一种小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410148903.4	申请日：	2014.04.14
公开号：	CN104059141A	公开日：	2014.09.24
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/47申请日:20140414\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/47; C12N15/12; C12N15/63; C12N5/10; C12N15/85; G01N33/68	主分类号：	C07K14/47
申请人：	江苏省原子医学研究所
发明人：	彭莹; 邓黎莉; 吴郁; 陈全成; 丁月娣; 束婷婷; 付强
地址：	214063 江苏省无锡市钱荣路20号
优先权：
专利代理机构：	北京三聚阳光知识产权代理有限公司 11250	代理人：	赵敏
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内容摘要

本发明所述的小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用中，提供了一种小鼠RANKL突变体、小鼠RANKL突变体的表达载体的构建方法以及所述小鼠RANKL突变体的表达载体转染入细胞的制备方法，还提供了表达小鼠RANKL突变体的表达载体的细胞和表达系统，解决了现有技术中不能方便、高效的对小鼠RANKL进行研究的问题。

权利要求书

1.  一种小鼠RANKL突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ.ID NO：1、SEQ.ID NO：2、SEQ.ID NO：3、SEQ.ID NO：4、SEQ.ID NO：5、SEQ.IDNO：6、SEQ.ID NO：7、SEQ.ID NO：8、SEQ.ID NO：9、SEQ.ID NO：10、SEQ.ID NO：11、SEQ.ID NO：12、SEQ.ID NO：13、SEQ.ID NO：14或SEQ.ID NO：15中任一所示。

2.  一种编码权利要求1所述突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17、SEQ.ID NO：18、SEQ.ID NO：19、SEQ.ID NO：20、SEQ.ID NO：21、SEQ.ID NO：22、SEQ.ID NO：23、SEQ.IDNO：24、SEQ.ID NO：25、SEQ.ID NO：26、SEQ.ID NO：27、SEQ.ID NO：28、SEQ.ID NO：29或SEQ.ID NO：30中任一所示。

3.  一种含有权利要求2所述的基因的表达载体。

4.  根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为带有EGFP标签的载体。

5.  根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是通过将权利要求2所述的基因克隆至pEGFP-C1载体中的MCS区域获得的。

6.  一种含有权利要求3-5任一所述的表达载体的重组细胞，其特征在于，由权利要求3-5任一所述的表达载体转染的HEK293细胞。

7.  一种构建权利要求6所述重组细胞的方法，其特征在于，取权利要求3-5任一所述的表达载体转染入HEK293细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的细胞。

