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1、10申请公布号CN104073561A43申请公布日20141001CN104073561A21申请号201410324185122申请日20140708C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人北京市农林科学院地址100097北京市海淀区曙光花园中路11北京市农林科学院蔬菜研究中心2443信箱号72发明人于拴仓苏同兵隋光磊张凤兰余阳俊张德双赵岫云卢桂香汪维红徐家炳74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的SSR引物组合及其应用57摘要本发明公开了不结球白菜SSR核心引物及其应用。本发明提供了鉴定待测。
2、不结球白菜品种的SSR引物组，由单独使用的如下21个引物对组成，本发明的实验证明，本发明的实验证明，本发明开发的不结球白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测不结球白菜品种鉴定，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷。51INTCL权利要求书2页说明书7页序列表13页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页序列表13页附图3页10申请公布号CN104073561ACN104073561A1/2页21鉴定待测不结球白菜品种SSR引物组，由单独使用的如下21个引物对组成BRCSSRA011，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的。
3、单链DNA分子组成；BRCSSRA012，其由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA021，其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA022，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA031，其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA032，其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA041，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和。
4、序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA051，其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA052，其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA061，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA062，其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA063，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA071，其由序。
5、列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA072，其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA081，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA082，其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA091，其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA092，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分。
6、子组成；BRCSSRA093，其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成；权利要求书CN104073561A2/2页3BRCSSRA101，其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成；BRCSSRA102，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单链DNA分子组成。2根据权利要求1所述的引物组，其特征在于每个所述引物对中各条引物的摩尔比为11。3鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂组，由单独使用的21个PCR试剂组成；每个PCR试剂由权利要求1或2所述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水。
7、组成；所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为05MOL/L。4鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组。5权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所述的PCR试剂盒在鉴定待测不结球白菜品种的应用。6权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所述的PCR试剂盒在不结球白菜品种真伪性鉴别的应用。7鉴定或辅助鉴定待测不结球白菜品种的方法，包括如下步骤1构建DNA指纹图谱库；所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤1利用权利要求1或2所述的引物组中的21种引物分。
8、别46个标准品种进行SSR扩增，得到不同引物对的SSR扩增产物；2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到46个标准品种不同引物对的电泳图谱；3将46个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT20软件构建46个标准品种DNA指纹图谱，将46个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库；2重复上述1的方法中的13，仅将46个标准品种替换为待测样本，其余步骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱；4使用MEGA50软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种。
9、；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种；所述46个标准品种为表2所示的品种。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述SSR扩增的模板为待测不结球白菜的基因组DNA。权利要求书CN104073561A1/7页4一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的SSR引物组合及其应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的SSR引物组合及其应用。背景技术0002不结球白菜起源于我国，是我国普遍栽培的蔬菜之一。近年来，不结球白菜的育种受到极大重视，生产上普遍栽培的杂交种就不下100多个。一方面，频繁。
