相关申请的交叉参考
本申请是于2006年5月16日提交的美国专利申请序列号11/434,726 的继续部分申请，其要求于2005年5月17日提交的美国临时专利申请序 列号60/681,662的优先权，该临时专利申请的全部内容引入本文作为参考。
发明技术领域
本发明涉及可用于治疗神经变性紊乱或减轻其严重性的药物活性化合 物。
背景技术
已通过多种组织病理学、基因和生化研究确立了β-淀粉样肽的长形式、 特别是Aβ(1-42)在阿尔茨海默病的关键作用。参见Selkoe，DJ，Physiol.Rev. 2001，81：741-766，“阿尔茨海默病：基因、蛋白和治疗”(AlzheimeR’s disease：genes，proteins，and therapy)；和Younkin SG，J Physiol Paris.1998， 92：289-92，“Aβ42在阿尔茨海默病中的作用”(The role of A beta 42 in AlzheimeR’s disease)。具体而言，已发现Aβ(1-42)在脑中的沉积是所有形 式阿尔茨海默病的早期和不变的特征。事实上，这发生在可能是阿尔茨海 默病的诊断以前和在A-β的较短基本形式——Aβ(1-40)的沉积以前。参见 Parvathy S等人，Arch Neurol.2001，58：2025-32，“含Aβx-40-、Aβx-42- 和Aβx-43-的淀粉样斑块和认知下降之间的联系”(Correlation between Abetax-40-，Abetax-42-，and Abetax-43-containing amyloid plaques and cognitive decline)。Aβ(1-42)在疾病病因学中的其它牵涉来自如下观察结 果：与早发家族性阿尔茨海默病相关的早老素(γ分泌酶)中的突变一致地导 致Aβ(1-42)水平升高。参见Ishii K等人，Neurosci Lett.1997，228：17-20， “在缺失外显子9和具有PS-1基因中的错义点突变(H163R)的早发家族性 阿尔茨海默病脑中的增加的Aβ42(43)-斑沉积作用”(Increased A beta 42(43)-plaque deposition in early-onset familial AlzheimeR’s disease brains with the deletion of exon 9and the missense point mutation(H163R)in the PS-1gene)。在淀粉样前体蛋白APP中的另外的突变升高了总Aβ，且在一 些情况下仅升高了Aβ(1-42)。参见Kosaka T等人，Neurology，48：741-5， “βAPP717阿尔茨海默突变增加了血浆Aβ42(43)末端β-淀粉样蛋白的百 分数”(The beta APP717 Alzheimer mutation increases the percentage of plasma amyloid-beta protein ending at A beta42(43))。尽管各种APP突变 可影响所沉积Aβ的类型、数量和位置，已发现在脑实质中沉积的占多数 的和初始的种类是长Aβ(Mann)。参见Mann DM等人，Am J Pathol.1996， 148：1257-66，“在阿尔茨海默病和与淀粉样前体蛋白基因突变相关的遗传 性脑出血的情况下β-淀粉样蛋白Aβ42(43)在斑块中的优势沉积” (Predominant deposition of amyloid-beta 42(43)in plaques in cases of AlzheimeR’s disease and hereditary cerebral hemorrhage associated with mutations in the amyloid precursor protein gene)。
在Aβ的早期沉积物中，当大多数所沉积蛋白是无定形或弥漫性斑块 的形式时，事实上所有的Aβ是长形式。参见Gravina SA等人，JBiol Chem， 270：7013-6，“阿尔茨海默病大脑中的β-淀粉样蛋白(Aβ).用对Aβ40或 Aβ42(43)末端形式有特异性的抗体进行的生化和免疫细胞化学分析”； Iwatsubo T等人，Am J Pathol.1996，149：1823-30，“全长β-淀粉样蛋白 (1-42(43))和氨基末端修饰的及截短的β-淀粉样蛋白42(43)在弥漫性斑块中 的沉积”；和Roher AE等人，Proc Natl Acad ScI USA.1993，90：10836-40， “β-淀粉样蛋白(1-42)是脑血管淀粉样沉积物的主要成分：阿尔茨海默病的 病理学启示。Aβ(1-42)的这些初始沉积物然后能种下长形式和短形式Aβ 二者进一步沉积的种子。参见Tamaoka A等人，Biochem Biophys Res Commun.1994，205：834-42，“β-淀粉样蛋白的长尾形式(Aβ1-42/43)作为 在阿尔茨海默病脑沉积物中的种子分子的生化证据”。
