重组杆状病毒及其应用.pdf

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1、10申请公布号CN104073471A43申请公布日20141001CN104073471A21申请号201410122911122申请日20140328201307202120130329JPC12N7/01200601C12N5/10200601C12R1/9320060171申请人希森美康株式会社地址日本兵库县72发明人坂东孝彦菅井睦美74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人李英54发明名称重组杆状病毒及其应用57摘要本发明提供整合了编码谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及编码DT黄递酶（NQO1）的基因的重组杆状病毒。30优先权数据51INTCL权利要求书1页说。

2、明书9页序列表6页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表6页附图3页10申请公布号CN104073471ACN104073471A1/1页21重组杆状病毒，其整合了编码谷氨酰羧化酶的基因和编码DT黄递酶的基因。2权利要求1所述的重组杆状病毒，其中进一步整合有编码维生素K依赖性蛋白质的基因。3权利要求2所述的重组杆状病毒，其中上述维生素K依赖性蛋白质是维生素K依赖性凝固因子。4权利要求3所述的重组杆状病毒，其中上述维生素K依赖性凝固因子选自凝血酶原、第VII因子、第IX因子、第X因子、蛋白C、蛋白S及蛋白Z。5宿主细胞，其通过用权利要求14中任一项。

3、所述的重组杆状病毒感染鳞翅目昆虫或鳞翅目昆虫的培养细胞而得到。6权利要求5所述的宿主细胞，其中上述鳞翅目昆虫是蚕。7重组维生素K依赖性蛋白质的制备用试剂盒，其包含整合了编码谷氨酰羧化酶的基因和编码DT黄递酶的基因的重组杆状病毒。8重组型维生素K依赖性蛋白质的制备方法，其包括下述步骤使用整合了编码谷氨酰羧化酶的基因和编码DT黄递酶的基因的重组杆状病毒，使谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达。9权利要求8所述的制备方法，其中上述表达步骤是在鳞翅目昆虫中表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质的步骤。10权利要求9所述的制备方法，其中上述表达步骤是在鳞翅目昆虫。

4、的幼虫或蛹中表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质步骤。权利要求书CN104073471A1/9页3重组杆状病毒及其应用技术领域0001本发明涉及重组杆状病毒及含所述病毒的重组型维生素K依赖性蛋白质的制造用试剂盒。另外，本发明也涉及感染了重组杆状病毒的宿主细胞。再者，本发明也涉及重组型维生素K依赖性蛋白质的制造方法。背景技术0002维生素K是担负各种维生素K依赖性蛋白质的翻译后修饰的谷氨酰羧化酶（GGCX）的辅因子。在维生素K的存在下，GGCX将各种维生素K依赖性蛋白质的指定的谷氨酸残基羧基化，转变为羧基谷氨酸（GLA）。已知此谷氨酰羧基化对于维生素K依赖性蛋白质的生物学功能（例如，血液凝固、。

5、骨代谢、信号传递等）极其重要。例如，作为维生素K依赖性蛋白质之一的血液凝固第II因子（凝血酶原）或第X因子通过谷氨酰羧基化，能够向作为凝固反应的场所的细胞膜的磷脂结合，由此可接受由于其他因子开始的活化反应。0003第II因子或如第X因子这样的维生素K依赖性凝血因子主要用人或牛的血浆作为原料进行制备，由此存在混入感染性物质或制品的批间有差异的问题。因此，近年研究开发了通过利用哺乳动物细胞的基因重组技术制造维生素K依赖性凝血因子的方法。0004但是，已知通过利用哺乳动物细胞的表达系统得到的维生素K依赖性凝血因子完全不被谷氨酰羧基化。由于活化不被谷氨酰羧基化的凝血因子通常是困难的，因此从产业上利用的。

6、观点来看，期望重组维生素K依赖性凝血因子在用表达蛋白质的系统得到的阶段就被充分地谷氨酰羧基化。因此开发了，在利用哺乳动物细胞的表达系统中，通过共表达维生素K依赖性蛋白质和GGCX来得到谷氨酰羧基化蛋白质的方法（参照WO2005/038019）。0005另一方面，在维生素K依赖性蛋白质的谷氨酰羧基化中，除了GGCX之外，已知维生素K环氧化物还原酶（VKOR）和DT黄递酶（NAD（P）H依赖性醌氧化物还原酶1；也被称为NOQ1）也相关（参见TIEJK等人，BLOODVOL117，P29672974（2011）。其中，与谷氨酰羧基化直接相关的酶是GGCX，VKOR及NQO1是与维生素K的再循环相关的。

