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1、10申请公布号CN104073570A43申请公布日20141001CN104073570A21申请号201310098836522申请日20130326C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/11200601C12R1/9320060171申请人中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所地址100071北京市丰台区东大街20号五所一室病毒实验室72发明人秦成峰姜涛刘娟邓永强朱舜亚秦鄂德74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用57摘要本发明公开了一种用于鉴定人类腺。
2、病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。本发明提供的辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。本发明解决了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低、特异性不强等缺点，应用特异性高，检测敏感性可达0008PFU/反应体系，且适用于高通量筛选。本发明尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页1。
3、9中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页10申请公布号CN104073570ACN104073570A1/1页21一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。2一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。3如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序。
4、列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。4序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。5与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。6序列表的序列3所示的单链DNA分子或与序列表的序列3所示的单链DNA分子反向互补的单链DNA分子。7权利要求4所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。8权利要求5所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定。
5、量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。9权利要求4所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型中的应用。10权利要求5所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型中的应用。权利要求书CN104073570A1/5页3用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用技术领域0001本发明涉及一种用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。背景技术0002人腺病毒（HUMANADENOVIRUS，HADV）是一群无包膜的双链DNA病毒，分为155个血清型，分别划入AF共6个血。
6、清学分组。人腺病毒经呼吸道和消化道传播，引起多种感染，对小儿和免疫缺陷者危害严重。腺病毒感染人体可能引发的疾病包括急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间质性肾炎等。在儿童急性下呼吸道感染患者中腺病毒感染阳性率可高达41。在最近几十年的北美、欧洲及亚洲均认为人类腺病毒B组感染是导致急性呼吸系统感染（ARD）的重要因素。0003HADV11、HADV14型属于腺病毒B组，传统的HADV11型主要导致肾及泌尿系统的感染，HADV14则引起人呼吸系统感染。新发现的人类腺病毒55型（HADV55），在其现之初命名为HADV11A，对人有较强的致病性，易在军队、学校等密集人群发生呼吸道传染病。
7、流行，在免疫低下的人群中甚至出现了死亡病例。基因分析表明HADV55是HADV14与HADV11的HEXON区域重组并发生若干核苷酸突变得到的毒株。0004实时定量PCR技术是近年来发展起来的一种PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时监测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板进行定量的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点。发明内容0005本发明的目的是提供一种用于鉴定人类。
8、腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。0006本发明提供的第一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。0007本发明提供的第二种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。0008以上任一所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。0009所述特异探针可。