在表达Aβ的转基因动物中，沉积物伴有Aβ(1-42)水平的升高，沉积 形式与人类疾病中所见的类似，在人类疾病中，Aβ(1-42)早期沉积、然后 Aβ(1-40)沉积。参见Rockenstein E等人，J Neurosci Res.2001，66：573-82， “在突变APP转基因模型中成熟β-淀粉样蛋白沉积物的早期形成依赖于 Aβ(1-42)的水平”；和Terai K等人，Neuroscience 2001，104：299-310，“在 表达人β-淀粉样蛋白前体的转基因小鼠中的β-淀粉样沉积物具有与阿尔茨 海默病中的那些相同的特征。类似的沉积形式和时机见于其中Aβ表达升 高且沉积作用加速的唐氏综合征患者。参见Iwatsubo T等人，Ann Neurol. 1995，37：294-9，“β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积：在唐氏综合征中Aβ42(43)在Aβ 40之前。
因此，Aβ(1-42)的选择性降低可作为疾病特异性的策略，用于降低所 有形式Aβ的淀粉样蛋白形成的可能性、减缓或停止新的Aβ沉积物的形成、 抑制可溶性毒性Aβ低聚物的形成和由此减缓或停止神经变性的进展。
发明摘要
如本文所述，本发明提供了可用于治疗神经变性紊乱或减轻其严重性 的化合物。本发明还提供了治疗这类紊乱或减轻其严重性的方法，其中所 述方法包括给患者施用本发明的化合物或其组合物。所述方法可用于治疗 例如阿尔茨海默病或减轻其严重性。
附图说明
图1描绘了色谱级分sat14-9和sat14-10的1H NMR谱。
图2描绘了色谱级分sat14-11和sat14-12的1H NMR谱。
图3描绘了色谱级分sat15-1和sat15-2的1H NMR谱。
图4描绘了色谱级分sat15-4和sat15-5的1H NMR谱。
图5描绘了sat15-5的C-18反相HPLC色谱分离的放大图，其中编号 1至5对应于级分sat 16-1至sat16-9的时间窗。
图6描绘了相应于纯度98％的化合物6的级分sat16-3的1H NMR谱。
图7描绘了分离方案2的流程图概要。
图8描绘了黑升麻提取物在半制备型HPLC后的HPLC示踪图。
图9描绘了显示出小的脱酰基峰的化合物6的HPLC示踪图。
图10描绘了化合物6的HPLC示踪图。
图11描绘了脱酰基化合物6的质谱图。
图12描绘了脱酰基化合物6的1H NMR。
图13描绘了化合物6的HPLC示踪图。
图14描绘了化合物6的1H NMR(CD3OD)。
图15描绘了化合物6的质谱图。
图16描绘了按照方案2分离的在205nm检测的化合物6的HPLC示 踪图。
图17描绘了按照方案2分离的在230nm检测的化合物6的HPLC示 踪图。
图18描绘了化合物6在ELSD检测的HPLC。
图19描绘了按照方案2分离的化合物6的1H NMR谱。
图20描绘了按照方案2分离的化合物6的质谱。
图21描绘了IP-MS测定的化合物6对β-淀粉样肽(1-40)、(1-42)、(1-37)、 (1-38)和(1-39)的相对量的影响。
图22描绘了IP-MS测定的化合物6对在野生型和717突变细胞中的β- 淀粉样肽(1-40)、(1-42)、(1-37)、(1-38)和(1-39)的量的影响。
本发明的某些实施方案详述
1.本发明为化合物的概括描述
根据一项实施方案，本发明提供了式I化合物或其可药用盐：
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
n是0-2；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
m是0-2；
R5是T-C(R’)3、T-C(R’)2C(R”)3、R、适宜被保护的羟基基团OR、适 宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团N(R)2、 NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2，或
当R5是T-C(R’)3或T-C(R’)2C(R”)3时，则R6和R5上的R’基团任选 一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
T各自独立地是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的 C1-6亚烷基链，其中T的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、 -N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；