7、酶，近年也开发了在利用哺乳动物细胞的表达系统中，通过共表达维生素K依赖性蛋白质、GGCX及VKOR来得到谷氨酰羧基化蛋白质的方法（参照WO2006/067116）。0006发明概述0007由于上述的方法均使用利用哺乳动物细胞的表达系统，谷氨酰羧基化蛋白质的产量从工业规模的制造的观点来看极其少，另外还有制造成本高的问题。0008另一方面已知用利用大肠杆菌的表达系统，可期待大量表达期望的蛋白质，但是所表达的蛋白质并未进行翻译后修饰。此外还知道，在使其表达结构复杂的蛋白质时，所述蛋白质几乎全部变成不溶性凝集体。另外，用以往的利用鳞翅目昆虫的表达系统可期待表达接近天然型蛋白质的翻译后修饰的蛋白质，但在。

8、本发明人的预备实验中，在蚕中表达的维生素K依赖性蛋白质几乎未被谷氨酰羧基化。说明书CN104073471A2/9页40009鉴于上述这样的情况，本发明人以提供制造满足下述两个条件的重组型维生素K依赖性蛋白质的手段作为课题可简便并且大量地制造维生素K依赖性蛋白质、和所得到的维生素K依赖性蛋白质被充分地谷氨酰羧基化。0010本发明人发现，使用整合有编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒、和整合有编码维生素K依赖性蛋白质的基因的重组杆状病毒的鳞翅目昆虫的表达系统，可简便并且大量地得到维生素K依赖性蛋白质，所得到的维生素K依赖性蛋白质被充分地谷氨酰羧基化，从而完成本发明。0011本发明提。

9、供整合了编码谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及编码DT黄递酶（NQO1）的基因的重组杆状病毒。0012本发明提供重组型维生素K依赖性蛋白质的制造方法。此方法包括下述步骤使用整合有编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒，在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。0013本发明通过利用鳞翅目昆虫或该鳞翅目昆虫的培养细胞的表达系统，可简便并且大量地制造谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。附图说明0014图1是显示蚕来源的培养细胞中的各蛋白质的表达量的照片，所述蚕来源的培养细胞是被用于将GGCX、NQO1及VKOR分别单独表达，或者将它们之中的2种共表。

10、达的重组杆状病毒的感染的细胞。0015图2图2A是显示在感染了实施例1中制作的各种的重组杆状病毒，和用于表达人第X因子的重组杆状病毒的蚕幼虫中的人第X因子的表达量的照片，图2B是显示表达的人第X因子的谷氨酰羧基化的程度的照片。0016图3图3A是显示在感染了用于共表达GGCX及NQO1的重组杆状病毒，和用于表达人凝血酶原的重组杆状病毒的蚕蛹中的人凝血酶原的表达量的照片，图3B是显示表达的人凝血酶原的谷氨酰羧基化的程度的照片。0017图4图4A是显示在感染了实施例1中制作的各种的重组杆状病毒，和用于表达人第X因子的重组杆状病毒的蚕幼虫中的人第X因子的表达量的照片，图4B是显示表达的人第X因子的谷。

11、氨酰羧基化的程度的照片。0018发明详述0019以下参照附图描述本发明的优选的实施方式。0020本发明的重组杆状病毒整合了编码GGCX的基因及编码NQO1的基因，可在鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞中共表达GGCX及NQO1。本发明的重组杆状病毒可在鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞中表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质时适宜地使用。即，通过用本发明的重组杆状病毒，和整合编码希望的维生素K依赖性蛋白质的基因的重组杆状病毒感染鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞，可在该昆虫或培养细胞中大量地表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。0021在本说明书中，维生素K依赖性蛋白质是指，在维生素K的存在下，由GGCX羧基。

