶切位点在PT/HB转座子载体上加入长度为589BP的CMV启动子和长度为720BP的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）基因，构建全长为4849BP的PTCMVEGFP重组载体；（2）利用脂质体转染PTCMVEGFP转座子及辅助转座酶SB11，脂质体的用量为总DNA质量的34倍，转座酶SB11与转座子PTCMVEGFP质量比14体系转染贴壁细胞3T3，悬浮细胞H22和原代培养细胞DC。权利要求书CN104195112A1。
4、/4页3一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法技术领域0001本发明涉及生物技术的基因工程领域，特别是一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法。背景技术0002本发明涉及生物技术的基因工程领域，特别是一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法。背景技术0003转座子（TRANSPOSON）又称为跳跃基因，是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA序列。“睡美人”（SLEEPINGBEAUTY，SB）是现在公认应用最为广泛的转座子系统之一。近十五年大量的研究表明，“睡美人”不仅能在体外培养的鱼、小鼠和人等大多数脊椎动物的细胞中起作用，而且其介导。
5、的转基因能够稳定整合和长期表达，甚至整合的“睡美人”还能通过生殖细胞传递给后代，在后代中继续发挥作用。与其他转座系统的效率相比，“睡美人”在脊椎动物中的转座效率最高，且体内的转染效率要比体外高。0004一般用于基因转移和表达的“睡美人”系统包含带有T元件的转座子（TRANSPOSON）和介导其转座的转座酶（TRANSPOSASE）两部分。本发明选用SB11转座酶，此酶在已初具转座酶活性的SB10基础上对其4个位点进行定点突变，活性比SB10提高了约3倍。PT转座子包含由两端带有32BP的反向重复序列（IR）及同向重复序列（DR）组成的末端反向重复序列（INVERTEDTERMINALREPEA。
6、TS，ITRS），ITRS的两个DR均可以和转座酶相结合，与细胞内的一种高度保守蛋白高迁移率族蛋白（HIGHMOBILITYGROUP，HMG）HMGB1结合形成突起复合物。转座酶催化释放转座子序列，并使其特异性地整合到基因组中的TA双核苷酸位点。转座子PT/HB从载体图谱可见，在多克隆位点（MCS）两端含有极为重要的IR/DR序列。但其中缺少能够启动插入基因表达的启动子，这也许会造成载体上目的基因的过低表达甚至不表达。0005人类巨细胞病毒（CMV）启动子属于组成型启动子，它包含了三部分CMV基因，IE1/IE2增强子，以及在IE94基因上游存在的一个强启动子，是上游调节区复合体的主要部分。。
7、IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，可立即早期启动上游序列。因此CMV启动子被认为是启动真核基因表达最有力的启动子。其又因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型细胞的影响条件下均有活性。所以通常被用于构建高效真核表达载体，广泛应用于在基因工程及基因治疗领域。0006绿色荧光蛋白（GREENFLUORECENCEPROTEIN，GFP）由238个氨基酸构成，自身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，无需荧光素酶的参与。增强型绿色荧光蛋白（ENHANCEDGREENFLUORECENCEPROTEIN，EGFP）经野生型绿色荧光蛋白突变，产生双氨基酸。
8、取代而成，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定，表达高效，无种系说明书CN104195112A2/4页4依赖性等特点。带有EGFP基因的载体不仅适用于细胞基因表达、蛋白定位检测和细胞示踪标记，更能以融合蛋白的形式直观有效的检测表达载体目的基因的表达水平。因此，可将增强型绿色荧光蛋白作为一种良好的细胞指示剂，进行体外或体内实验研究。0007外源基因进入宿主细胞的主要四种方法是电穿孔法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。由于电穿孔法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒介导的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响，所以现在普遍采用的是脂质体法转染细胞。利用脂质体介导法关键要素就是防止其。