R’和R”各自独立地选自R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
Q是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的C1-6亚烷基 链，其中Q的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、-N(R)-、-S-、 -C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；且
R10是R，适宜被保护的羟基基团，适宜被保护的巯基基团，适宜被保 护的氨基基团，任选被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子 的3-8元饱和单环、部分不饱和单环或芳基单环，任选被取代的具有0-4 个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元饱和双环、部分不饱和双环或 芳基双环，可检测部分，聚合物残基，肽，或者含糖或类糖部分。
根据另一项实施方案，本发明提供了式I化合物或其可药用盐：
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
n是0-2；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
m是0-2；
R5是T-C(R’)3、T-C(R’)2C(R”)3、R、适宜被保护的羟基基团OR、适 宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团N(R)2、 NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2，或：
当R5是T-C(R’)3或T-C(R’)2C(R”)3时，则R6和R5上的R’基团任选 一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
T各自独立地是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的 C1-6亚烷基链，其中T的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、 -N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；
R’和R”各自独立地选自R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
Q是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的C1-6亚烷基 链，其中Q的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、-N(R)-、-S-、 -C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；且
R10是R、适宜被保护的羟基基团、适宜被保护的巯基基团、适宜被保 护的氨基基团、任选被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子 的3-8元饱和单环、部分不饱和单环或芳基单环、任选被取代的具有0-4 个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元饱和双环、部分不饱和双环或 芳基双环，可检测部分，聚合物残基，肽，或者含糖或类糖部分，
条件是所述化合物不是如下化合物：
2.定义
本发明的化合物包括上文概述的那些，并通过本文公开的实施方案、 亚实施方案和种类来进一步地阐述。如本文所用的那样，应当应用下述定 义，另有说明除外。对本发明的目的而言，化学元素按照元素周期表(CAS 版，《化学和物理手册》(Handbook of Chemistry and Physics)，第75版)标识。 另外，有机化学的一般原理在《有机化学》(Organic Chemistry，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999)和《马氏高等有机化学》 (March′s Adcanced Organic Chemistry，第5版，Smith，M.B.和March，J. 编辑，John Wiley & Sons，纽约：2001)中有描述，其全部内容引入本文作为 参考。