12、化指定的谷氨酸残基而将其变换为GLA的蛋白质。作为那样的蛋白质，可举出例如，维生素K依赖性凝血因子、骨GLA蛋白质、基质GLA蛋白质、增殖抑制特异性蛋白质6及棘蛇亚科说明书CN104073471A3/9页5（ACANTHOPHIINAE）FXA样蛋白等。另外，维生素K依赖性凝血因子只要是通过被谷氨酰羧基化而活化，或者能接受活化反应的凝血因子，就没有特别限定，可举出例如，凝血酶原（第II因子）、第VII因子、第IX因子、第X因子、蛋白C、蛋白S、蛋白Z等。0022在本发明的实施方式中，编码GGCX的基因（以下，也称为“GGCX基因”）只要是从具有GGCX的期望的生物种来源的GGCX基因，就没有特。

13、别限定，优选为人GGCX基因，更优选为编码SEQIDNO1所表示的氨基酸序列的基因。再有，人GGCX基因的碱基序列本身是公知的，例如，可在由美国国立医学图书馆的国立生物信息中心（NATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYINFORMATIONNCBI）提供的数据库，以登记号EU847509访问。或者，作为GGCX基因，也可使用编码与野生型GGCX有同等的生物活性的变异型GGCX的基因。0023在本发明的实施方式中，编码NQO1的基因（以下，也称为“NQO1基因”）只要是从有NQO1的期望的生物种来源的NQO1基因，就没有特别限定，优选为人NQO1基因，更优选为编码SEQIDN。

14、O2所表示的氨基酸序列的基因。再有，人NQO1基因的碱基序列本身是公知的，例如，在由NCBI提供的数据库，以登记号AK312368访问。或者，作为NQO1基因，也可使用编码与野生型NQO1有同等的生物活性的变异型NQO1的基因。0024在本发明的重组杆状病毒的DNA中的GGCX基因及NQO1基因的位置是只要各基因所编码的酶在鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞中表达，就没有特别限定。从而，在本发明的重组杆状病毒的DNA中，GGCX基因及NQO1基因可连续插入，也可在互相分离的位置插入。当这些基因连续插入到杆状病毒DNA时，GGCX及NQO1作为融合蛋白质表达。再有，GGCX基因及NQO1基因之中，将任。

15、何一方作为上游，没有特别限定。另一方面，GGCX基因及NQO1基因在杆状病毒DNA中插入到互相分离的位置时，GGCX及NQO1分别作为个别的蛋白质表达。在本发明的实施方式中，GGCX基因及NQO1基因在杆状病毒DNA中插入到互相分离的位置是优选的。0025在本发明的实施方式中，杆状病毒的种类只要是可感染鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞的病毒，就没有特别限定，优选为核多角体病病毒（NPV）或其改变型病毒。作为那样的病毒，可举出例如BMNPV、HYCUNPV、ANPENPV、ACNPV、蚕蛾科的蚕（BOMBYXMORI）或夜蛾科的苜蓿银纹夜蛾（AUTOGRAPHACALIFORNICA）等的两宿主感染。

16、的重组杆状病毒（参照特开200352371号公报）等。在优选的实施方式中，使用半胱氨酸蛋白酶缺损（CPD）杆状病毒（参照特愿平7303488号）。0026本发明的重组杆状病毒可由本领域公知的方法制作。作为那样的方法，可举出例如，使用可由同源重组将希望的基因插入杆状病毒DNA的转移载体的方法。此方法中，将整合了希望的基因的转移载体，和由限制性内切酶等线性化的杆状病毒DNA共转染到鳞翅目昆虫的培养细胞中，通过筛选感染细胞，可得到重组杆状病毒。0027在本发明的实施方式中，转移载体只要是有使在鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞中的基因表达成为可能的启动子，可在该启动子的下游插入希望的基因的载体DNA，就没。

17、有特别限定。本领域公知那样的转移载体本身，可举出例如PM02、PM23、PCPM、PYNG、PBM030、PBM050、PVL1392等。再有，上述的启动子可从本领域公知的启动子适宜选择，可举出例如，多角体蛋白启动子、P10启动子、蚕肌动蛋白启动子等。0028使用转移载体制作本发明的重组杆状病毒时，GGCX基因及NQO1基因可整合到相同的转移载体中，也可分别整合到个别的转移载体中。当将GGCX基因及NQO1基因分别整说明书CN104073471A4/9页6合进个别的转移载体中时，这2种转移载体优选为可将各基因整合到杆状病毒DNA中的互相不同的位置的载体的组合。作为那样的载体的组合，可举出例如，。