10、使用少数骨干自交系使得新品种的遗传基础日益狭窄，加大了优异种质资源鉴定和突破性种质创新的难度；另一方面，品种的增多以及品种的相似性越来越高，这给品种管理、保护生产者和育种家的权益带来了困难。目前种质资源鉴定、品种的真实性鉴定和品种权保护的依据仍是形态指标，具有受环境影响较大、鉴定工作量大、周期长、受季节限制等劣势。利用DNA分子标记技术建立核酸指纹库是鉴定种质资源和保护新品种的有力工具。不结球白菜的核酸指纹库构建是进行遗传多样性分析、种质创新、品种质量监控和品种保护的基础。随着DNA分子标记技术的广泛应用，以微卫星序列为基础的SSRSIMPLESEQUENCEREPEAT分子标记技术显示了独特。
11、的优越性SSR标记覆盖整个基因组、呈共显性遗传、多态性丰富、重复性好、操作简单及成本低廉等特点。目前公开发表的白菜SSR引物已有2000多对，这为利用SSR标记技术构建不结球白菜核酸指纹库提供了良好的前提条件。0003至今为止，有关不结球白菜SSR核酸指纹库构建的报道还不多见，尚无用于核酸指纹库构建的专用试剂盒。发明内容0004本发明的一个目的是提供鉴定待测不结球白菜品种SSR引物组。0005本发明提供的引物组，由单独使用的如下21个引物对组成0006BRCSSRA011，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；0007BRCSSRA012，其由序列表中。
12、序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；0008BRCSSRA021，其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；0009BRCSSRA022，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；0010BRCSSRA031，其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；0011BRCSSRA032，其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；说明书CN104073561A2/7页50012BRCSSRA041，其由序列表中序列。
13、13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；0013BRCSSRA051，其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；0014BRCSSRA052，其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；0015BRCSSRA061，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；0016BRCSSRA062，其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；0017BRCSSRA063，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列。
14、表中序列24所示的单链DNA分子组成；0018BRCSSRA071，其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；0019BRCSSRA072，其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；0020BRCSSRA081，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；0021BRCSSRA082，其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成；0022BRCSSRA091，其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分。
15、子组成；0023BRCSSRA092，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成；0024BRCSSRA093，其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成；0025BRCSSRA101，其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成；0026BRCSSRA102，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单链DNA分子组成。0027上述的引物组中，每个所述引物对中各条引物的摩尔比为11。0028本发明第二个目的是提供鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂组。00。
16、29本发明提供的PCR试剂组，由单独使用的21个PCR试剂组成；0030每个PCR试剂由权利要求1或2所述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水组成；0031所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为05MOL/L。0032本发明的第三个目的是提供鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂盒。0033本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂组。0034上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在鉴定待测不结球白菜品说明书CN104073561A3/7页6种的应用也是本发明保护的范围。0035上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在不结球白菜品种。
17、真伪性鉴别的应用。0036本发明第四个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测不结球白菜品种的方法。0037本发明提供的方法，包括如下步骤00381构建DNA指纹图谱库；0039所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤00401利用上述的引物组中的21种引物分别46个标准品种进行SSR扩增，得到不同引物对的SSR扩增产物；00412非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到46个标准品种不同引物对的电泳图谱；00423将46个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT20软件构建46个标准品种DNA指纹图谱，将46个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库；00432重复上述1的方法中。
18、的13，仅将46个标准品种替换为待测样本，其余步骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱；00444使用MEGA50软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种；0045所述46个标准品种为表2所示的品种。0046上述方法中，所述SSR扩增的模板为待测不结球白菜的基因组DNA。0047PCR扩增程序采用TOUCHDOWN程序94预变性5MIN；94变性35S，62。