如上文所概括定义的，环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是 饱和的、部分不饱和的或芳香性的。应当理解，本发明的化合物是化学上 可行的化合物。因此，本领域普通技术人员将能理解：当环A、环B、环 C、环D和环E中任一个是不饱和的时，则该环上的某个或某些取代基将 不存在以便满足价键的一般原则。例如，如果环D在环D和环E之间的 键上是不饱和的，则R6将不存在。或者，如果环D在环D和环C之间的 键上是不饱和的，则R8和R3将不存在。环A、环B、环C、环D和环E 中任一个的饱和及不饱和情况的所有组合均被本发明所囊括。因此，为了 满足价键的一般原则以及取决于环A、环B、环C、环D和环E中任一个 的饱和及不饱和程度，相应地考虑R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、 R9、R9’、QR10各自的必须存在或不存在。
如本文所述，本发明的化合物可任选地被一个或多个取代基取代，例 如如上文所概括阐述的那样或通过本发明的特定的类别、亚类和种类所示 例的那样。应当理解，术语“任选被取代”可与术语“取代或未取代”互 换使用。通常，无论其前面是否有术语“任选”，术语“(被)取代(的)”指 在指定结构中氢被所示取代基替换。除非另有说明，任选被取代的基团可 以在基团中的各个可取代位置上具有取代基，并且当在任意指定结构中存 在一个以上位置时，可以被一个以上选自所示基团的取代基所取代，取代 基可以在每个位置上相同或不同。包含在本发明中的取代基的组合优选是 可形成稳定的或在化学上可行的化合物的那些。
如本文所用的术语“稳定”指在接受允许其生产、检测和优选其回收、 纯化和用于本文公开的一个或多个目的条件下基本上不改变的化合物。在 一些实施方案中，稳定的化合物或在化学上可行的化合物是当在40℃或更 低温度下、没有湿气或其它化学反应活性条件下保存至少一周时基本上不 变化的那些。
如本文所用的术语“脂肪族”或“脂肪族基团”指完全饱和的或含有 一个或多个不饱和单元的直链(即非支链)或支链的取代或未取代的烃链， 或者完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳香性的单环烃或 双环烃(本文中亦称为“碳环”或“环脂肪族”或“环烷基”)，其与分子 的其它部分单点连接。除非另有说明，脂肪族基团含有1-20个脂肪族碳原 子。在一些实施方案中，脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在其它实 施方案中，脂肪族基团含有1-4个脂肪族碳原子。在一些实施方案中，“环 脂肪族”(或“碳环”或“环烷基”)指完全饱和的或含有一个或多个不饱 和单元、但不是芳香性的单环C3-C8烃或双环C8-C12烃，其与分子的其它 部分单点连接，其中所述双环系统中的任意单独的环具有3-7个成员。适 宜的脂肪族基团包括但不限于直链或支链的、取代或未取代的烷基、链烯 基、炔基及其杂合体如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)链烯基。在 其它实施方案中，脂肪族基团可以有两个孪位氢原子被氧代基(二价羰基氧 原子＝O)替换或者被成环取代基如-O-(直链或支链亚烷基)-O-替换以形成 缩醛或缩酮。
在某些实施方案中，示例性的脂肪族基团包括但不限于乙炔基、2-丙 炔基、1-丙烯基、2-丁烯基、1，3-丁二烯基、2-戊烯基、乙烯基、烯丙基、 异丙烯基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、 戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、己基、异己基、仲己 基、环己基、2-甲基戊基、叔己基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，3- 二甲基丁基和2，3-二甲基丁-2-基。
术语“卤代烷基”、“卤代链烯基”和“卤代烷氧基”指可以被一个 或多个卤素原子取代的烷基、链烯基或烷氧基。术语“卤素”指F、Cl、 Br或I。这些“卤代烷基”、“卤代链烯基”和“卤代烷氧基”基团可具 有两个或更多个卤素取代基，所述卤素取代基可以是相同或不同的卤素并 且可以在相同或不同碳原子上。实例包括氯甲基、全碘甲基、3，3-二氯丙基、 1，3-二氟丁基、三氟甲基和1-溴-2-氯丙基。
如本文所用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环脂肪族”或“杂环 的”指其中一个或多个环成员独立地是所选杂原子的非芳香族、单环、双 环或三环环系。在一些实施方案中，“杂环”、“杂环基”、“杂环脂肪 族”或“杂环的”基团有3至14个环成员，其中一个或多个环成员是独立 地选自氧、硫、氮或磷的杂原子，且体系中的每个环含有3至7个环成员。