18、可将杆状病毒DNA的多角体蛋白基因部位重组为希望的基因的转移载体，和可将杆状病毒DNA的半胱氨酸蛋白酶基因部位重组为希望的基因的转移载体的组合。0029在本发明的实施方式中，根据需要，也可向GGCX及NQO1融合蛋白质分泌信号序列。即，在本发明的重组杆状病毒中，也可将编码蛋白质分泌信号序列的基因再分别整合到GGCX基因及NQO1基因的上游或下游。那样的蛋白质分泌信号序列，可根据重组型维生素K依赖性蛋白质的种类等，在利用鳞翅目昆虫的表达系统中，从使用的公知的序列适宜选择。可举出例如，凝血酶原来源分泌信号序列（SEQIDNO3）、蚕来源30K信号序列（SEQIDNO4）及蚕来源SP信号序列（SEQ。

19、IDNO5）等。0030在本发明的实施方式中，根据需要，也可向GGCX及NQO1融合功能性标签。即，在本发明的重组杆状病毒中，也可将编码功能性标签的基因再分别整合到GGCX基因及NQO1基因的上游或下游。作为那样的功能性标签的种类，特别优选蛋白质纯化用标签，可举出例如，FLAG标签、6HIS标签、谷胱甘肽S转移酶标签、麦芽糖结合蛋白质标签等。0031在本发明的别的实施方式中，也可向整合了GGCX基因及NQO1基因的重组杆状病毒再整合有编码维生素K依赖性蛋白质的基因。此时，编码维生素K依赖性蛋白质的基因，在杆状病毒DNA中，以可表达的方式整合到与GGCX基因及NQO1基因分离的位置是优选的。即，。

20、维生素K依赖性蛋白质作为与GGCX及NQO1个别的蛋白质表达。通过这样的重组杆状病毒，使得单独用该病毒在鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞中大量地表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质成为可能。0032在本发明的范围内还包括，通过用上述的本发明的重组杆状病毒感染鳞翅目昆虫或鳞翅目昆虫的培养细胞而得到的宿主细胞。0033在本发明的实施方式中，鳞翅目昆虫只要是适宜于重组蛋白质的表达的公知的鳞翅目昆虫，就没有特别限定，可举出例如，蚕（BOMBYXMORI）、黄领麻纹灯蛾（SPILOSOMAIMPARILIS）、柞蚕（ANTHERAEAPERNYI）、草地贪夜蛾（SPODOPTERAFRUGIPERDA）、。

21、粉纹夜蛾（TRICHOPLUSIANI）等。在它们之中，特别优选蚕。再有，鳞翅目昆虫可以是成虫、蛹及幼虫中的任何一种形态，但从丝氨酸蛋白酶的活性和对杆状病毒的感受性的角度来看，优选使用蛹或幼虫。另外，作为鳞翅目昆虫的培养细胞，只要是由适宜于重组型蛋白质的表达的鳞翅目昆虫建立的细胞株，就没有特别限定，可举出例如BMN、BMN4、SPIM、ANPE、SF9、SF21、HIGH5等。0034用本发明的重组杆状病毒感染鳞翅目昆虫或此鳞翅目昆虫的培养细胞的手段没有特别限定，可从本领域公知的方法适宜选择。例如，当感染鳞翅目昆虫时，可举出将含重组杆状病毒的液体注射进该昆虫的方法等。另外，当感染培养细胞时，也。

22、可将含重组杆状病毒的液体添加到培养基中。向鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞感染重组杆状病毒起饲育或培养58天，则在宿主细胞中，重组蛋白质表达。0035在本发明的实施方式中，可在向鳞翅目昆虫或此鳞翅目昆虫的培养细胞感染整合了GGCX基因及NQO1基因的重组杆状病毒之后，再感染整合编码希望的维生素K依赖性蛋白质的基因的重组杆状病毒。0036在本发明的范围内包括整合了编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病说明书CN104073471A5/9页7毒，也包括重组维生素K依赖性蛋白质的制造用试剂盒（以下，也简称为“试剂盒”）。再有，对于此重组杆状病毒而言，与对于本发明的重组杆状病毒所描述的内容相同。

