一种提取生物浸出液中氧化亚铁硫杆菌胞外聚合物的工艺 【技术领域】
本发明涉及金属硫化矿浸矿细菌——氧化亚铁硫杆菌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)的提取工艺，主要采用PBS-HCHO-碱法(磷酸缓冲液，甲醛，氢氧化钠)对生物浸出液中的菌体的胞外聚合物进行提取，本工艺有效地避免了菌体细胞在机械力的作用下易破碎的缺点，较好的提取了氧化亚铁硫杆菌(A.f菌)的胞外聚合物，避免菌体内的核酸、蛋白质等杂质的引入。
背景技术
生物浸矿技术在针对贫、杂、细金属矿石有价金属富集上的成功应用，表现出许多优于传统冶金工艺的特点，越来越受到选矿和冶金行业的普遍重视，已经成为矿产资源利用领域的前沿研究课题。尽管生物浸矿技术在国内工业上也得到了广泛应用，但在实际应用中存在一些的问题，尤其是一些涉及到生物浸矿技术机理的问题，仍有待于去解决。浸矿细菌在金属硫化矿的溶解过程中起到非常重要的作用，它的溶解过程目前普遍认为有两种反应过程，一是生成硫代硫酸盐的过程，另一是生成多留化物的过程。但细菌获取生存的能源的呼吸链如何来完成，还有待于解决，菌体呼吸链的循环过程得以实现必然与其代谢产物即胞外聚合物有着千丝万缕的关系，对胞外聚合物的研究也就有着重要的意义。因此，有必要建立一种通过现代技术对胞外聚合物的提取工艺。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种提取生物浸出液中氧化亚铁硫杆菌胞外聚合物的工艺，该工艺设备简单，流程短，投资小，成本低，操作简单；对环境不产生污染；引入的杂质少，能够较好地提取胞外聚合物，是一种对氧化亚铁硫杆菌胞外聚合物提取的有效方法，为以后进一步研究菌体呼吸链的机理奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采取以下设计方案：
通过PBS-HCHO-碱有效建立起胞外聚合物的提取工艺，它包括的步骤如下：
(1)对菌体细胞冲洗，除去杂质：
低速离心浓缩，去上清液，加入PBS缓冲液对菌体冲洗，反复两次；
(2)菌体与胞外聚合物的分离：
HCHO对细胞加固后，氢氧化钠溶液的加入，在0℃～-4℃，机械力的搅拌下，促使菌体和胞外聚合物分离，增加了溶液中的胞外聚合物的含量，增加了其产量；
(3)高速离心和微滤膜的过滤：
采用高速离心去除溶液中的絮体、杂质，滤膜过滤，去除溶液中的细胞和细胞残片，纯化胞外聚合物。
将浸出液静置澄清，取上清液于离心管中，然后在离心机中5500-6500r/min低速离心一段时间，去上清液，加入PBS缓冲液冲洗两次；加入HCHO和氢氧化钠溶液，在0-4℃下搅拌适当时间；然后在10000-11000r/min高速离心一段时间，取上清液0.20-0.22微米微孔滤膜过滤，除去细胞及其残片。
磷酸缓冲液(PBS)组成：NaCl 8g/l；KCl 0.2g/l；Na2HPO4·7H2O 1.15g/l；KH2PO40.2g/l。
本发明的优点是：与其它方法相比，该法提取产量较高、纯度较好，而且无大量细胞自溶现象发生。在PBS-HCHO-碱法提取EPS过程中，PBS的两次冲洗，避免了矿物等杂质的引入，加入的微量HCHO能与细胞膜的氨基、羟基、羧基和巯基等官能团反映，起到加固细胞的作用；随后NaOH溶液的加入促使带负电的EPS分子间的排斥，导致絮体解散，同时改变了胞外聚合物的溶解度，增加了EPS在水中的溶解，从而增加了EPS的产量。
【附图说明】
图1a：胞外聚合物在生物浸出液中的存在状态(结合细胞的EPS)
图1b：胞外聚合物在生物浸出液中地存在状态(溶解在溶液中的EPS)
图2：胞外聚合物的PBS-HCHO-碱法提取
图3：PBS-HCHO-碱法提取的EPS的紫外可见光吸收曲线
图4：几种方法提取的EPS的量的关系(均为108个细胞所产生)
图1a、图1b中，1为结合细胞紧的EPS，2为结合细胞松散的EPS
【具体实施方式】
