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1、10申请公布号CN104072601A43申请公布日20141001CN104072601A21申请号201410315319322申请日20140703C07K14/47200601C07K1/3420060171申请人成都蓉生药业有限责任公司地址610041四川省成都市高新区起步园科园南路7号72发明人杨宇杨汇川余鼎吕家成兰学渊74专利代理机构成都高远知识产权代理事务所普通合伙51222代理人李高峡杜朗宇54发明名称血液制品中FII沉淀的制备方法57摘要本发明提供了血液制品中FII沉淀的制备方法，它是以血浆为原料，利用低温乙醇法依次制备得到FIIIIII沉淀、FIIII上清，再取FIIII。
2、上清经过低温乙醇法分离FII，压滤，取沉淀即得；与现有技术不同的是，本发明分离FII后的压滤过程中，使用PALL50滤板，采用硅藻土为助滤剂，预涂层所用硅藻土为8095G/M2滤板，待滤液中硅藻土的用量为0203G/L血浆。所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。本发明研究表明，采用本发明方法制备的FII沉淀，其中球蛋白纯度大幅提高，为提高产品质量提供了保障；同时，采用本发明方法制备的球蛋白，可以提高球蛋白收率，明显增加商品利润，为企业带来的商业价值不可估量。51INTCL权利要求书1。
3、页说明书7页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图6页10申请公布号CN104072601ACN104072601A1/1页21血液制品中FII沉淀的制备方法，它是以血浆为原料，利用低温乙醇法依次制备得到FIIIIII沉淀、FIIII上清，再取FIIII上清经过低温乙醇法分离FII，压滤，取沉淀即得，其特征在于分离FII后的压滤过程中，使用PALL50滤板，滤板的用量为510M2/1000L；采用硅藻土为助滤剂，预涂层所用硅藻土为8095G/M2滤板，待滤液中硅藻土的用量为0203G/L血浆；所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量。
4、为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。2根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述硅藻土中，SIO2含量为960962，AL2O3含量为1012、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。3根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述硅藻土的比表面积为2223M2/G，优选为2228M2/G。4根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述硅藻土的离心湿密度为023024G/CM2，优选为0237G/CM2。5根据权利要求14任意一项所述的制备方法，其特征在于所述硅藻土型号为CELPURE1。
5、000。6根据权利要求15任意一项所述的制备方法，其特征在于所述压滤过程中，使用PALL50滤板；优选地，所述滤板的用量为510M2/1000L血浆。7根据权利要求16任意一项所述的制备方法，其特征在于所述FIIII上清采用如下方法制备1FIIIIII沉淀的制备以血浆为原料，经过低温乙醇法分离提取FIIIIII，压滤，取沉淀即得；所述压滤过程中，采用PALL50P滤板，硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，滤板用量为1013M2/1000L血浆，硅藻土用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土；所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为0050。
6、12，水溶物质含量为015020；2FIIII上清的制备取FIIIIII沉淀，经过低温乙醇法分离提取FIIII，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，采用BECOSTERILPR40滤板，硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，滤板用量为1013M2/1000L血浆，硅藻土用量为89G/L血浆；所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。8权利要求17任意一项所述方法制备的FII沉淀。9根据权利要求8所述的FII沉淀，其特征在于所述FII沉淀中球蛋白含量在99以上，优选为990100。10球蛋白的制备方法。