术语“杂原子”指氧、硫、氮、磷或硅中的一个或多个(包括氮、硫、 磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或者杂环的可取代的 氮，例如N(如在3，4-二氢-2H-吡咯基)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如 在N-取代的吡咯烷基中)。
如本文所用的术语“不饱和”指具有一个或多个不饱和单元的部分。
如本文所用的术语“烷氧基”或“硫烷基”指通过氧(“烷氧基”)或 硫(“硫烷基”)原子与主碳链连接的如前面所定义的烷基基团。
单独或作为较大基团一部分如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧 基烷基”中使用的术语“芳基”指具有总共5至14个环成员的单环、双环 和三环环系，其中环系中至少一个环是芳香性的并且其中环系中的各环含 有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。术语“芳 基”亦指如下文所定义的杂芳基环系。
单独或作为较大基团一部分如在“杂芳烷基”或“杂芳基烷氧基”中 使用的术语“杂芳基”指具有总共5至14个环成员的单环、双环和三环环 系，其中环系中至少一个环是芳香性的、环系中至少一个环含有一个或多 个杂原子以及其中环系中的各环含有3至7个环成员。术语“杂芳基”可 与术语“杂芳基环”或术语“杂芳族”互换使用。
芳基(包括芳烷基、芳烷氧基、芳基氧基烷基等)或杂芳基(包括杂芳烷 基和杂芳基烷氧基等)基团可以含有一个或多个取代基。在芳基或杂芳基的 不饱和碳原子上的适宜取代基选自卤素、N3、CN、Ro、ORo、SRo、1，2- 亚甲二氧基、1，2-亚乙二氧基、任选被Ro取代的苯基(Ph)、任选被Ro取代 的-O(Ph)、任选被Ro取代的(CH2)1-2(Ph)、任选被Ro取代的CH＝CH(Ph)、 NO2、CN、N(Ro)2、NRoC(O)Ro、NRoC(O)N(Ro)2、NRoCO2Ro、 -NRoNRoC(O)Ro、NRoNRoC(O)N(Ro)2、NRoNRoCO2Ro、C(O)C(O)Ro、 C(O)CH2C(O)Ro、CO2Ro、C(O)Ro、C(O)N(Ro)2、OC(O)N(Ro)2、S(O)2Ro、 SO2N(Ro)2、S(O)Ro、NRoSO2N(Ro)2、NRoSO2Ro、C(＝S)N(Ro)2、 C(＝NH)-N(Ro)2或(CH2)0-2NHC(O)Ro，其中每个单独出现的Ro选自氢、任 选被取代的C1-6脂肪族基团、未取代的5-6元杂芳基或杂环基环、苯基、 O(Ph)或CH2(Ph)，或者尽管有以上定义，在相同取代基或不同取代基上的 两次独立出现的Ro与每个Ro基团所结合的原子一起形成具有0至4个独 立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环。 Ro的脂肪族基团上的任选取代基选自N3、CN、NH2、NH(C1-4脂肪族基团)、 N(C1-4脂肪族基团)2、卤素、C1-4脂肪族基团、OH、O(C1-4脂肪族基团)、 NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂肪族基团)、O(卤代C1-4脂肪族基团)或卤 代C1-4脂肪族基团，其中上述的Ro的C1-4脂肪族基团各自是未取代的。
脂肪族或杂脂肪族基团或非芳香族杂环可含有一个或多个取代基。脂 肪族或杂脂肪族基团或非芳香族杂环的饱和碳上的适宜取代基选自上文对 芳基或杂芳基的不饱和碳所列举的那些，还另外包括：＝O、＝S、＝NNHR＊、 ＝NN(R＊)2、＝NNHC(O)R＊、＝NNHCO2(烷基)、＝NNHSO2(烷基)或＝NR＊， 其中R＊各自独立地选自氢或任选被取代的C1-6脂肪族基团。R＊的脂肪族基 团上的任选取代基选自NH2、NH(C1-4脂肪族基团)、N(C1-4脂肪族基团)2、 卤素、C1-4脂肪族基团、OH、O(C1-4脂肪族基团)、NO2、CN、CO2H、 CO2(C1-4脂肪族基团)、O(卤代C1-4脂肪族基团)或卤代(C1-4脂肪族基团)， 其中上述的R＊的C1-4脂肪族基团各自是未取代的。