23、。0037在本发明的实施方式中，优选重组杆状病毒再整合编码维生素K依赖性蛋白质的基因。即，在杆状病毒DNA中，整合有GGCX基因、NQO1基因及编码维生素K依赖性蛋白质的基因这3种。对于此实施方式的重组杆状病毒而言，与对于本发明的重组杆状病毒所描述的内容相同。0038在别的实施方式中，本发明的试剂盒优选还含有整合编码维生素K依赖性蛋白质的基因的重组杆状病毒。再有，此杆状病毒，除了作为希望的基因使用编码维生素K依赖性蛋白质的基因以外，可如本发明的杆状病毒同样方式地制作。其中，整合了编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒也称为“第1杆状病毒”，整合了编码维生素K依赖性蛋白质的基因的重。

24、组杆状病毒也称为“第2杆状病毒”。在此实施方式的试剂盒中，第1杆状病毒和第2杆状病毒可在分开的容器中保存，也可将两者混合而在1个容器中保存。再有，将第1杆状病毒和第2杆状病毒混合保存时，两者的混合比例没有特别限定，但优选按照病毒效价11来混合。0039在本发明的范围内包括重组型维生素K依赖性蛋白质的制造方法（以下，也简称为“制造方法”），其包括下述步骤使用整合了编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒，将谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质在鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞中表达。再有，对于此重组杆状病毒、鳞翅目昆虫及此昆虫的培养细胞而言，与对本发明的重组杆状病毒所描述的内容相同。004。

25、0在本发明的实施方式中，优选重组杆状病毒再整合编码维生素K依赖性蛋白质的基因。对于此实施方式的重组杆状病毒而言，与对本发明的重组杆状病毒所描述的内容相同。或者，与整合了编码GGCX的基因及编码NQO1的基因的重组杆状病毒（第1杆状病毒）一同使用整合编码维生素K依赖性蛋白质的基因的重组杆状病毒（第2杆状病毒）是优选的。0041在本发明的制造方法中，可通过用上述的重组杆状病毒感染鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞来表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。再有，感染手段与对本发明的宿主细胞所描述内容相同。0042在本发明的制造方法中，当使用第1杆状病毒及第2杆状病毒时，可同时感染到鳞翅目昆虫或此昆虫的培养。

26、细胞，也可在感染其中一种重组杆状病毒之后，再感染另一种重组杆状病毒。此时，从第1次的感染1周之内进行第2次的感染是优选的。再有，第1杆状病毒和第2杆状病毒的使用量的比例没有特别限定，但优选为病毒效价为11的量。0043通常，可通过向鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞感染重组杆状病毒起饲育或培养58天来表达谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。在本发明的实施方式中，从表达目的蛋白质的鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞取得该蛋白质的手段没有特别限定。例如，使用鳞翅目昆虫时，可通过采集体液，或者将该昆虫破碎而制备匀浆来取得谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。另外，使用培养细胞时，可通过将该细胞物理性破碎，或者在含。

27、表面活性剂等的细胞溶解剂的溶液中溶解来取得谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质。0044在本发明的制造方法中，根据需要，可再包括从上述的表达步骤得到的鳞翅目昆说明书CN104073471A6/9页8虫或此昆虫的培养细胞取得含谷氨酰羧基化的维生素K依赖性蛋白质的可溶性级分的步骤。可通过将如上述一样得到的鳞翅目昆虫的体液或匀浆、或者细胞破碎液或细胞裂解物过滤或离心，分离上清而得到可溶性级分。再有，离心时，也可向样品任意地添加适当的缓冲液。那样的缓冲液只要是适宜于蛋白质的保存，就没有特别限定，可举出例如，TRIS缓冲液、磷酸缓冲液等。0045接下来，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

28、。实施例0046实施例1重组杆状病毒的制作及表达的探讨0047（1）分别编码GGCX、NQO1及VKOR的基因的亚克隆0048基于已经报告的人GGCX基因的碱基序列（NCBIACCNOEU847509）、人NQO1基因的碱基序列（NCBIACCNOAK312368）及人VKOR基因的碱基序列（NCBIACCNOAY521634），设计用于亚克隆各基因的引物组。下面显示了各引物的碱基序列。再有，在各引物各自附加适宜的限制性内切酶位点的碱基序列。0049（I）GGCX基因用引物组0050F5GGGGTACCATGGCGGTGTCTGCCGGGTCCGC3（SEQIDNO6）0051R5GCTCTA。