9、为TAQMAN探针。所述特异探针具体可为在序列表的序列3所示单链DNA的5末端连接荧光基团，3末端连接淬灭基团得到的探针。所述特异探针具体可为在与序列表的序列3所示单链DNA反向互补的单链DNA的5末端连接荧光基团，3末说明书CN104073570A2/5页4端连接淬灭基团得到的探针。所述荧光基团具体可为FAM荧光基团，所述猝灭基团具体可为TAMRA荧光猝灭剂。其它荧光基团及猝灭基团也可采用。在探针完整时，荧光基团和淬灭基团在空间结构上相互靠近，探针5末端的荧光报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移（FRET）而被3端的淬灭基团淬灭，因此检测不到荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，引物和。
10、探针与模板特异性结合；TAQDNA聚合酶基于模板在引物3末端合成互补DNA序列；随着引物的延伸，TAQDNA聚合酶利用其53外切酶活性对互补结合在模板上的探针进行切割，从而释放出荧光报告基团，其与探针3末端淬灭基团的FRET被破坏，报告基团所释放荧光无法被淬灭基团屏蔽，从而可被检测到。由于每一条新合成DNA链对应一条探针及其荧光报告基团的释放，因此应光亮的增加与PCR产物的积累是呈比例关系的。利用阳性梯度模板如梯度稀释的病毒DNA或含有病毒特异核酸的质粒等循环阈值（CT，THRESHOLDCYCLER，超过阈值的PCR循环数）对应模板拷贝数或病毒滴定度制成标准曲线，根据待测HADV55型病毒样。
11、品的CT值即可通过与标准品的CT值测出样品的起始拷贝数或病毒滴度。0010本发明还保护序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。0011本发明还保护与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。0012本发明还保护序列表的序列3所示的单链DNA分子或与序列表的序列3所示的单链DNA分子反向互补的单链DNA分子。0013本发明还保护以上任一所述所述特异引物对和/或以上任一所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。0014本发明还。
12、保护以上任一所述所述特异引物对和/或以上任一所述单链DNA分子在辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型中的应用。0015用本发明提供的试剂盒检测待测样本中是否含有人类腺病毒55型的方法如下提取待测样本的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，采用所述特异引物对和所述特异探针进行实时PCR扩增，如果在40个循环内可检测到荧光信号并得到特异的S型扩增曲线，结果为阳性（即待测样品中存在人类腺病毒55型），如果未检测到特异荧光信号，结果为阴性（即待测样本中不含人类腺病毒55型）。0016应用本发明的试剂具有如下优点反应过程无须开盖，反应结束无须电泳，检测快速，并极大减少了PCR产物污染所产生的假阳性结。
13、果。本发明解决了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低、特异性不强等缺点，本发明的应用特异性高，检测敏感性可达0008PFU/反应体系，且适用于高通量筛选。本发明尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。附图说明0017图1为本发明探针和引物对对于人类腺病毒55型DNA的灵敏度检测。0018图2为本发明探针和引物对对于人类腺病毒55型的定量标准曲线。0019图3为本发明探针和引物对于检测不同型别腺病毒DNA的特异性。说明书CN104073570A3/5页5具体实施方式0020以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
14、。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。0021引物和探针由上海英潍捷基贸易有限公司合成。实时PCR试剂盒（PREMIXEXTAQTM）大连宝生物（TAKARA）公司，CODENODRR039A。核酸定量仪美国NANODROP公司。荧光定量PCR仪（SYSTEM20）德国罗氏（ROCHE）公司。DNA提取试剂盒BLOODTISSUEKITQIAGEN公司产品，CODENO69504。0022人类腺病毒3型（HUMANADENOVIRUS3）ATCC，ATCC编号为VR3。0023人类腺病毒5型（HU。
15、MANADENOVIRUS5）ATCC，ATCC编号为VR5。0024人类腺病毒7型（HUMANADENOVIRUS7）ATCC，ATCC编号为VR7。0025人类腺病毒11型（HUMANADENOVIRUS11）ATCC，ATCC编号为VR12。0026人类腺病毒14（HUMANADENOVIRUS14）ATCC，ATCC编号为VR15。0027人类腺病毒55型（HADV55病毒液）参考文献利用计算机分析鉴定人类腺病毒55型一种再次出现的呼吸道传染病病原体（CMPUTATIONALANALYSISIDENTIFIESHUMANADENOVIRUSTYPE55ASAREEMERGENTACUT。