7、，其特征在于它是以权利要求8所述的FII沉淀为原料，精制后，即得球蛋白。权利要求书CN104072601A1/7页3血液制品中FII沉淀的制备方法技术领域0001本发明涉及血液制品中FII沉淀的制备方法。背景技术0002球蛋白用于治疗原发性免疫球蛋白G缺乏症，如X联锁低免疫球蛋白G血症，常见变异性免疫缺陷病，免疫球蛋白G亚类缺陷病等；治疗继发性免疫球蛋白G缺陷病，如重症感染，新生儿败血症，婴幼儿毛细支气管炎等；治疗自身免疫性疾病，如原发性血小板减少性紫癜，川崎病等，是重要的临床药物。目前，国内人血液制品的规模化生产主要使用低温乙醇法从健康人血浆中分离纯化球蛋白，例如医学生物制品学第二版，人民卫。
8、生出版社、血液制品学第二版，人民卫生出版社、CN2011100307783、CN2011102237605、CN2012100132270、CN2011100307764等。通常使用的分离流程见图1，其中，组分I又称FI主要含有纤维蛋白原，组分IIII又称FIIII主要含有丙球、凝血酶原和纤溶酶原，组分II又称FII主要含有球蛋白，组分V又称FV主要含有白蛋白。低温乙醇法过程相对简单，产量较高，可以进行大规模的生产，在世界范围内得到了广泛的应用。0003使用压滤技术进行固液相分离是目前多数国内外血液制品厂家用于低温乙醇分离工艺组分分离的方法。压滤通常会使用助滤剂，其粒间隙也构成复杂的迷宫结构，。
9、当制品溶液冲击滤板时，主要通过静电吸附和机械阻挡的方式来捕捉固体成分，由助滤剂形成的滤饼层和深层滤板成为捕捉固体沉淀颗粒的重要场所。滤板应有适当的孔径，以便能在截留助滤剂颗粒以形成结实的滤饼层的同时给制品溶液的流动带来最小的阻力。0004压滤工艺的主要控制参数包括滤板过滤介质类型、助滤剂类型和用量的选择等条件。0005其中，助滤剂种类繁多，其主要功能是吸附沉淀颗粒、帮助过滤，还可提升最终产品的安全性和质量。助滤剂的选择通常可以考虑滤过液的浊度要求、生产能力、产品的回收率、产品的稳定性和纯度等方面的要求，以及去除产品溶液中特别成份的需要。目前血液制品生产常用的助滤剂有硅藻土和珍珠岩等。硅藻土是古。
10、代单细胞硅藻遗骸沉积物，具有质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附及填充等一列优良性能，具有良好的化学稳定性。硅藻土助滤剂的主要优点是具有良好的微孔结构、吸附性能和抗压缩性能，不仅能使被滤液体获得较好的流速比，并且能滤除微细的悬浮物，保证了澄清度。0006血液制品中添加助滤剂的主要目的是提高过滤性能、提高滤液澄清度、降低滤液浊度、吸附热原质、脂类、蛋白酶和变性蛋白，从而保证制品质量。助滤剂通过以下方式达到助滤和吸附的作用00071机械截留作用助滤剂形成的滤饼产生众多的孔隙以及形成孔隙与孔隙之间的间隔层，液体流经滤饼时能够截留其中的悬浮粒子，包括0008A表面过滤作用固液相分离发生在过滤介质的。
11、表面，当液体中悬浮固体颗粒的粒径大于硅藻土/珍珠岩的孔径时被截留在助滤剂表面。0009B深层过滤效应固液相分离发生在过滤介质的内部当液体中悬浮固体颗粒的说明书CN104072601A2/7页4粒径小于硅藻土/珍珠岩的孔径时，比较小的固体颗粒穿过滤饼表面进入介质内部，介质内部曲折的微孔沟道和更细小的孔隙能够截留这些颗粒。00102吸附作用产生吸附作用的主要原因包括范德华力、ZETA电位和离子交换作用，包括0011A液体中的悬浮粒子形成的链团粘附于硅藻土/珍珠岩而被截留；0012B比硅藻土/珍珠岩内部孔径小的悬浮粒子进入到硅藻土/珍珠岩内部表面因相反电荷吸附而被截留。0013虽然硅藻土是血液制品中。
12、常用的助滤剂之一，然而，硅藻土品种繁多，由于不同硅藻土的原料、加工方式等差异，使得不同硅藻土产品在成分含量和性能上产生了较大区别。发明内容0014本发明的目的在于提供一种血液制品中FIIII上清的制备方法。0015具体地，本发明提供了血液制品中FII沉淀的制备方法，它是以血浆为原料，利用低温乙醇法依次制备得到FIIIIII沉淀、FIIII上清，再取FIIII上清经过低温乙醇法分离FII，压滤，取沉淀即得；与现有技术不同的是，本发明分离FII后的压滤过程中，使用PALL50滤板，滤板的用量为510M2/1000L；采用硅藻土为助滤剂，预涂层所用硅藻土为8095G/M2滤板，待滤液中硅藻土的用量为。
13、0203G/L血浆；所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。0016所述待滤液为待压滤的样品，即FIIII上清分离FII后的待压滤样品。0017进一步地，所述硅藻土中，SIO2含量为960962，AL2O3含量为1012、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。0018进一步地，所述硅藻土的比表面积为2223M2/G，优选为2228M2/G。0019进一步地，所述硅藻土的离心湿密度为023024G/CM2，优选为0237G/CM2。0020优选。