29、GAGAACTCTGAGTGGACAGGATCA3（SEQIDNO7）0052（II）NQO1基因用引物组0053F5GAAGATCTATGGTCGGCAGAAGAGCACTGATCGTA3（SEQIDNO8）0054R5GCTCTAGATTTTCTAGCTTTGATCTGGTTGTCAGTT3（SEQIDNO9）0055（III）VKOR基因用引物组0056F5GGGGTACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT3（SEQIDNO10）0057R5GCTCTAGATCAGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG3（SEQIDNO11）0058使用上述的引物组，通过以人肝脏CDNA。

30、库（CLONTECH公司）作为模板的PCR法分离GGCX基因、NQO1基因及VKOR基因。将分离的各基因的DNA片段使用QIAQUICK（QIAGEN公司）纯化，用限制性内切酶（GGCXKPNI及XBAI、NQO1XBAI、VKORKPNI及XBAI）处理。将得到的各片段整合到PM23载体（SYSMEX株式会社）的多克隆位点。将得到的质粒构建体各自称为PMGGCX、PMNQO1及PMVKOR。这些的质粒是POLH部位重组用转移质粒。另外，将上述的限制性内切酶处理后的各DNA片段整合到PCPM载体（SYSMEX株式会社）的多克隆位点。将得到的质粒构建体各自称为PCPMGGCX、PCPMNQO1及。

31、PCPMVKOR。这些质粒是CP部位重组用转移质粒。0059再有，上述的转移质粒均在导入基因的下游整合有编码FLAG标签的基因，所以在使用各转移质粒表达的蛋白质的C末端融合有FLAG标签。0060（2）重组杆状病毒的制作0061（21）单独表达病毒的制作0062制作用于分别单独表达GGCX、NQO1及VKOR的重组杆状病毒。这些重组杆状病毒的制作是将MAEDA等的方法（INVERTERBRATECELLSYSTEM及APPLICATIONS，VOL1，P167181,CRCPRESS，BOCARATON（1989）改变而进行。具体而言如下。首先，将上述的POLH部位重组用转移质粒用质粒纯化试剂。

32、盒（QIAGEN公司）纯化。然后，将各转移质说明书CN104073471A7/9页9粒（05G）和直链化的CPD杆状病毒（ATCCVR2500）的DNA（02G）使用脂转染试剂（XTREMEGENE9DNA转染试剂ROCHE公司）共转染进BMN细胞（MAEDA，1989）。筛选通过利用96孔板的有限稀释法进行，挑选确认感染迹象的病毒，回收培养上清。由此，得到分别整合GGCX基因、NQO1基因及VKOR基因的重组杆状病毒。将得到的病毒分别称为GGCX单独表达病毒、NQO1单独表达病毒及VKOR单独表达病毒。0063（22）共表达病毒的制作0064制作用于分别共表达GGCX及NQO1、以及GGCX。

33、及VKOR的各自的组合的重组杆状病毒。这些重组杆状病毒的制作通过改变上述（21）的方法来进行。具体而言如下。将上述的POLH部位重组用转移质粒及CP部位重组用转移质粒由质粒纯化试剂盒（QIAGEN公司）纯化。然后，将各POLH部位重组用转移质粒（05G）、各CP部位重组用转移质粒（05G），和5CUTCPD杆状病毒（ATCCVR2500）的DNA（02G），使用脂转染试剂（XTREMEGENE9DNA转染试剂ROCHE公司）共转染进BMN细胞（MAEDA，1989）。筛选通过利用96孔板的有限稀释法进行，挑选确认感染迹象的病毒，回收培养上清。由此，得到分别整合GGCX基因、NQO1基因及VKO。

34、R基因的重组杆状病毒。将得到的病毒分别称为GGCX/NQO1共表达病毒及GGCX/VKOR共表达病毒。0065（3）BMN细胞中的标签融合凝血酶原的表达的探讨0066回收上清后，制备BMN细胞的裂解物。对于得到的裂解物，用SDSPAGE及使用抗FLAG抗体（和光纯药工业株式会社）的蛋白印迹进行解析。结果示于图1。由图1确认，BMN裂解物中表达具有被预测为是GGCX、NQO1及VKOR的分子量的蛋白质。0067实施例2蚕中的维生素K依赖性蛋白质的表达及谷氨酰谷氨酰羧基化的探讨0068（1）分别编码第X因子及凝血酶原的基因的亚克隆0069基于数据库中公开的人第X因子基因（以下，也称为HFX基因）的。