如图2所示，取一只容积40ml的离心管，将其洗净，晾干，然后量取浸出液30ml于离心管中，封口，标为1号；置于离心机中，将离心机的工作条件设置为：转速5500-6500r/min，温度0-4℃，工作时间15-30min；然后取出去除上清液，迅速添加10-20mlPBS，振荡使管壁物质充分溶解在溶液中，再次低速离心，取出后去除上清液，迅速添加10-20mlPBS(注：两次取量相同)，振荡使管壁物质充分溶解在溶液中；在1号离心管中加入0.1-0.3ml浓度为36％-40％的HCHO，将其置于0-4℃下连续搅拌1h，然后加入5-10ml浓度为0.8-1.2mol/l NaOH溶液，在0-4℃，连续搅拌3h；取出后置于离心机中，离心机工作条件设置为：转速10000-11000r/min，温度0-4℃，工作时间20-25min；取出离心管，收集上清液，然后采取0.20-0.22微米微孔滤膜过滤上清液，去除细胞及其残片。所得滤液即为溶解的胞外聚合物。
以下结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
该工艺应用于福建某低品位次生硫化铜矿，矿石中金属矿物主要以蓝辉铜矿和铜蓝为主，其次为辉铜矿、块硫砷铜矿和硫砷铜矿；矿石中金属平均品位Cu 0.63％，S2.58％；将其粉碎、筛分至-74μm(≥90％)，然后灭菌，用于后续浸出实验。
本实例中所用的中温浸矿菌已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，名称为Acidithiobacillus ferrooxidans Retech-NTC-2，保藏登记号为CCTCC No：M207064，保藏日期为2007年5月11日。该菌好氧生长，不产芽孢，生长温度20-37℃，最适宜生长温度30℃，pH值1.5-2.5，端生鞭毛，可以利用Fe2+、元素硫、硫代硫酸钠、连四硫酸钾等还原性硫复合物为能源生长。用已灭菌的9K培养基进行纯培养，得到菌浓度在1010个/ml以上的氧化亚铁硫杆菌。
量取200ml已灭菌的浸矿培养基移入300ml的锥形瓶中，然后取已灭菌的次生硫化铜矿样以矿样量2％(w/v)加入锥形瓶中，调整pH值，待pH值稳定后进行生物浸矿实验。然后取纯培养的菌液，按5％(v/v)接种，采用封口膜对锥形瓶封口，浸矿条件为pH＝2，恒温30℃，摇床转速为180r/min，浸矿30天。取此矿石的生物浸出液备用，浸出液中细菌浓度达到108个/ml(矿样和菌种的添加均在无菌操作台中进行)。
Acidithiobacillus ferrooxidans Retech-NTC-2菌胞外聚合物的提取过程中，低速离心时离心机条件为：转速6000r/min，温度4℃，工作时间15min；菌体细胞的冲洗PBS缓冲液的量为10ml；HCHO的浓度采用36.5％，添加量为0.15ml；NaOH溶液的浓度采用1mol/l，添加量为5ml；高速离心时离心机条件为：转速11000r/min，温度4℃，工作时间20min；微滤膜的孔径尺寸为0.22微米。
所提取的胞外聚合物采用紫外可见分光光度计表征(如图3)，由曲线可以看出，PBS-HCHO-碱法提取的EPS对紫外可见光的吸收主要在近紫外区204nm附近均出现了波峰，没有在260nm和280nm出现核酸和蛋白质的紫外吸收峰，可见，提取的EPS较纯，主要为糖类物质。在PBS-HCHO-碱法进行EPS的提取过程中，当加入NaOH溶液时，处理的溶液迅速变成红棕色，经离心后溶液又恢复为无色，且离心管壁有红棕色物质。经过对其进行成分分析及XRD扫描可知，该红棕色物质为氢氧化铁胶体。并且利用COD仪来比较几种方法所提取的EPS的量(图4)，由图可知，该法提取的效果较好，产量较多。
在PBS-HCHO-碱法提取过程中，HCHO的加入加固了细胞，从而搅拌过程就不会使细胞破裂而使细胞内的高分子进入溶液，这样就保持了EPS的原有成分；随后碱的加入，大量的氢氧根争夺作用在EPS上Fe3+，形成氢氧化铁胶体，使得EPS与Fe3+分离，氢氧化铁胶体在后续处理过程中经离心去除，因此在紫外可见光扫描谱图中，吸收曲线完全为胞外聚合物的吸收，而不会有Fe3+的干扰。
本发明在实例中所描述的是通过PBS-HCHO-碱法来实现生物冶金浸矿细菌——Acidithiobacillus ferrooxidans Retech-NTC-2菌胞外聚合物的提取。
本发明也可用于浸取金属硫化矿中有用金属的其它氧化亚铁硫杆菌胞外聚合物的提取。
本发明的效果是：该工艺设备简单、流程短、操作简单、投资小、成本低且对环境友好，可以较好地获得菌体的胞外聚合物。