14、地，所述硅藻土型号为CELPURE1000。0021为了进一步提高终产品的质量，本发明采用如下FIIII上清制备方法00221FIIIIII沉淀的制备以血浆为原料，经过低温乙醇法分离提取FIIIIII，压滤，取沉淀即得；所述压滤过程中，采用PALL50P滤板，硅藻土为助滤剂，滤板用量为1013M2/1000L血浆，硅藻土用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土；所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020；00232FIIII上清的制备取FIIIIII沉淀，经过低温乙醇法分离提取FIIII，压滤。
15、，取上清即得；所述压滤过程中，采用BECOSTERILPR40滤板，硅藻土为助滤剂，滤板用量为1013M2/1000L血浆，硅藻土用量为89G/L血浆；所述硅藻土中，SIO2含量为960987，AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304，酸溶物质含量为005012，水溶物质含量为015020。0024步骤2中限定滤板和硅藻土用量时，所述的“血浆”即为步骤1中的起始原料。0025其中，本发明制备方法中，各个步骤中的压滤流速和滤板压力为说明书CN104072601A3/7页500260027本发明还提供了上述方法制备的FII沉淀。0028进一步地，所述FII沉淀中球蛋白含量在99以上，优选。
16、为990100。0029本发明还提供了球蛋白的制备方法，它是以上述FII沉淀为原料，精制后，即可得球蛋白。0030本发明研究表明，采用本发明方法制备的FII沉淀，其中球蛋白纯度大幅提高，为提高产品质量提供了保障；同时，采用本发明方法制备的球蛋白，可以提高球蛋白收率，明显增加商品利润，为企业带来的商业价值不可估量。0031另外，本发明方法所得球蛋白成品中，IGA含量明显降低，可降低患者发生IGA抗原抗体不良反应的几率，从而提高产品安全性。0032显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。0033。
17、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明0034图1血浆制品的常规生产流程图0035图2本发明生产流程图0036图3使用C503型硅藻土助滤的现有技术生产流程图0037图4FII沉淀电泳图谱，其中，A为本发明方法所得到的FII沉淀电泳图谱，B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FII沉淀电泳图谱。0038图5FIIIIII沉淀电泳图谱，其中，A为本发明方法所得到的FIIIIII沉淀电泳图谱，B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FIIIII。
18、I沉淀电泳图谱。0039图6FIIII上清液电泳图谱，其中，A为本发明方法所得到的FIIII上清液电泳图谱，B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FIIII上清液电泳图谱。具体实施方式0040本发明所用硅藻土均购自于IMERYSPERLITECHINA,INC。0041实施例1本发明制备方法0042以血浆为原料，采用常规方法依次制备FIIIIII沉淀、FIIII上清，取FIIII上清，经过低温乙醇法对FII进行分离，再使用PALL50滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂，进行压滤，取沉淀即得FII沉淀。其中，硅藻土和滤板的用量为0043说明书CN104072601A4/7页6待。
19、滤液所用硅藻土0203G/L血浆预涂层中所用硅藻土8095G/M2滤板滤板510M2/1000L0044本发明所用硅藻土的检测结果如下00451金属氧化范围使用XRF测定的百分比004600472助熔煅烧品酸溶物质20上限004800493助熔煅烧品水溶物质20上限005000514比表面积005200535离心湿密度00540055本发明中所述FIIII上清的制备方法可以采用现有技术，但更优选使用如下方说明书CN104072601A5/7页7法制备00561FIIIIII沉淀的制备取血浆，经过低温乙醇法对FIIIIII进行分离，再使用PALL50P滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助。
20、滤剂与待滤液混匀，进行压滤，所得沉淀即为FIIIIII沉淀。其中，硅藻土和滤板的用量为0057硅藻土4555G血浆蛋白/1G硅藻土滤板1013M2/1000L血浆00582FIIII上清的制备取FIIIIII沉淀，经过低温乙醇法对FIIII进行分离，再使用BECOSTERILPR40滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，进行压滤，取上清液即得FIIII上清。其中，硅藻土和滤板的用量为0059硅藻土89G/L血浆滤板1013M2/1000L血浆0060采用此处FIIIIII沉淀、FIIII上清的制备方法，与使用C503硅藻土制备的FIIIIII沉淀、FIIII上清进行比较。