35、碱基序列（NCBIACCNOBC_040125）及人凝血酶原基因（以下，也称为HPTH基因）的碱基序列（NCBIACCNONM_000506），设计用于克隆各基因的引物组。以下显示各引物的序列。再有，向各引物分别附加适宜的限制性内切酶位点的碱基序列。0070（I）HFX基因用引物组0071F5AAGGTACCCGGGGATCCATGGGGCGCCCACTG3（SEQIDNO12）0072R5AATCTAGATCACTTTAATGGAGAGGACGTTAT3（SEQIDNO13）0073（II）HPTH基因用引物组0074F5AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG3（S。

36、EQIDNO14）0075R5AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT3（SEQIDNO15）0076使用上述的引物组，通过以人肝脏CDNA库（CLONTECH公司）作为模板的PCR法分离HFX基因及HPTH基因。将分离的DNA片段使用QIAQUICK（QIAGEN公司）进行纯化，用限制性内切酶KPNI及XBAI处理之后，整合到PM23载体（SYSMEX株式会社）的多克隆位点。将得到的质粒构建体分别称为PMFX及PMPTH。0077（2）重组杆状病毒的制作0078制作用于分别单独表达第X因子及凝血酶原的重组杆状病毒。这些重组杆状病毒的制作是，使用PMFX及PMPT。

37、H，如上述实施例1的（21）同样地进行。由此得到分别整合说明书CN104073471A8/9页10第X因子基因及凝血酶原基因的重组杆状病毒。将得到的病毒分别称为FX单独表达病毒及PTH单独表达病毒。0079（3）维生素K依赖性蛋白质的表达及谷氨酰羧基化0080（31）人第X因子0081（I）人第X因子的表达及谷氨酰羧基化的探讨0082将FX单独表达病毒，和上述的实施例1中制作的各表达病毒混合至病毒效价为11的比率，将其接种于蚕幼虫（品种近秋锦和。从上田蚕种公司购入蚕卵，由SYSMEX株式会社人工饲育至幼虫）。另外，作为对照，仅将FX单独表达病毒接种于蚕幼虫。病毒接种7天后，从感染幼虫提取体液。。

38、为了确认第X因子的表达量，对于得到的体液之一部分，用SDSPAGE及使用抗因子X抗体（ENZYMERESEARCHLABORATORIES公司）的蛋白印迹进行解析。另外，为了检测谷氨酰羧基化的第X因子，对于得到的体液，使用抗GLA结构域抗体（积水MEDICAL株式会社）进行免疫沉降，对于得到的沉降物，用SDSPAGE及使用抗因子X抗体（ENZYMERESEARCHLABORATORIES公司）的蛋白印迹进行解析。结果示于图2。再有，图2的各试验区中的样品如下。0083试验区1GGCX/NQO1共表达病毒及FX单独表达病毒0084试验区2GGCX/VKOR共表达病毒及FX单独表达病毒0085试验。

39、区3GGCX单独表达病毒及FX单独表达病毒0086试验区4NQO1单独表达病毒及FX单独表达病毒0087试验区5VKOR单独表达病毒及FX单独表达病毒0088试验区6FX单独表达病毒0089PC天然型人第X因子（HAEMATOLOGICTECHNOLOGIES公司）0090NC未感染蚕幼虫体液0091从图2A知，在试验区16均确认条带，在第X因子的表达量上未见到大的差异。从图2B知，在感染FX单独表达病毒和GGCX/NQO1共表达病毒的样品（试验区1）中，相比其他样品（试验区26），得到显著高的信号。结果提示，在蚕幼虫中共表达GGCX及NQO1和第X因子时，有效得到谷氨酰羧基化的第X因子。00。

40、92（II）人第X因子的表达量的探讨0093将感染GGCX/NQO1共表达病毒及FX单独表达病毒的蚕幼虫的体液中含的人第X因子的浓度由使用人因子XELISA试剂盒（ASSAYPRO公司）的夹心ELISA法测定。结果得知，在体液中含500G/ML左右的人第X因子。每1只蚕幼虫的体液的回收量是04ML左右，所以预测每1只蚕幼虫的表达量是200G左右。0094（32）关于人凝血酶原0095将PTH单独表达病毒和GGCX/NQO1共表达病毒混合至病毒效价成11的比率，将其接种于蚕蛹（品种近秋锦和。长上田蚕种公司购入蚕卵，由SYSMEX株式会社人工饲育至蛹）。另外，作为对照，仅将PTH单独表达病毒接种于。