非芳香族条环的氮上的任选取代基选自R+、N(R+)2、C(O)R+、CO2R+、 C(O)C(O)R+、C(O)CH2C(O)R+、SO2R+、SO2N(R+)2、C(＝S)N(R+)2、 C(＝NH)-N(R+)2或NR+SO2R+，其中R+是氢、任选被取代的C1-6脂肪族基 团、任选被取代的苯基、任选被取代的O(Ph)、任选被取代的CH2(Ph)、 任选被取代的(CH2)1-2(Ph)、任选被取代的CH＝CH(Ph)或者具有1至4个 独立地选自氧、氮或硫的杂原子的未取代的5-6元杂芳基或杂环，或者尽 管有以上定义，相同取代基或不同取代基上的两次独立出现的R+与各R+基团所连接的原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的 3-8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环。R+的脂肪族基团或苯基环上的 任选取代基选自NH2、NH(C1-4脂肪族基团)、N(C1-4脂肪族基团)2、卤素、 C1-4脂肪族基团、OH、O(C1-4脂肪族基团)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂肪族基团)、O(卤代C1-4脂肪族基团)或卤代(C1-4脂肪族基团)，其中上述 的R+的C1-4脂肪族基团各自是未取代的。
如上文所详述的，在一些实施方案中，两次独立出现的Ro (或R+，或 本文所类似定义的任意其它变量)与各变量所连接的原子一起形成具有0-4 个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳 基环。当两次独立出现的Ro(或R+，或本文所类似定义的任意其它变量) 与各变量所连接的原子一起形成的示例性环包括但不限于以下情况：a)与 相同原子连接并且与该原子一起形成环的两次独立出现的Ro(或R+，或本 文所类似定义的任意其它变量)，例如N(Ro)2，其中两个出现的Ro与氮原 子一起形成哌啶-1-基、哌嗪-1-基或吗啉-4-基；和b)与不同原子连接并且 与这些原子一起形成环的两次独立出现的Ro(或R+，或本文所类似定义的 任意其它变量)，例如被两次出现的ORo取代的苯基基团这 些两次出现的Ro与它们连接的氧原子一起形成稠合的6-元含氧环： 可以理解，当两次独立出现的Ro(或R+，或本文所类似定义 的任意其它变量)与各变量所连接的原子一起可形成多种其它环，并且上文 详述的实例不是限制性的。
如本文所用的术语“可检测部分”可与术语“标记物”互换使用，其 涉及能够被检测的任何部分，例如主标记物或次标记物。主标记物如放射 性同位素(例如32P、33P、35S或14C)、质量标记物(mass-tags)和荧光标记物 是未经进一步修饰可被检测的产生信号的报道基团。
如本文所用的术语“次标记物”指需要存在用于产生可检测信号的第 二中间体部分如生物素和各种蛋白抗原。对于生物素，第二中间体可包括 链霉抗生物素-酶结合物。对于抗原标记物，第二中间体可包括抗体-酶结 合物。一些荧光基团充当次标记物，因为它们在非放射性荧光共振能量转 移(FRET)过程中转移能量给其它基团，并且第二个基团产生检测信号。
如本文所用的术语“荧光标记物”、“荧光染料”和“荧光团”指在 指定激发波长下吸收光能并在不同波长下发射光能的部分。荧光标记物的 实例包括但不限于：Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、AMCA、AMCA-S、 BODIPY染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、 BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、 BODIPY 581/591、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665)、羧基罗丹明6G、 羧基-X-罗丹明(ROX)、Cascade蓝、Cascade黄、香豆素343、花青染料 (Cy3、Cy5、Cy3.5和Cy5.5)、丹酰、Dapoxyl、二烷基氨基香豆素、4′，5′- 二氯-2′，7′-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、曙红、赤藓红、荧光素、FAM、 羟基香豆素、IR染料(IRD 40、IRD 700和IRD 800)、JOE、丽丝胺罗丹 明B、Marina蓝、甲氧基香豆素、萘并荧光素、俄勒冈绿488、俄勒冈绿 500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗 丹明绿、罗丹明红、Rhodol绿、2′，4′，5′，7′-四-溴代砜-荧光素、四甲基-罗 丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、德克萨斯红、德克萨斯红-X。