9、毒性的产生对细胞的影响，因此脂质体与质粒的比例，质粒总量，多质粒系统内各质粒比份量，以及细胞密度，转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题。0008对于所有转染而言，可能是因为细胞间膜结构的差异，悬浮细胞的转染效率较贴壁细胞要低得多，由于细胞分裂状态差异原代细胞更难于前两者。原代细胞的转染一般需要价格非常昂贵的专用试剂盒进行转染，且转染效率也不甚理想。发明内容0009本发明的目的是提供一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法，构建一个含有可利用CMV启动的EGFP荧光表达转座子系统，并通过我们所优化获得的转染条件能高效稳定的转染各种细胞系。0010具体技术方案。
10、一种基于“睡美人”（SLEEPINGBEAUTY）转座子系统制作高效转染各类细胞的方法（1）通过基因工程手段构建含有EGFP荧光蛋白的PT载体，再加上可以高效启动目的基因表达的CMV启动子，形成完整的PTCMVEGFP转座子表达系统。利用PCR的方法从PEGFPN1载体中利用BGL和NOT酶切位点以及NOT和ECOR酶切位点在PT/HB转座子载体上分别插入长度为589BP的CMV启动子和长度为720BP的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）基因，构建全长为4849BP的PTCMVEGFP重组载体。0011（2）采用脂质体介导法转染细胞，优化后的转染方案为脂质体的用量为总DNA质量的34倍，转座酶（S。
11、B11）与转座子（PTCMVEGFP）质量比为14的体系转染3T3细胞系，H22细胞系，以及原代培养的树突状细胞（DC）。0012本发明按上述方法制备的转染细胞经3648小时培养后，利用荧光显微镜和流式细胞仪检测，筛选得到一个转染各种细胞系较通用的体系，可高效稳定的转染，具有较好的适用性和可行性。附图说明0013图1为本发明的PT/HB载体图谱。0014图2为本发明的PTCMVEGFP载体酶切鉴定图。0015图3为本发明的PTCMVEGFP载体构建流程示意图。0016图4为本发明的3T3细胞表达EGFP的荧光显微镜图。0017图5为本发明的H22细胞表达EGFP荧光的流式检测图。0018图6为。
12、本发明的DC细胞表达EGFP荧光的流式检测图。说明书CN104195112A3/4页5具体实施方式0019一种基于“睡美人”转座子系统的高效转染各类细胞的方法，所需相关材料SB11及PT/HB质粒购自ADDGENE公司；PMD19T克隆载体购自日本宝生物公司；PEGFPN1质粒由广西大学动物遗传育种与繁殖实验室馈赠；LIPOFECTAMINELTX试剂盒购自INVITROGEN公司；3T3及H22细胞系由中国科学院昆明动物所惠赠；树突状细胞（DC）BALB/C小鼠由昆明医学院提供。0020根据表达载体PEGFPN1图谱和序列设计一对含有BGL/NOT酶切位点的引物，从PEGFPN1质粒中PCR。
13、扩增并回收得到589BP的目的片段DNA，此片段包括CMV增强区，CMV全序列及TATABOX。目的片段连在PMD19T克隆载体上构成PMDCMV；再根据表达载体PEGFPN1图谱和序列设计一对含NOT/ECOR酶切位点的引物，从中钓取长度约720BP的EGFP基因全长，连接于PMD19T克隆载体中，构成PMDEGFP。通过限制性内切酶BGL/NOT以及NOT/ECOR双酶切后再连接的方法，构建PTEGFP（用于对照）和PTCMVEGFP表达重组子。酶切鉴定结果，泳道1、3、4为PTCMVEGFP线性化条带，约为4900BP；泳道2为BGL/ECOR双酶切结果，较大条带3500BP，较小条带1。
14、300BP；泳道5、6分别为BGL/NOT和NOT/ECOR双酶切结果，较小条带分别为CMV约590BP及EGFP为720BP。最终测序结果比对CMV，EGFP序列无误，成功构建的PTCMVEGFP转座子载体可用于后续转染实验。0021用于PCR扩增的引物序列为CMVBGL5GAAGATCTTAGTTATTAATAGTAATCAAT3CMVNOT5ATTTGCGGCCGCGATCTGACGGTTCACTA3EGFPNOT5ATTTGCGGCCGCGTCGCCACCATGGTGAG3EGFPECOR5CGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGT31、确实脂质体与总DNA优化质量比采用脂质体。