8.  一种如权利要求6所述的重组细胞在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。

9.  一种重组细胞表达系统，其特征在于，所述表达系统为分别将权利要求3-5任一所述的各个表达载体转染入细胞得到的细胞总和。

10.  一种如权利要求9所述的表达系统在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。

说明书

一种小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用
技术领域
本发明属于微生物学、分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种具有生物活性的不同半胱氨酸位点（Cys）突变的小鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）的突变体及其载体的构建、表达及应用。
背景技术
骨骼具有为了自身的形态变化和维持血钙浓度而重复形成和吸收、进行重建的特征。正常的骨骼通过由成骨细胞、骨细胞介导的骨形成及由破骨细胞介导的骨吸收而处于动态平衡状态。骨骼动态平衡的维持是一个多因素、多环节的复杂调控过程，而成骨细胞、骨细胞与破骨细胞间的信号耦联是核心。这种信号耦联是由一系列的分泌性蛋白在起着关键的调控作用，而其中最为重要的便是到目前为止研究最为透彻的核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κBligand，RANKL)。
在骨骼系统中，RANKL主要由成骨细胞、骨细胞表达和分泌，它通过与破骨细胞表面的RANK蛋白（即RANKL的受体）相互作用进而调节破骨细胞的分化成熟。同时，成骨细胞还会分泌骨保护素蛋白(OPG)，它通过与RANK蛋白竞争结合RANKL，从而起到抑制破骨细胞分化成熟的作用。一系列研究已经充分表明，RANKL/RANK/OPG信号体系在成骨细胞-破骨细胞耦联及骨骼代谢平衡中具有核心作用。但是，相较于已被充分阐释的RANKL-RANK相互作用后导致破骨细胞分化成熟的信号机制，RANKL蛋白在成骨细胞内的定位情况及其影响机制目前尚不清楚。
RANKL蛋白在体内存在两种形式：全长RANKL及可溶性RANKL（soluble RANKL，sRANKL）。其中，小鼠RANKL蛋白全长316个氨基酸，人RANKL蛋白全长317个氨基酸，两者同源性达84%。而sRANKL则是分泌至细胞外的RANKL，它由一系列的蛋白酶如TACE、ADAM10和 MMP-14等对全长RANKL进行剪切得到，剪切位点在小鼠RANKL的139Phe，在人RANKL的140Ile。RANKL蛋白具有典型的TNF结构域，与TNFalpha、CD40ligand、Apo2L（TRAIL）及Fas ligand（FasL）等同属TNF家族。此外，全长RANKL还包括茎状结构区、一段短片段的疏水性跨膜区和位于RANKL氨基端1-48的低复杂性氨基酸序列。TNF结构域是RANKL-RANK及RANKL-OPG的相互作用区，是调控破骨细胞分化成熟的关键部位；225Glu、222Arg、299Asp氨基酸对于RANKL-RANK的相互作用是关键的。研究发现，RANKL-OPG的相互作用对于RANKL在细胞（Hela细胞、原代成骨细胞和骨细胞）内的定位至关重要，OPG使RANKL定位于细胞溶酶体中，而CRD结构域（RANKL-OPG相互作用的关键区域）缺失的OPG蛋白则不具有这种作用。但是否有其它因素影响RANKL在成骨细胞内的定位及分泌还有待于进一步的研究。
发明内容
为此，本发明所要解决的问题在于提供一种小鼠RANKL突变体以及表达该突变体的表达载体和表达系统，进而便于更准确、方便、高效的研究不同Cys位点突变对小鼠RANKL蛋白表达及定位的影响。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠RANKL突变体，其氨基酸序列如SEQ.ID NO：1、SEQ.ID NO：2、SEQ.ID NO：3、SEQ.ID NO：4、SEQ.ID NO：5、SEQ.ID NO：6、SEQ.ID NO：7、SEQ.ID NO：8、SEQ.IDNO：9、SEQ.ID NO：10、SEQ.ID NO：11、SEQ.ID NO：12、SEQ.ID NO：13、SEQ.ID NO：14或SEQ.ID NO：15中任一所示。
本发明还提供了一种编码上述小鼠RANKL突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17、SEQ.ID NO：18、SEQ.ID NO：19、SEQ.ID NO：20、SEQ.ID NO：21、SEQ.ID NO：22、SEQ.ID NO：23、SEQ.ID NO：24、SEQ.ID NO：25、SEQ.ID NO：26、SEQ.ID NO：27、SEQ.IDNO：28、SEQ.ID NO：29或SEQ.ID NO：30中任一所示。
本发明提供了一种含有编码上述小鼠RANKL突变体的基因的表达载体。
所述的表达载体为带有EGFP标签的载体。所述的EGFP标签（增强型绿色荧光蛋白Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP)是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点。EGFP标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已被广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。结合荧光显微镜，EGFP表达系统可用于检测基因表达效率、和目的蛋白融合表达以检测目的蛋白的表达和分布以及细胞示踪标记等研究。相应的EGFP标签抗体不仅可以检测EGFP蛋白，也可以检测和EGFP融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测EGFP融合表达蛋白等。
所述表达载体是通过将编码上述小鼠RANKL突变体的基因克隆至pEGFP-C1载体中的MCS区域获得的。
本发明提供了一种含有所述的表达载体的重组细胞，所述重组细胞为由上述的表达载体转染的HEK293细胞。所述HEK293细胞株来源于人胚肾上皮细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，由于容易转染且容易培养，常被用于转染试验，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
本发明提供了一种构建上述重组细胞的方法，取上述的表达载体转染入HEK293细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的细胞。
本发明提供了一种所述的重组细胞在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。
本发明提供了一种重组细胞表达系统，所述表达系统为分别将上述的各个表达载体转染入细胞得到的细胞总和。
本发明提供了一种所述的表达系统在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
（1）本发明所述的小鼠RANKL突变体，提供了一种将小鼠RANKL 蛋白中位于不同位点的半胱氨酸（Cys）位点选择性突变为甘氨酸(Gly）的小鼠RANKL突变体，从而可以方便的、高效的研究不同半胱氨酸（Cys）位点突变对小鼠RANKL蛋白表达及定位的影响；
（2）本发明表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的细胞可表达产生小鼠全长RANKL及小鼠可溶性RANKL蛋白，且小鼠全长RANKL的N端融合了EGFP标签，表达产生的全长RANKL发绿色荧光，可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下直观检测不同Cys位点突变了的小鼠RANKL蛋白的表达及亚细胞的定位，从而可以方便、高效的研究不同Cys位点突变对小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；
（3）本发明所述的表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的表达系统，该系统为具有生物活性的、带有EGFP标签、不同半胱氨酸位点（Cys）突变的小鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）的表达系统，通过该表达系统可以进一步研究不同Cys位点突变对小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；
（4）本发明所述的小鼠RANKL突变体的表达载体的构建方法可采用现有技术的常规方法进行处理，步骤简单易于操作，耗时短，可以快速的获得小鼠RANKL突变体的表达载体；
（5）本发明所述的带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体可以通过现有技术的常规方法进行稳定的表达，进而方便研究小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征影响。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为实施例1的PCR克隆获得小鼠RANKL基因片段的电泳结果；
图2为实施例1的重组pEGFP-RANKL载体的限制性内切酶鉴定结果；
图3为实施例2的使用多位点定点突变方法获得的8种小鼠RANKL 突变体的表达载体的限制性内切酶鉴定结果；
图4为实施例2的使用单位点定点突变方法获得的7种小鼠RANKL突变体的表达载体的限制性内切酶鉴定结果；
图5为实施例3的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞的RT-PCR鉴定结果；
图6为实施例3的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞的荧光显微镜观察拍照结果；
图7为实施例4的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞产生可溶性RANKL蛋白的ELISA实验结果；
图8为实施例4的稳定表达EGFP标签及不同Cys位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞诱导破骨细胞分化的实验结果。
具体实施方式
本发明的下述实施例中所用的试剂、载体、蛋白、细胞等均为市售产品，不同厂家、不同型号的下述试剂、载体、蛋白、细胞均可实现本发明的目的，效果并无明显差异，本发明的下述各实施例仅以如下型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白、细胞为代表，进行技术效果的阐述，并不局限于以下所列举的型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白或细胞。
质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、核酸纯化试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；
pMD 19-T Simple Vector、TaKaRa LA Taq、TaKaRa MutanBEST Kit、TRACP染色试剂盒、T4DNA连接酶、各种限制性内切酶以及E.coliCompetent CellsJM109均购自TaKaRa公司；
1Kb plus DNA Ladder、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；
pEGFP-C1载体购自Clontech公司；
UAMS-32、HEK293、RAW264.7细胞购自美国ATCC公司；
胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产品；
G418购自Sigma公司；
α-MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶购自GIBCO公司；
总RNA抽提试剂Beyozol购自碧云天公司；
cDNA反转录试剂盒购自美国Applied biosystems公司；
引物合成及DNA测序服务均由上海生工生物工程有限公司提供；
多位点定点突变试剂盒QuikChange Lightning Multi Site-DirectedMutagenesis Kit（210515）购自Agilent公司；
小鼠RANKL定量检测ELISA试剂盒为美国R&D公司产品。
本发明下述实施例中所述的Kan+LB平板培养基为按照现有技术中常规方法制备，以本发明下述各实施例而言，所述Kan+LB平板培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂粉，30μg/ml卡那霉素。
本发明下述实施例中所述的细胞培养条件，如无特别说明，所有细胞均在37℃、5%CO₂条件下培养，所用培养基组成均为：90%DMEM，10%FBS，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素。
实施例1小鼠pEGFP-RANKL载体构建
培养小鼠成骨细胞样细胞UAMS-32，所用培养基组成为：90%α-MEM，10%FBS，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素。将UAMS-32细胞铺60mm培养皿，细胞长满后提取总RNA，然后反转录成cDNA，以此cDNA为模板，进行PCR反应，所用引物为RANKLFor：
5'-ATCTCGAGCTATGCGCCGGG-3'和RANKLRev：
5'-TTCGAAGCTTGTCAGTCTATGTCCTG-3'，上述带下划线碱基分别为引入的XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶的识别位点。
所述PCR反应体系为：2×GCbuffer Ⅰ 25μL，cDNA template 1μL，primers（10μM）各1μL，dNTP mix（2.5mM）8μL，TaKaRa LA Taq 0.5μL，double-distilled H₂O补至50μL；所述PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环，72℃延伸7min；所述PCR反应结束后，对上述步骤获得的PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，结果表明扩增获得了长度约为966bp的基因片段（泳道1为1Kb plus DNA Ladder，泳道2为PCR结果，箭头所示为长度约为966bp的基因片段），切胶回收并纯化该基因片段，然后使用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切该基因片段，同时使用限制性内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ双酶切pEGFP-C1载体质粒，使用核酸纯化试剂盒分别对上述酶切的基因片段和质粒载体进行纯化后，利用T4连接酶连接上述纯化后的基因片段和质粒载体，将连接产物转化JM109感受态细胞，挑取克隆，提质粒，对质粒用Xho Ⅰ和HindⅢ进行双酶切检验，电泳结果见图2，将酶切结果为含有966bp和4.7kb两条片段的质粒（见图2第3、5、7泳道，泳道1为1Kb plusDNA Ladder）进行测序验证，结果表明获得了含有正确的小鼠RANKL基因的重组载体pEGFP-RANKL。
实施例2不同Cys位点突变的小鼠RANKL基因及其表达载体的获得
利用Agilent多位点定点突变试剂盒对小鼠RANKL基因片段的不同Cys位点进行定点突变，将RANKL基因片段中Cys的密码子序列tgc置换成Gly的密码子序列ggc，所使用的定点突变引物使用Agilent公司定点突变引物设计软件（https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp）设计获得（见表1）：
表1多位点定点突变引物