21、，可以看出00611上述方法所得FIIIIII沉淀中球蛋白含量约为81图5A，而使用C503硅藻土助滤得到的FIIIIII沉淀中球蛋白含量约为76图5B。对比可知，采用上述优选方法制备的FIIIIII沉淀中球蛋白纯度明显增高了约5个百分点。00622上述方法所得FIIII上清电泳图谱图6A中，球蛋白峰面积约占985，而使用C503硅藻土助滤得到的FIIII上清球蛋白峰面积仅约占932图6B。对比两者可以看出，本发明方法制备的FIIII上清中球蛋白纯度明显增高了5个百分点。0063因此，为了提高终产品的质量，本发明中优选使用上述FIIIIII沉淀、FIIII上清制备方法。0064另外，上述方法的。
22、压滤流速和滤板压力为00650066实施例2本发明制备方法对压滤过程的影响0067以下试验通过过滤流量、压力以及滤液浊度等指标，对本发明与使用C503型硅藻土、PALLECO1000滤板的现有制备方法进行比较滤板用量510M2/1000L血浆，预涂层中C503硅藻土用量110130G/M2滤板，待滤液中C503硅藻土用量0305G/L血浆,，其结果如下00681、过滤流量0069通过常规手段检测滤过速率，其结果如下说明书CN104072601A6/7页80070表1过滤速率对比00710072由表1可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，本发明方法压滤过程中，单位时间内过滤流量相当。00。
23、732、过滤压力0074通过常规手段检测滤过压力，其结果如下0075表2过滤压力对比00760077由表2可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，本发明方法压滤过程中单位面积滤板承受的压力负荷相当。00783、滤液浊度0079通过常规手段检测滤液浊度，其结果如下0080表3滤液浊度对比00810082由表3可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，本发明方法所得滤液浊度值相当。0083实施例3本发明制备方法对产品的影响0084通过电泳技术检测FII沉淀中球蛋白纯度，对本发明与使用C503型硅藻土、ECO1000滤板的现有制备方法进行比较，结果见图4。其中，两种方法除了压滤工艺不同外，。
24、其他操作和原料均相同，在此条件下更能说明两种助滤工艺带来的效果差异。0085由图可知本发明方法所得FII沉淀图谱图4A中，球蛋白峰面积占993；而使用C503硅藻土助滤得到的FII沉淀中球蛋白峰面积仅占979图4B。对比两者可以看出，本发明方法制备的FII沉淀中球蛋白纯度明显提高，在未经终产品精制之前，球蛋白纯度就已经超过了99。0086上述结果表明，本发明方法对FII沉淀中成分的提取分离效果明显优于现有技术。0087实施例4球蛋白的制备方法说明书CN104072601A7/7页90088按照实施例1的方法制备II沉淀，按照常规方法精制后，即得球蛋白。0089取同批次原料，按照本发明方法制备的。
25、球蛋白与使用C503硅藻土传统工艺精制方法相同制备的球蛋白产品进行比较，其结果如下00901球蛋白收率和纯度0091表4试验批次白蛋白、球蛋白收率及纯度0092球蛋白收率N3球蛋白纯度N3本发明工艺所得产品收率和纯度平均值546G/L血浆9973使用C503硅藻土传统工艺得到的产品收率和纯度平均值50G/LG/L血浆9920093由上表可知，相对于使用C503硅藻土的传统工艺而言，利用本发明方法制备的球蛋白终产品，其球蛋白收率和纯度均有一定提高。0094目前球蛋白市场价约为200元/G，如本发明所述，其收率提高约05G/L，以企业平均每次生产量约1000L血浆计算，每次生产可增收500G球蛋白。
26、，按照市场价值预估，每次生产可提高利润约10万元，其商业价值极其显著。00952球蛋白成品中IGA含量0096表6球蛋白中IGA含量0097传统工艺球蛋白成品IGA含量G/ML本发明方法球蛋白成品IGA含量G/ML1057957519236106859167458875588165611894665197279372平均值918平均值6170098由上表可知，本发明方法所得球蛋白成品中，IGA含量明显降低，可降低患者发生IGA抗原抗体不良反应的几率，从而提高产品安全性。说明书CN104072601A1/6页10图1说明书附图CN104072601A102/6页11图2说明书附图CN104072601A113/6页12图3说明书附图CN104072601A124/6页13图4说明书附图CN104072601A135/6页14图5说明书附图CN104072601A146/6页15图6说明书附图CN104072601A15。