15、介导转染方法，LIPOFECTAMINELTX脂质体与总DNA质量比例分别为21、31和41，携带PEGFPN1荧光表达载体转染3T3细胞系。本次转染实验共转染六孔，每个配比做两个复孔。去内毒素抽提的PEGFPN1质粒浓度为023G/L，贴壁的3T3细胞以每孔8X105提前接种于24孔板上，待细胞融合度达80时，每孔转染DNA总量1G。经40小时后，通过流式细胞仪检测绿色荧光的发射波长，鉴定转染后表达荧光的细胞阳性率。0022检测结果显示，脂质体和总DNA质量21配比的转染细胞阳性率为27及299；脂质体和总DNA质量31配比的转染细胞阳性率为357及376；脂质体和总DNA质量41配比的转染。
16、细胞阳性率为381及429。从结果上可明显看出，脂质体和总DNA质量比为31和41时，转染效率明显高于21混合比，所以确定了脂质体的用量为总DNA质量的34倍最适宜。过低影响转染效率，过高超出脂质体说明书建议使用范围，易造成对细胞毒性较高以及试剂浪费。0023由于公认的细胞转染难度从贴壁细胞系，悬浮细胞系直到原代培养的细胞依次递增，本发明需要实现在原代培养的树突状细胞（DC）中转染目的基因表达，因此，以下实施选择在悬浮细胞系（H22）中完成。说明书CN104195112A4/4页600242、确实PTCMVEGFP与转座酶SB11的最佳质量比本发明在辅助转座酶SB11质粒和PTCMVEGFP质。
17、粒比例41、11、14、18和112中，确定一个转染效率最高的配比量。采用脂质体介导转染方法，LIPOFECTAMINELTX脂质体与总DNA质量选取41混合比，辅助转座酶SB11和PTCMVEGFP表达载体比例41、11、14、18和112，每个配比三个复孔，转染H22细胞系。去内毒素抽提的SB11和PTCMVEGFP质粒浓度分别为069G/L和0196G/L，H22细胞以每孔1X106提前接种于24孔板上，每孔转染DNA总量1G。经42小时后，通过流式细胞仪检测绿色荧光的发射波长，鉴定染后表达荧光的细胞阳性率。0025检测结果显示，辅助转座酶SB11质粒和PTCMVEGFP质粒比例41、1。
18、1、14、18和112中，14配比下，阳性细胞率和平均荧光强度（MFI）都明显高于其他配比组，达到477。所以确定了辅助转座酶SB11质粒和PTCMVEGFP质粒配比在14时最佳。0026采用业界公认转染难度较大的原代培养树突状细胞（DC）为靶细胞。从BALB/C小鼠股骨/胫骨骨髓中冲出混合样细胞做DC细胞诱导培养，以每孔1X106细胞数接种于24孔板上，在诱导的第3天和第5天上述确定的体系LIPOFECTAMINELTX脂质体与总DNA比例41，辅助转座酶SB11质粒和PTCMVEGFP质粒比例14，每孔DNA总量为1G，转染DC细胞两次，每次转染时用不含血清的培养基预混DNA稀释液50L和。
19、脂质体稀释液50L，并将两者混合室温孵育30MIN后滴加至细胞培养液中，6小时后更换为新鲜的完全培养基。以同样方式设置相同体系下未连入CMV启动子的PTEGFP质粒为同型对照转染组（PTEGFP质粒浓度为077G/L），至第7天时，收集细胞，通过流式细胞仪检测携带绿色荧光蛋白的细胞数比例，以及用DC细胞特异结合抗体CD11C标记检测经诱导的混合细胞样中，DC细胞携带标签基因的阳性率。0027检测结果显示，脂质体与总DNA质量41混合，辅助转座酶SB11质粒和PTCMVEGFP/PTEGFP质粒14配比体系下，转染两次后，DC细胞约占6890，混合细胞阳性率平均为148及32，同时，可见经诱导转。
20、染的细胞中，DC细胞阳性率平均为234及62。携带CMV启动子并遵照本说明优化方案转染DC的细胞阳性率明显更为理想，也高于大部分实验中提到的原代细胞转染率不及1015的结果。0028以上说明，本发明中构建的PTCMVEGFP转座子在联合SB11转座酶按上述优化后的体系转染，不仅可对常规细胞系起效，也可使目的基因在转染难度较大的原代半贴壁细胞中高效表达。说明书CN104195112A1/6页7图1说明书附图CN104195112A2/6页8图2说明书附图CN104195112A3/6页9图3说明书附图CN104195112A4/6页10图4说明书附图CN104195112A105/6页11图5说明书附图CN104195112A116/6页12图6说明书附图CN104195112A12。