以上述实施例1制备的pEGFP-RANKL质粒为模板进行PCR反应，所述PCR反应体系为：10×QuikChange Lightning Multi reaction buffer 2.5μL，QuikSolution 0.5μL，ds-DNA template 100ng，mutagenic primers各50ng，dNTP mix 1μL，QuikChange Lightning Multi enzyme blend 1μL，double-distilledH₂O补至25μL；所述PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃20s，55℃30s，65℃30s/kb，30个循环，65℃延伸5min；所述PCR反应结束后，使用足量Dpn Ⅰ酶将PCR产物在37℃处理1h，以去除模板质粒，将所述Dpn Ⅰ酶处理后的PCR反应产物转化入JM109感受态细胞，所述转化的JM109感受态细胞作为突变组，同时做两个对照组：①将实施例1制备的pEGFP-RANKL质粒转化入JM109感受态细胞；②另取实施例1制备的pEGFP-RANKL质粒，使用足量DpnⅠ酶将其在37℃处理1h，然后将Dpn Ⅰ酶处理后的pEGFP-RANKL转化入JM109感受态细胞。取上述三组转化的JM109感受态细胞涂布至Kan+LB平板，于37℃培养16小时后，观察发现，突变组长出40个单菌落，对照组①长出许多单菌落，对照组②无菌落产生，挑取突变组的单菌落并提质粒，经DNA测序确认获得了小鼠RANKL的8种Cys突变序列，分别如SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17、SEQ.ID NO：20、SEQ.ID NO：25、SEQ.ID NO：26、SEQ.ID NO：27、SEQ.ID NO：28和SEQ.ID NO：30所示，并按照所述Cys在RANKL蛋白中的位点位置依次记为RANKL-C63G、RANKL-C87G、RANKL-C63/87G、RANKL-C115/220G、RANKL-C87/115/220G、RANKL-C63/115/220G、RANKL-C63/87/220G和RANKL-C63/87/115/220G。
使用限制性内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ双酶切上述8种含有不同Cys突变的小鼠RANKL序列的质粒，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收约966bp的片段，利用T4连接酶连接经Xho Ⅰ和HindⅢ双酶切后的线性pEGFP-C1质粒约4.7kb的片段，转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，提质粒，对质粒用Xho Ⅰ和HindⅢ进行酶切验证，电泳结果见图3，双酶切获得大小分别约为4.7kb和966bp的片段，这表明获得了8个突变质粒，即不同Cys位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体，依次记为：pEGFP-RANKL-C63G、pEGFP-RANKL-C87G、pEGFP-RANKL-C63/87G、pEGFP-RANKL-C115/220G、pEGFP-RANKL-C87/115/220G、pEGFP-RANKL-C63/115/220G、pEGFP-RANKL-C63/87/220G、pEGFP-RANKL-C63/87/115/220G。
然后，使用TaKaRa MutanBEST Kit对上述步骤获得的8种小鼠RANKL突变序列再次进行定点突变，从而获得另外7种小鼠RANKL突变体的表达载体，所使用的定点突变引物、PCR模板及目的产物见表2：
表2单位点定点突变引物、PCR模板及目的产物