19、复性45S每个循环降低1，72延伸45S，共7个循环；94变性35S，55复性45S，72延伸45S，共27个循环；72延伸6MIN；12保存。0048本发明的实验证明，本发明开发的不结球白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测不结球白菜品种鉴定，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷，其中SSR引物组合遍及白菜整个基因组且具有唯一扩增位点，代表性较强；该试剂盒的检测结果稳定可靠、操作简单快速，可以实现检测的规模化和标准化，特别是试剂盒包含的每对SSR核心引物扩增等位基因的梯度分子量标准，它可以形成商品化产品，用于不结球白菜核酸指纹库的构建、种质资源和育种材料遗传多样性分析和不结球白菜。
20、品种的真实性鉴定等。另外，SSR引物的梯度分子量标准替代了参照品种，可直接作为电泳的分子量MARKER。附图说明0049图1为21对SSR核心引物扩增等位基因的梯度分子量标准0050图2为引物BRCSSRA092扩增部分自交系的检测结果0051图3为46份不结球白菜自交系的基因分型图0052图4为21对SSR核心引物对46份不结球白菜自交系的聚类图具体实施方式说明书CN104073561A4/7页70053下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0054下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0055实施例1、不结球白菜21对SSR核心引物、分子量标准。
21、及含有其试剂盒的制备0056一、SSR核心引物的制备0057从大白菜2000多对SSR引物中经过大量的筛选试验挑选出来表1所示的21对SSR核心引物。0058表1为21对SSR核心引物序列005900600061二、分子量标准的确定006246份不结球白菜高代自交系，名称如下表2所示。0063表2为46份不结球白菜自交系0064说明书CN104073561A5/7页8006500661、提取基因组DNA说明书CN104073561A6/7页90067将46份不结球白菜待测品种，采用CTAB法提取待测样品的DNA每份材料各取5株叶片进行混合，经冷冻干燥后磨成粉末称01G，装入2ML离心管中。每管。
22、加入800L65预热的CTAB缓冲液，迅速振荡混匀，放入65水浴锅水浴30MIN，期间至少颠倒混匀一次。再向离心管中加入800L氯仿/异戊醇氯仿异戊醇为241，振荡混匀，静止5MIN后，12000R/MIN离心10MIN。吸600L上清液转入另一只2ML离心管中，加入等体积20预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，放于20冰箱冷却20MIN，然后10000R/MIN离心5MIN，弃上清。用800L75乙醇漂洗2次，每次10000R/MIN离心5MIN，弃上清液收集沉淀，最后室温下吹干沉淀，加入200LDDH2O溶解DNA，得到各份不结球白菜的基因组DNA。00682、PCR扩增0069用实施例1获得的2。
23、1对SSR核心引物分别对46份不结球白菜待测品种进行PCR扩增，得到每份不结球白菜的21种SSR扩增产物。0070上述PCR扩增的反应体系采用20L，其由10L2PCRMIXTRANSGENAS11103、SSR引物上下游引物各1UL，每条引物在反应体系的终浓度均为05MOL/L、2ULDNA模板20NG/UL和水组成；可以作为PCR试剂。0071PCR扩增程序采用TOUCHDOWN程序94预变性5MIN；94变性35S，62复性45S每个循环降低1，72延伸45S，共7个循环；94变性35S，55复性45S，72延伸45S，共27个循环；72延伸6MIN；12保存。0072得到的SSR扩增产。
24、物，将该PCR产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染，通过CALIPERLABCHIP自动核酸分析仪的1KB芯片图2，将46份样本的21对SSR核心引物扩增产物做成梯度分子量标准如图1所示。00733、聚类0074取出银染后的凝胶晾干后扫描成图片保存，根据每对引物扩增等位基因的梯度分子量标准读取待测样品的片段大小，缺失条带记为“”，利用GGT20软件构建了46个品种的基因分型图图3，即46个品种的DNA指纹图谱，由46个品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库。0075使用MEGA50软件的UPGMA法对上述46个品种的DNA指纹图谱进行聚类作图，结果如图4所示21对SSR核心引物组合将46。
25、份不结球白菜自交系完全区分；当遗传距离为035时，46份不结球白菜可划分成四类第类是乌塌菜，以W字母开头；第类是奶白菜，以N字母开头；第类是黑叶白菜，以H字母开头；第类是青梗菜，以Q字母开头。且上述划分与白菜实际播种的是一致的。0076上述结果可以看出，21对SSR核心引物组合可以用来品种鉴定或品种真实性鉴定或种植资源鉴定，具体方法如下0077用21对引物分别对待测样本进行PCR扩增，得到待测样本的21种PCR产物，将上述PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到图谱利用GGT20软件构建待测样本基因分型图，即待测样本DNA指纹图谱；0078使用MEGA50软件的UPGMA法比对待测样本D。
26、NA指纹图谱和上述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种。说明书CN104073561A7/7页100079可以制备一种鉴定或辅助鉴定待测不结球白菜品种的试剂盒，包括21对引物或者21种PCR试剂。0080实施例2、21对SSR核心引物在鉴定待测不结球白菜品种中的应用00811、提取基因组DNA0082提取待测不结球白菜已知为淮南塌地乌2号，隶属于乌塌菜类叶片的基因组DNA。00832、PCR扩增00。
27、84按照实施例1的二的2中的方法，用实施例1获得的21对SSR核心引物分别对待测不结球白菜进行PCR扩增，得到21种SSR扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到待测不结球白菜21种SSR扩增产物图谱。00853、聚类0086将图谱利用GGT20软件构建待测样本基因分型图，即待测样本DNA指纹图谱库；0087使用MEGA50软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和上述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或。
28、候选不为该品种。0088结果待测样本DNA指纹图谱与DNA指纹图谱库中BRACH252淮南塌地乌2号的DNA指纹图谱一致，说明其为乌塌菜类中的淮南塌地乌2号。说明书CN104073561A101/13页110001序列表CN104073561A112/13页1200020003序列表CN104073561A123/13页130004序列表CN104073561A134/13页140005序列表CN104073561A145/13页150006序列表CN104073561A156/13页160007序列表CN104073561A167/13页170008序列表CN104073561A178/13页180009序列表CN104073561A189/13页190010序列表CN104073561A1910/13页200011序列表CN104073561A2011/13页210012序列表CN104073561A2112/13页220013序列表CN104073561A2213/13页23序列表CN104073561A231/3页24图1图2说明书附图CN104073561A242/3页25图3说明书附图CN104073561A253/3页26图4说明书附图CN104073561A26。