41、蚕幼虫。病毒接种7天后，回收感染的蛹，将其于80冷冻。将冷冻的蛹用混合机破碎。将得到的破碎液中的蛹残渣低速离心处理及并通过过滤除去，得到匀浆。为了确认凝血酶原的表达量，对于得到的匀浆之一部分，用SDSPAGE及使用抗凝血酶抗体（NOVUS公司）的蛋白印迹进行解析。另外，为了检测谷氨酰羧基化的凝血酶原，对于得到的体液，使用抗GLA结构域抗体（积水MEDICAL株说明书CN104073471A109/9页11式会社）进行免疫沉降，对于得到的沉降物，用SDSPAGE及使用抗凝血酶抗体（NOVUS公司）的蛋白印迹进行解析。结果示于图3。再有，图3的各试验区中的样品如下。0096试验区1GGCX/NQO。

42、1共表达病毒及PTH单独表达病毒0097试验区2PTH单独表达病毒0098PC天然型人凝血酶原（人血浆来源、CALBIOCHEM公司）0099NC未感染蚕匀浆0100从图3A知，试验区1及2均确认条带，所以凝血酶原的表达量未见大的差异。从图3B得知，在感染PTH单独表达病毒和GGCX/NQO1共表达病毒的样品（试验区1）中，相比其他样品（试验区2）得到显著高的信号。结果提示，在蚕蛹中共表达GGCX及NQO1和凝血酶原时，有效得到谷氨酰羧基化的凝血酶原。0101实施例3蚕中的维生素K依赖性蛋白质的谷氨酰羧基化的条件的探讨0102将上述的实施例2中制作的FX单独表达病毒，和上述的实施例1中制作的各。

43、表达病毒混合至病毒效价成下述比率，将其接种于蚕幼虫（品种近秋锦和。从上田蚕种公司购入蚕卵，由SYSMEX株式会社人工饲育至幼虫）（试验区14）。另外，作为对照，仅将FX单独表达病毒接种于蚕幼虫（试验区5）。0103病毒接种7天后，从感染幼虫提取体液。为了确认第X因子的表达量，对于得到的体液之一部分，用SDSPAGE及使用抗因子X抗体（ENZYMERESEARCHLABORATORIES公司）的蛋白印迹进行解析。另外，为了检测谷氨酰羧基化的第X因子，对于得到的体液，使用抗GLA结构域抗体（积水MEDICAL株式会社）进行免疫沉降，对于得到的沉降物，用SDSPAGE及使用抗因子X抗体（ENZYME。

44、RESEARCHLABORATORIES公司）的蛋白印迹进行解析。结果示于图4。图4的各试验区中的样品如下。0104试验区1GGCX单独表达病毒NQO1单独表达病毒FX单独表达病毒1110105试验区2GGCX单独表达病毒VKOR单独表达病毒FX单独表达病毒1110106试验区3GGCX单独表达病毒NQO1单独表达病毒VKOR单独表达病毒FX单独表达病毒11110107试验区4GGCX/NQO1共表达病毒FX单独表达病毒110108试验区5FX单独表达病毒0109PC天然型人第X因子（HAEMATOLOGICTECHNOLOGIES公司）0110从图4A得知，试验区15均确认条带，所以第X因子。

45、的表达量未见大的差异。从图4B得知，在感染FX单独表达病毒和GGCX/NQO1共表达病毒的样品（试验区1）中，相比其他样品（试验区13及5），得到显著高的信号。从结果得知，在蚕幼虫中，在使用分别单独表达与谷氨酰羧基化相关的各因子（GGCX、NQO1及VKOR）和第X因子的杆状病毒的表达系统中几乎得不到谷氨酰羧基化的第X因子。从而显示，为了有效得到谷氨酰羧基化的第X因子，有使用GGCX基因及NQO1基因整合到相同的杆状病毒的GGCX/NQO1共表达病毒的必要。说明书CN104073471A111/6页1200010002序列表CN104073471A122/6页130003序列表CN104073471A133/6页140004序列表CN104073471A144/6页150005序列表CN104073471A155/6页160006序列表CN104073471A166/6页170007序列表CN104073471A171/3页18图1说明书附图CN104073471A182/3页19图2图3说明书附图CN104073471A193/3页20图4说明书附图CN104073471A20。