以上述制备的小鼠RANKL突变体的表达载体为模板进行PCR反应，单位点定点突变的PCR反应体系为：2×GC buffer Ⅰ 25μL，ds-DNA template0.1μL，primers（10μM）各1μL，dNTPmix（2.5mM）8μL，TaKaRa LA Taq0.5μL，double-distilled H₂O补至50μL；所述PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃40s，72℃10min，30个循环，72℃延伸15min；所述PCR反应结束后，对PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的DNA片段，然后将回收产物用DpnⅠ酶在37℃处理数小时，使用核酸纯化试剂盒回收上述酶切产物，按照TaKaRa MutanBEST Kit说明书对回收的酶切产物进行Blunting Kination反应，然后用T4连接酶连接环化，将所得的连接产物转化入JM109感受态细胞并涂布至Kan+LB平板，挑取单菌落并提取质粒，经DNA测序确认得到了另外7种小鼠RANKL的Cys突变序列，分别如SEQ.ID NO：18、SEQ.ID NO：19、SEQ.ID NO：21、SEQ.ID NO：22、SEQ.ID NO：23、SEQ.ID NO：24和SEQ.ID NO：29所示，并按照所述Cys在RANKL蛋白中的位点位置依次记为：RANKL-C115G、RANKL-C220G、RANKL-C63/115G、RANKL-C63/220G、RANKL-C87/115G、RANKL-C87/220G、RANKL-C63/87/115G。
使用限制性内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ双酶切上述步骤获得的7种含有不同Cys突变RANKL序列的质粒，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收约966bp的片段，利用T4连接酶连接经Xho Ⅰ和HindⅢ双酶切后的线性pEGFP-C1质粒约4.7kb的片段，转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，提质粒，对质粒用Xho Ⅰ和HindⅢ进行酶切验证，电泳结果见图4，双酶切获得大小分别约为4.7kb和966bp的片段，这表明获得了7个突变质粒，即不同Cys位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体，依次记为：pEGFP-RANKL-C220G、pEGFP-RANKL-C63/220G、pEGFP-RANKL-C87/220G、pEGFP-RANKL-C115G、pEGFP-RANKL-C63/115G、pEGFP-RANKL-C87/115G、pEGFP-RANKL-C63/87/115G。
实施例3含有所述表达载体的重组细胞以及表达系统的构建
所述重组细胞通过如下方法构建：
转染和筛选：分别取pEGFP-C1质粒、实施例1制备的pEGFP-RANKL质粒及实施例2制备的小鼠RANKL突变体表达载体，用限制性内切酶ApaLⅠ消化上述质粒使之线性化，随后将HEK293细胞消化铺6孔板，每孔50万个细胞，培养至第二天，使用Lipofectamine2000将2.5μg线性化质粒转染所述HEK293细胞，培养24h后，将所述细胞消化至100mm培养皿，待细胞贴壁后，换液，并加入终浓度为400μg/mL的G418，所述转染的HEK293为实验组，同时设对照组作为筛选对照，该组为未被转染的HEK293，与实验组相同也加入G418浓度为400μg/mL的筛选培养基，然后将所述实验组和对照组按每3天更换一次所述筛选培养基进行培养，14天后，所述对照组的HEK293细胞已经全部死亡，而实验组出现抗性克隆，改用G418浓度为200μg/mL的培养基继续培养，待细胞大量扩增后，将大部分细胞冻存备用，即得所述重组细胞，其余部分细胞继续培养，用于进一步的鉴定实验。
RT-PCR鉴定：将上述步骤获得的重组细胞铺6孔板，待细胞长满后提取总RNA，然后反转录成cDNA，以此cDNA为模板，进行PCR反应，所用引物为实施例1中的RANKL For和RANKL Rev，反应体系和反应条件也同实施例1，反应结束后，对PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5，除pEGFP-C1转染组（2号泳道）未获得任何条带外，其余各组均扩增获得了长度约为966bp的基因片段（3-17号泳道）。
荧光显微镜观察鉴定：将稳定表达带有EGFP标签Cys位点突变的小鼠RANKL突变体的HEK293细胞铺48孔板，每孔约1万个细胞，细胞贴壁后即可在荧光显微镜下观察拍照，拍照结果见图6，1号样品为HEK293细胞，2号样品为转染了pEGFP-C1质粒的HEK293细胞，3号样品为转染了pEGFP-RANKL质粒的HEK293细胞，4-18号样品为转染了实施例2制备的15种突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293细胞，荧光显微镜观察结果表明，各组细胞均成功表达了目的蛋白，并发绿色荧光，因此可以用于进一步的蛋白定位等实验。
按照上述步骤转染了上述实施例2制备的表达载体后获得的重组细胞所表达的小鼠RANKL突变体的氨基酸序列如SEQ.ID NO：1、SEQ.ID NO：2、SEQ.ID NO：3、SEQ.ID NO：4、SEQ.ID NO：5、SEQ.ID NO：6、SEQ.IDNO：7、SEQ.ID NO：8、SEQ.ID NO：9、SEQ.ID NO：10、SEQ.ID NO：11、SEQ.ID NO：12、SEQ.ID NO：13、SEQ.ID NO：14或SEQ.ID NO：15中任一所示。
所述重组细胞表达系统构建即为按照上述方法分别将转染了实施例2制备的15种小鼠RANKL突变体的表达载体后获得的重组细胞的总和。
实施例4重组EGFP标签Cys位点突变小鼠RANKL的活性检测
本实施例以HEK293、HEK293/pEGFP-RANKL、HEK293/pEGFP-RANKL-C63/87/115/220G、HEK293/pEGFP-RANKL-C63/87G、HEK293/pEGFP-RANKL-C63G、HEK293/pEGFP-RANKL-C87G等6组细胞为研究对象，进行以下两个实验：
①将各组细胞分别铺48孔板，每孔5万个细胞，每孔250μL培养基，每24h进行半量换液一次，收集每次换液时吸出的大约125μL培养基，于-80℃保存，待收集了24h、48h、72h、96h这四个时间点的培养基之后，将上述得到的所有培养基于冰上融化，然后离心，取上清，使用小鼠RANKL定量检测ELISA试剂盒检测上述步骤得到的上清中小鼠RANKL的浓度，结果如图7所示，转染了带有EGFP标签的小鼠RANKL载体以及带有EGFP标签Cys位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293细胞均可产生小鼠可溶性RANKL蛋白，但转染带有EGFP标签Cys位点突变的小鼠RANKL突变体表达载体的HEK293细胞所产生的小鼠可溶性RANKL蛋白的量有所降低。
②将各组细胞分别铺48孔板，每孔5千个细胞，同时每孔铺5千个RAW264.7细胞，每24h进行半量换液一次，6天后，使用TRACP试剂盒染色，观察并计数破骨细胞形成的情况，结果如图8所示，转染了带有EGFP标签小鼠RANKL载体以及带有EGFP标签Cys位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293细胞均具有诱导破骨细胞形成的活性，但转染了63位Cys突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293诱导破骨细胞形成的活性降低约40%。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

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1、10申请公布号CN104059141A43申请公布日20140924CN104059141A21申请号201410148903422申请日20140414C07K14/47200601C12N15/12200601C12N15/63200601C12N5/10200601C12N15/85200601G01N33/6820060171申请人江苏省原子医学研究所地址214063江苏省无锡市钱荣路20号72发明人彭莹邓黎莉吴郁陈全成丁月娣束婷婷付强74专利代理机构北京三聚阳光知识产权代理有限公司11250代理人赵敏54发明名称一种小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用57摘要本发明所述。