16、ERESPIRATORYDISEASEPATHOGEN）JCLINMICROBIOL2010，483991993。0028实施例1、引物对和探针的制备0029根据GENEBANK公布的人类腺病毒55型基因组序列GENBANK序列号FJ643676设计引物和探针如下0030HADV55HXF（上游引物，序列1）5GTACGGCTTACAACTCTC3；0031HADV55HXR（下游引物，序列2）5TTGGGAGTCCTTCTTTTG3；0032HADV55HXPROBE（探针，序列3）5FAMAAATGGTGAGGAGCGCGTAACATAMRA3。0033实施例2、引物对和探针的组合物的灵敏。
17、度0034一、病毒样本的制备0035使用1640培养基将人类腺病毒55型的病毒液进行梯度稀释，得到10种不同浓度的HADV55病毒液（HADV55病毒浓度分别为400000PFU/ML、40000PFU/ML、4000PFU/ML、400PFU/ML、40PFU/ML、4PFU/ML、04PFU/ML、004PFU/ML、0004PFU/ML和00004PFU/ML）。0036样本1浓度为400000PFU/ML的HADV55病毒液。0037样本2浓度为40000PFU/ML的HADV55病毒液。0038样本3浓度为4000PFU/ML的HADV55病毒液。0039样本4浓度为400PFU/M。
18、L的HADV55病毒液。0040样本5浓度为40PFU/ML的HADV55病毒液。0041样本6浓度为4PFU/ML的HADV55病毒液。0042样本7浓度为04PFU/ML的HADV55病毒液。0043样本8浓度为004PFU/ML的HADV55病毒液。0044样本9浓度为0004PFU/ML的HADV55病毒液。0045样本10浓度为00004PFU/ML的HADV55病毒液。说明书CN104073570A4/5页60046样本111640培养基。0047二、提取基因组DNA0048采用DNA提取试剂盒并按试剂盒说明书提取100微升待测样本液（分别将步骤一制备的样本1至样本11作为待测样本。
19、液）的基因组DNA，具体方法如下0049在15ML的EP管中加入20L的QIAGENPROTEASE（试剂盒组分），然后加入100L待测样本液，然后加入200L的BUFFERAL（试剂盒组分），振荡器混匀15秒，56放置10分钟；加入200L无水乙醇，振荡器混匀15秒后将液体转至滤柱中，8000RPM离心1分钟；将滤柱转至新的收集管中，加入500L的AW1BUFFER（试剂盒组分），8000RPM离心1分钟；将滤柱转至新的收集管中，加入500L的AW2BUFFER（试剂盒组分），14000RPM离心3分钟后弃滤出液，再次离心2分钟；将滤柱转至新的EP管中，加入100L的无菌水，室温放置3分钟，。
20、8000RPM离心2分钟，收集的洗脱液（约100L）即为含有病毒基因组DNA的溶液，20保存。0050三、实时PCR0051取步骤1得到的基因组DNA，采用实时PCR试剂盒进行实时PCR。0052反应体系（20L）见表1。0053表1反应体系0054体积L终浓度2PREMIXEXTAQTM10/上游引物（HADV55HXF）（10M）04200NM下游引物（HADV55HXR）（10M）04200NM探针（HADV55HXPROBE）（10M）08400NM无核酸酶水64/步骤1得到的基因组DNA2/0055在荧光定量PCR仪上，按下列条件进行实时PCR反应预变性95C、30秒；PCR扩增95。
21、C、5秒，60C、20秒，共40个循环。0056扩增曲线见图1。含有最低浓度为4PFU/ML的HADV55病毒液的实时PCR扩增可观察到特异的扩增荧光曲线。对于浓度为4PFU/ML的HADV55病毒液来说，步骤1得到的基因组DNA中的病毒DNA浓度为4PFU/ML100103ML100L0004PFU/L。每个实时反应体系中病毒DNA的含量0004PFU/L2L0008PFU。即灵敏度为0008PFU/反应体系，该滴度以上的样本量均可以采用本发明的探针和引物对检测出来。不含有人类腺病毒55型病毒株的样本11进行实时PCR扩增无法获得扩增曲线。0057制作定量标准曲线，横坐标为待测样本液中的病毒。
22、浓度（PFU/ML）以10为底的对数，纵坐标为CT值，标准曲线见图2，标准曲线方程为Y49904X45407,R209948。0058实施例3、引物对和探针的组合物的特异性说明书CN104073570A5/5页70059一、病毒样本的制备0060样本1使用1640培养基将人类腺病毒55型配制为浓度为102PFU/ML的病毒液。0061样本2使用1640培养基将人类腺病毒3型配制为浓度为102PFU/ML的病毒液。0062样本3使用1640培养基将人类腺病毒5型配制为浓度为102PFU/ML的病毒液。0063样本4使用1640培养基将人类腺病毒7型配制为浓度为102PFU/ML的病毒液。0064。
23、样本5使用1640培养基将人类腺病毒11型配制为浓度为102PFU/ML的病毒液。0065样本6使用1640培养基将人类腺病毒14型配制为浓度为102PFU/ML的病毒液。0066二、提取基因组DNA0067采用DNA提取试剂盒并按试剂盒说明书提取100微升待测样本液（分别将步骤一制备的样本1至样本6作为待测样本液）的基因组DNA，具体方法同实施例2的步骤二。0068三、实时PCR0069反应体系和反应程序同实施例2的步骤三。0070扩增曲线见图3。0071人类腺病毒3型、人类腺病毒5型、人类腺病毒7型、人类腺病毒11型、人类腺病毒14均未检测到特异荧光信号和扩增曲线，为阴性结果。人类腺病毒55型为阳性结果。结果表明本发明方法具有良好特异性。说明书CN104073570A1/2页800010002序列表CN104073570A2/2页9序列表CN104073570A1/2页10图1图2说明书附图CN104073570A102/2页11图3说明书附图CN104073570A11。