2、的小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用中，提供了一种小鼠RANKL突变体、小鼠RANKL突变体的表达载体的构建方法以及所述小鼠RANKL突变体的表达载体转染入细胞的制备方法，还提供了表达小鼠RANKL突变体的表达载体的细胞和表达系统，解决了现有技术中不能方便、高效的对小鼠RANKL进行研究的问题。51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表30页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表30页附图3页10申请公布号CN104059141ACN104059141A1/1页21一种小鼠RANKL突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN。

3、O1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14或SEQIDNO15中任一所示。2一种编码权利要求1所述突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO2。

4、8、SEQIDNO29或SEQIDNO30中任一所示。3一种含有权利要求2所述的基因的表达载体。4根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为带有EGFP标签的载体。5根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是通过将权利要求2所述的基因克隆至PEGFPC1载体中的MCS区域获得的。6一种含有权利要求35任一所述的表达载体的重组细胞，其特征在于，由权利要求35任一所述的表达载体转染的HEK293细胞。7一种构建权利要求6所述重组细胞的方法，其特征在于，取权利要求35任一所述的表达载体转染入HEK293细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突。

5、变体的细胞。8一种如权利要求6所述的重组细胞在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。9一种重组细胞表达系统，其特征在于，所述表达系统为分别将权利要求35任一所述的各个表达载体转染入细胞得到的细胞总和。10一种如权利要求9所述的表达系统在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。权利要求书CN104059141A1/9页3一种小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用技术领域0001本发明属于微生物学、分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种具有生物活性的不同半胱氨酸位点（CYS）突变的小鼠核因子B受体活化因子配基（RANKL）的突变体及其载体的构建、表达及应用。

6、。背景技术0002骨骼具有为了自身的形态变化和维持血钙浓度而重复形成和吸收、进行重建的特征。正常的骨骼通过由成骨细胞、骨细胞介导的骨形成及由破骨细胞介导的骨吸收而处于动态平衡状态。骨骼动态平衡的维持是一个多因素、多环节的复杂调控过程，而成骨细胞、骨细胞与破骨细胞间的信号耦联是核心。这种信号耦联是由一系列的分泌性蛋白在起着关键的调控作用，而其中最为重要的便是到目前为止研究最为透彻的核因子B受体活化因子配基RECEPTORACTIVATOROFNFBLIGAND，RANKL。0003在骨骼系统中，RANKL主要由成骨细胞、骨细胞表达和分泌，它通过与破骨细胞表面的RANK蛋白（即RANKL的受体）相。

7、互作用进而调节破骨细胞的分化成熟。同时，成骨细胞还会分泌骨保护素蛋白OPG，它通过与RANK蛋白竞争结合RANKL，从而起到抑制破骨细胞分化成熟的作用。一系列研究已经充分表明，RANKL/RANK/OPG信号体系在成骨细胞破骨细胞耦联及骨骼代谢平衡中具有核心作用。但是，相较于已被充分阐释的RANKLRANK相互作用后导致破骨细胞分化成熟的信号机制，RANKL蛋白在成骨细胞内的定位情况及其影响机制目前尚不清楚。0004RANKL蛋白在体内存在两种形式全长RANKL及可溶性RANKL（SOLUBLERANKL，SRANKL）。其中，小鼠RANKL蛋白全长316个氨基酸，人RANKL蛋白全长317个。

8、氨基酸，两者同源性达84。而SRANKL则是分泌至细胞外的RANKL，它由一系列的蛋白酶如TACE、ADAM10和MMP14等对全长RANKL进行剪切得到，剪切位点在小鼠RANKL的139PHE，在人RANKL的140ILE。RANKL蛋白具有典型的TNF结构域，与TNFALPHA、CD40LIGAND、APO2L（TRAIL）及FASLIGAND（FASL）等同属TNF家族。此外，全长RANKL还包括茎状结构区、一段短片段的疏水性跨膜区和位于RANKL氨基端148的低复杂性氨基酸序列。TNF结构域是RANKLRANK及RANKLOPG的相互作用区，是调控破骨细胞分化成熟的关键部位；225GL。

9、U、222ARG、299ASP氨基酸对于RANKLRANK的相互作用是关键的。研究发现，RANKLOPG的相互作用对于RANKL在细胞（HELA细胞、原代成骨细胞和骨细胞）内的定位至关重要，OPG使RANKL定位于细胞溶酶体中，而CRD结构域（RANKLOPG相互作用的关键区域）缺失的OPG蛋白则不具有这种作用。但是否有其它因素影响RANKL在成骨细胞内的定位及分泌还有待于进一步的研究。发明内容0005为此，本发明所要解决的问题在于提供一种小鼠RANKL突变体以及表达该突变体的表达载体和表达系统，进而便于更准确、方便、高效的研究不同CYS位点突变对小鼠RANKL蛋白表达及定位的影响。说明书CN。

10、104059141A2/9页40006为解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠RANKL突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14或SEQIDNO15中任一所示。0007本发明还提供了一种编码上述小鼠RANKL突变体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21、S。

11、EQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO29或SEQIDNO30中任一所示。0008本发明提供了一种含有编码上述小鼠RANKL突变体的基因的表达载体。0009所述的表达载体为带有EGFP标签的载体。所述的EGFP标签（增强型绿色荧光蛋白ENHANCEDGREENFLUORECENCEPROTEIN，EGFP是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点。EGFP标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已被广泛应用于各种细胞类型，包括细菌。

12、、酵母和哺乳动物细胞等。结合荧光显微镜，EGFP表达系统可用于检测基因表达效率、和目的蛋白融合表达以检测目的蛋白的表达和分布以及细胞示踪标记等研究。相应的EGFP标签抗体不仅可以检测EGFP蛋白，也可以检测和EGFP融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测EGFP融合表达蛋白等。0010所述表达载体是通过将编码上述小鼠RANKL突变体的基因克隆至PEGFPC1载体中的MCS区域获得的。0011本发明提供了一种含有所述的表达载体的重组细胞，所述重组细胞为由上述的表达载体转染的HEK293细胞。所述HEK293细胞株来源于人胚肾上皮细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，由于容易。

13、转染且容易培养，常被用于转染试验，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。0012本发明提供了一种构建上述重组细胞的方法，取上述的表达载体转染入HEK293细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的细胞。0013本发明提供了一种所述的重组细胞在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。0014本发明提供了一种重组细胞表达系统，所述表达系统为分别将上述的各个表达载体转染入细胞得到的细胞总和。0015本发明提供了一种所述的表达系统在细胞染色、荧光观察、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应用。0016本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点0017（1）本发明所述。

14、的小鼠RANKL突变体，提供了一种将小鼠RANKL蛋白中位于不同位点的半胱氨酸（CYS）位点选择性突变为甘氨酸GLY）的小鼠RANKL突变体，从而可以方便的、高效的研究不同半胱氨酸（CYS）位点突变对小鼠RANKL蛋白表达及定位的影响；0018（2）本发明表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的细胞可表达产生小鼠全长RANKL及小鼠可溶性RANKL蛋白，且小鼠全长RANKL的N端融合了EGFP标签，表达产生的全长RANKL发绿色荧光，可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下直观检测不同CYS位点突变了的小鼠RANKL蛋白的表达及亚细胞的定位，从而可以方便、高效的研究不同CYS位点突变对小说明书CN1。

15、04059141A3/9页5鼠RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；0019（3）本发明所述的表达带有EGFP标签的小鼠RANKL突变体的表达系统，该系统为具有生物活性的、带有EGFP标签、不同半胱氨酸位点（CYS）突变的小鼠核因子B受体活化因子配基（RANKL）的表达系统，通过该表达系统可以进一步研究不同CYS位点突变对小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；0020（4）本发明所述的小鼠RANKL突变体的表达载体的构建方法可采用现有技术的常规方法进行处理，步骤简单易于操作，耗时短，可以快速的获得小鼠RANKL突变体的表达载体；0021（5）本发明所述的带有EGFP标签的小鼠RANKL突变。

16、体可以通过现有技术的常规方法进行稳定的表达，进而方便研究小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征影响。附图说明0022为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中0023图1为实施例1的PCR克隆获得小鼠RANKL基因片段的电泳结果；0024图2为实施例1的重组PEGFPRANKL载体的限制性内切酶鉴定结果；0025图3为实施例2的使用多位点定点突变方法获得的8种小鼠RANKL突变体的表达载体的限制性内切酶鉴定结果；0026图4为实施例2的使用单位点定点突变方法获得的7种小鼠RANKL突变体的表达载体的限制性内切酶鉴定结果；0027图5。

17、为实施例3的稳定表达EGFP标签及不同CYS位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞的RTPCR鉴定结果；0028图6为实施例3的稳定表达EGFP标签及不同CYS位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞的荧光显微镜观察拍照结果；0029图7为实施例4的稳定表达EGFP标签及不同CYS位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞产生可溶性RANKL蛋白的ELISA实验结果；0030图8为实施例4的稳定表达EGFP标签及不同CYS位点突变小鼠RANKL突变体的重组细胞诱导破骨细胞分化的实验结果。具体实施方式0031本发明的下述实施例中所用的试剂、载体、蛋白、细胞等均为市售产品，不同厂家、不同型号的下述试剂、。

18、载体、蛋白、细胞均可实现本发明的目的，效果并无明显差异，本发明的下述各实施例仅以如下型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白、细胞为代表，进行技术效果的阐述，并不局限于以下所列举的型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白或细胞。0032质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、核酸纯化试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；0033PMD19TSIMPLEVECTOR、TAKARALATAQ、TAKARAMUTANBESTKIT、TRACP染色试剂盒、T4DNA连接酶、各种限制性内切酶以及ECOLICOMPETENTCELLSJM109均购自TAKARA公司；说明书CN104059141A4/9页600341KBP。

19、LUSDNALADDER、LIPOFECTAMINE2000购自INVITROGEN公司；0035PEGFPC1载体购自CLONTECH公司；0036UAMS32、HEK293、RAW2647细胞购自美国ATCC公司；0037胰蛋白胨和酵母提取物为英国OXOID公司产品；0038G418购自SIGMA公司；0039MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶购自GIBCO公司；0040总RNA抽提试剂BEYOZOL购自碧云天公司；0041CDNA反转录试剂盒购自美国APPLIEDBIOSYSTEMS公司；0042引物合成及DNA测序服务均由上海生工生物工程有限公司提供；0043多位点。

20、定点突变试剂盒QUIKCHANGELIGHTNINGMULTISITEDIRECTEDMUTAGENESISKIT（210515）购自AGILENT公司；0044小鼠RANKL定量检测ELISA试剂盒为美国RD公司产品。0045本发明下述实施例中所述的KANLB平板培养基为按照现有技术中常规方法制备，以本发明下述各实施例而言，所述KANLB平板培养基组成为10G/L胰蛋白胨，5G/L酵母提取物，10G/L氯化钠，20G/L琼脂粉，30G/ML卡那霉素。0046本发明下述实施例中所述的细胞培养条件，如无特别说明，所有细胞均在37、5CO2条件下培养，所用培养基组成均为90DMEM，10FBS，1。

21、00U/ML青霉素，01MG/ML链霉素。0047实施例1小鼠PEGFPRANKL载体构建0048培养小鼠成骨细胞样细胞UAMS32，所用培养基组成为90MEM，10FBS，100U/ML青霉素，01MG/ML链霉素。将UAMS32细胞铺60MM培养皿，细胞长满后提取总RNA，然后反转录成CDNA，以此CDNA为模板，进行PCR反应，所用引物为RANKLFOR00495ATCTCGAGCTATGCGCCGGG3和RANKLREV00505TTCGAAGCTTGTCAGTCTATGTCCTG3，上述带下划线碱基分别为引入的XHO和HIND限制性内切酶的识别位点。0051所述PCR反应体系为2GC。

22、BUFFER25L，CDNATEMPLATE1L，PRIMERS（10M）各1L，DNTPMIX（25MM）8L，TAKARALATAQ05L，DOUBLEDISTILLEDH2O补至50L；所述PCR反应条件为94预变性5MIN，9430S，5530S，722MIN，30个循环，72延伸7MIN；所述PCR反应结束后，对上述步骤获得的PCR反应液进行1琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，结果表明扩增获得了长度约为966BP的基因片段（泳道1为1KBPLUSDNALADDER，泳道2为PCR结果，箭头所示为长度约为966BP的基因片段），切胶回收并纯化该基因片段，然后使用限制性内切酶XHO和H。

23、IND双酶切该基因片段，同时使用限制性内切酶XHO和HIND双酶切PEGFPC1载体质粒，使用核酸纯化试剂盒分别对上述酶切的基因片段和质粒载体进行纯化后，利用T4连接酶连接上述纯化后的基因片段和质粒载体，将连接产物转化JM109感受态细胞，挑取克隆，提质粒，对质粒用XHO和HIND进行双酶切检验，电泳结果见图2，将酶切结果为含有966BP和47KB两条片段的质粒（见图2第3、5、7泳道，泳道1为1KBPLUSDNALADDER）进行测序验证，结果表明获得了含有正确的小鼠RANKL基因的重组载体PEGFPRANKL。0052实施例2不同CYS位点突变的小鼠RANKL基因及其表达载体的获得说明书C。

24、N104059141A5/9页70053利用AGILENT多位点定点突变试剂盒对小鼠RANKL基因片段的不同CYS位点进行定点突变，将RANKL基因片段中CYS的密码子序列TGC置换成GLY的密码子序列GGC，所使用的定点突变引物使用AGILENT公司定点突变引物设计软件（HTTPS/WWWGENOMICSAGILENTCOM/PRIMERDESIGNPROGRAMJSP）设计获得（见表1）0054表1多位点定点突变引物005500560057以上述实施例1制备的PEGFPRANKL质粒为模板进行PCR反应，所述PCR反应体系为10QUIKCHANGELIGHTNINGMULTIREACTIO。

25、NBUFFER25L，QUIKSOLUTION05L，DSDNATEMPLATE100NG，MUTAGENICPRIMERS各50NG，DNTPMIX1L，QUIKCHANGELIGHTNINGMULTIENZYMEBLEND1L，DOUBLEDISTILLEDH2O补至25L；所述PCR反应条件为95预变性2MIN，9520S，5530S，6530S/KB，30个循环，65延伸5MIN；所述PCR反应结束后，使用足量DPN酶将PCR产物在37处理1H，以去除模板质粒，将所述DPN酶处理后的PCR反应产物转化入JM109感受态细胞，所述转化的JM109感说明书CN104059141A6/9页8。

26、受态细胞作为突变组，同时做两个对照组将实施例1制备的PEGFPRANKL质粒转化入JM109感受态细胞；另取实施例1制备的PEGFPRANKL质粒，使用足量DPN酶将其在37处理1H，然后将DPN酶处理后的PEGFPRANKL转化入JM109感受态细胞。取上述三组转化的JM109感受态细胞涂布至KANLB平板，于37培养16小时后，观察发现，突变组长出40个单菌落，对照组长出许多单菌落，对照组无菌落产生，挑取突变组的单菌落并提质粒，经DNA测序确认获得了小鼠RANKL的8种CYS突变序列，分别如SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO20、SEQIDNO25、SEQIDNO26、。

27、SEQIDNO27、SEQIDNO28和SEQIDNO30所示，并按照所述CYS在RANKL蛋白中的位点位置依次记为RANKLC63G、RANKLC87G、RANKLC63/87G、RANKLC115/220G、RANKLC87/115/220G、RANKLC63/115/220G、RANKLC63/87/220G和RANKLC63/87/115/220G。0058使用限制性内切酶XHO和HIND双酶切上述8种含有不同CYS突变的小鼠RANKL序列的质粒，进行1琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收约966BP的片段，利用T4连接酶连接经XHO和HIND双酶切后的线性PEGFPC1质粒约47KB的片段，。

28、转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，提质粒，对质粒用XHO和HIND进行酶切验证，电泳结果见图3，双酶切获得大小分别约为47KB和966BP的片段，这表明获得了8个突变质粒，即不同CYS位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体，依次记为PEGFPRANKLC63G、PEGFPRANKLC87G、PEGFPRANKLC63/87G、PEGFPRANKLC115/220G、PEGFPRANKLC87/115/220G、PEGFPRANKLC63/115/220G、PEGFPRANKLC63/87/220G、PEGFPRANKLC63/87/115/220G。0059然后，使用TAKARAMUT。

29、ANBESTKIT对上述步骤获得的8种小鼠RANKL突变序列再次进行定点突变，从而获得另外7种小鼠RANKL突变体的表达载体，所使用的定点突变引物、PCR模板及目的产物见表20060表2单位点定点突变引物、PCR模板及目的产物0061说明书CN104059141A7/9页900620063以上述制备的小鼠RANKL突变体的表达载体为模板进行PCR反应，单位点定点突变的PCR反应体系为2GCBUFFER25L，DSDNATEMPLATE01L，PRIMERS（10M）各1L，DNTPMIX（25MM）8L，TAKARALATAQ05L，DOUBLEDISTILLEDH2O补至50L；所述PCR反。

30、应条件为94预变性5MIN，9430S，5540S，7210MIN，30个循环，72延伸15MIN；所述PCR反应结束后，对PCR反应液进行1琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的DNA片段，然后将回收产物用DPN酶在37处理数小时，使用核酸纯化试剂盒回收上述酶切产物，按照TAKARAMUTANBESTKIT说明书对回收的酶切产物进行BLUNTINGKINATION反应，然后用T4连接酶连接环化，将所得的连接产物转化入JM109感受态细胞并涂布至KANLB平板，挑取单菌落并提取质粒，经DNA测序确认得到了另外7种小鼠RANKL的CYS突变序列，分别如SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQI。

31、DNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24和SEQIDNO29所示，并按照所述CYS在RANKL蛋白中的位点位置依说明书CN104059141A8/9页10次记为RANKLC115G、RANKLC220G、RANKLC63/115G、RANKLC63/220G、RANKLC87/115G、RANKLC87/220G、RANKLC63/87/115G。0064使用限制性内切酶XHO和HIND双酶切上述步骤获得的7种含有不同CYS突变RANKL序列的质粒，进行1琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收约966BP的片段，利用T4连接酶连接经XHO和HIND双酶切后的线性PEGFPC。

32、1质粒约47KB的片段，转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，提质粒，对质粒用XHO和HIND进行酶切验证，电泳结果见图4，双酶切获得大小分别约为47KB和966BP的片段，这表明获得了7个突变质粒，即不同CYS位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体，依次记为PEGFPRANKLC220G、PEGFPRANKLC63/220G、PEGFPRANKLC87/220G、PEGFPRANKLC115G、PEGFPRANKLC63/115G、PEGFPRANKLC87/115G、PEGFPRANKLC63/87/115G。0065实施例3含有所述表达载体的重组细胞以及表达系统的构建0066所述重组。

33、细胞通过如下方法构建0067转染和筛选分别取PEGFPC1质粒、实施例1制备的PEGFPRANKL质粒及实施例2制备的小鼠RANKL突变体表达载体，用限制性内切酶APAL消化上述质粒使之线性化，随后将HEK293细胞消化铺6孔板，每孔50万个细胞，培养至第二天，使用LIPOFECTAMINE2000将25G线性化质粒转染所述HEK293细胞，培养24H后，将所述细胞消化至100MM培养皿，待细胞贴壁后，换液，并加入终浓度为400G/ML的G418，所述转染的HEK293为实验组，同时设对照组作为筛选对照，该组为未被转染的HEK293，与实验组相同也加入G418浓度为400G/ML的筛选培养基，。

34、然后将所述实验组和对照组按每3天更换一次所述筛选培养基进行培养，14天后，所述对照组的HEK293细胞已经全部死亡，而实验组出现抗性克隆，改用G418浓度为200G/ML的培养基继续培养，待细胞大量扩增后，将大部分细胞冻存备用，即得所述重组细胞，其余部分细胞继续培养，用于进一步的鉴定实验。0068RTPCR鉴定将上述步骤获得的重组细胞铺6孔板，待细胞长满后提取总RNA，然后反转录成CDNA，以此CDNA为模板，进行PCR反应，所用引物为实施例1中的RANKLFOR和RANKLREV，反应体系和反应条件也同实施例1，反应结束后，对PCR反应液进行1琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5，除PEGFPC1。

35、转染组（2号泳道）未获得任何条带外，其余各组均扩增获得了长度约为966BP的基因片段（317号泳道）。0069荧光显微镜观察鉴定将稳定表达带有EGFP标签CYS位点突变的小鼠RANKL突变体的HEK293细胞铺48孔板，每孔约1万个细胞，细胞贴壁后即可在荧光显微镜下观察拍照，拍照结果见图6，1号样品为HEK293细胞，2号样品为转染了PEGFPC1质粒的HEK293细胞，3号样品为转染了PEGFPRANKL质粒的HEK293细胞，418号样品为转染了实施例2制备的15种突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293细胞，荧光显微镜观察结果表明，各组细胞均成功表达了目的蛋白，并发绿色荧光，因。

36、此可以用于进一步的蛋白定位等实验。0070按照上述步骤转染了上述实施例2制备的表达载体后获得的重组细胞所表达的小鼠RANKL突变体的氨基酸序列如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14或SEQIDNO15中任一所示。0071所述重组细胞表达系统构建即为按照上述方法分别将转染了实施例2制备的15说明书CN104059141A109/9页11种小鼠RANKL突变体的表达载体后获得的。

37、重组细胞的总和。0072实施例4重组EGFP标签CYS位点突变小鼠RANKL的活性检测0073本实施例以HEK293、HEK293/PEGFPRANKL、HEK293/PEGFPRANKLC63/87/115/220G、HEK293/PEGFPRANKLC63/87G、HEK293/PEGFPRANKLC63G、HEK293/PEGFPRANKLC87G等6组细胞为研究对象，进行以下两个实验0074将各组细胞分别铺48孔板，每孔5万个细胞，每孔250L培养基，每24H进行半量换液一次，收集每次换液时吸出的大约125L培养基，于80保存，待收集了24H、48H、72H、96H这四个时间点的培养基。

38、之后，将上述得到的所有培养基于冰上融化，然后离心，取上清，使用小鼠RANKL定量检测ELISA试剂盒检测上述步骤得到的上清中小鼠RANKL的浓度，结果如图7所示，转染了带有EGFP标签的小鼠RANKL载体以及带有EGFP标签CYS位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293细胞均可产生小鼠可溶性RANKL蛋白，但转染带有EGFP标签CYS位点突变的小鼠RANKL突变体表达载体的HEK293细胞所产生的小鼠可溶性RANKL蛋白的量有所降低。0075将各组细胞分别铺48孔板，每孔5千个细胞，同时每孔铺5千个RAW2647细胞，每24H进行半量换液一次，6天后，使用TRACP试剂盒染色，观。

39、察并计数破骨细胞形成的情况，结果如图8所示，转染了带有EGFP标签小鼠RANKL载体以及带有EGFP标签CYS位点突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293细胞均具有诱导破骨细胞形成的活性，但转染了63位CYS突变的小鼠RANKL突变体的表达载体的HEK293诱导破骨细胞形成的活性降低约40。0076显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。说明书CN10405914。

40、1A111/30页1200010002序列表CN104059141A122/30页130003序列表CN104059141A133/30页140004序列表CN104059141A144/30页150005序列表CN104059141A155/30页160006序列表CN104059141A166/30页170007序列表CN104059141A177/30页180008序列表CN104059141A188/30页190009序列表CN104059141A199/30页200010序列表CN104059141A2010/30页210011序列表CN104059141A2111/30页22001。

41、2序列表CN104059141A2212/30页230013序列表CN104059141A2313/30页240014序列表CN104059141A2414/30页250015序列表CN104059141A2515/30页260016序列表CN104059141A2616/30页270017序列表CN104059141A2717/30页280018序列表CN104059141A2818/30页290019序列表CN104059141A2919/30页300020序列表CN104059141A3020/30页310021序列表CN104059141A3121/30页320022序列表CN1040。

42、59141A3222/30页330023序列表CN104059141A3323/30页340024序列表CN104059141A3424/30页350025序列表CN104059141A3525/30页360026序列表CN104059141A3626/30页370027序列表CN104059141A3727/30页380028序列表CN104059141A3828/30页390029序列表CN104059141A3929/30页400030序列表CN104059141A4030/30页41序列表CN104059141A411/3页42图1图2图3图4图5说明书附图CN104059141A422/3页43图6图7说明书附图CN104059141A433/3页44图8说明书附图CN104059141A44。

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