如本文所用的术语“质量标记物”指能够由于其质量而使用质谱(MS) 检测技术被独特地检测出的任意部分。质量标记物的实例包括电泳释放标 记物，例如N-[3-[4′-[(对甲氧基四氟苄基)氧基]苯基]-3-甲基甘油酰基]六氢 异烟酸、4′-[2，3，5，6-四氟-4-(五氟苯氧基)甲基苯乙酮，及其衍生物。这些质 量标记物的合成和使用描述于美国专利4,650,750、4,709,016、5,360,8191、 5,516,931、5,602,273、5,604,104、5,610,020和5,650,270中。质量标记物 的其它实例包括但不限于核苷酸、双脱氧核苷酸、不同长度和碱基组成的 寡核苷酸、寡肽、寡糖和其它不同长度和单体组成的合成聚合物。适当质 量范围(100-2000道尔顿)的中性和带电荷的大量有机分子(生物分子或合成 化合物)亦可用作质量标记物。
如本文所用的术语“底物”指本发明化合物的功能化端基可与之连接 的任意物质或大分子复合物。常用底物的实例包括但不限于：玻璃表面、 硅石表面、塑料表面、金属表面、含金属或化学涂层的表面、膜(例如尼龙、 聚砜或硅石)、微珠(例如胶乳、聚苯乙烯或其它聚合物)、多孔聚合物基质(例 如聚丙烯酰胺凝胶、多糖或聚甲基丙烯酸酯)和大分子复合物(例如蛋白质 或多糖)。
除非另有说明，本文描绘的结构亦指包括该结构的所有异构形式(例如 对映异构形式、非对映异构形式和几何(或构象)形式)；例如，各不对称中 心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体，以及(Z)和(E)构象异构体。因此， 本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构的、非对映异构的和几 何(或构象)异构的混合物在本发明的范围内。
除非另有说明，本发明化合物的所有互变异构形式在本发明的范围内。
另外，除非另有说明，本文描绘的结构亦指包括区别仅在于存在一种 或多种富集同位素原子的化合物。例如，具有现有结构的、除了氢被氘或 氚替换或者碳被富13C或14C的碳替换的化合物在本发明的范围内。这类 化合物可用作例如生物分析的分析工具或探针。
3.示例性化合物的说明
如上文所概括定义的，式I的G部分是S、CH2、NR或O。在某些实 施方案中，式I的G部分是O。
如上文所概括定义的，式I的R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被 保护的羟基基团OR、适宜被保护的巯基基团SR、适宜被保护的氨基基团 NR2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的 3-7元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在某些实施方案中，式I的R1和 R2各自独立地是R或OR。在其它实施方案中，式I的R1和R2各自独立地 是R，其中R是氢或任选被取代的C1-6脂肪族基团。根据本发明的其它方 面，式I的R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的 3-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。本发明的又一方面提供了式I化合 物，其中R1和R2一起形成3-6元饱和碳环。在其它实施方案中，式I的 R1和R2一起形成环丙基环。
在某些实施方案中，式I的n部分是0-1。在其它实施方案中，式I的n 部分是1。
如上文所概括定义的，式I的R5基团是R5，是T-C(R’)3、 T-C(R’)2C(R”)3、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被保护的巯基基团 SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2，其中T各自独立地是价键或任选被取代的直链或支链的、 饱和或不饱和的C1-6亚烷基链，其中T的最多两个亚甲基单元任选地和独 立地被-O-、-N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换。在某些实施方案 中，T各自独立地是价键或者直链或支链C1-4亚烷基链，其中T的一个亚 甲基单元任选地被-O-、-N(R)-或-S-替换。在其它实施方案中，T各自独立 地是价键或者直链或支链C1-4亚烷基链。在其它实施方案中，T各自是价 键。
当式I的R5基团是T-C(R’)3或T-C(R’)2C(R”)3时，R’和R”各自独立 地选自R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、 NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或 O(CO)N(R)2。在某些实施方案中，R’和R”各自独立地是R、OR、O(C)OR、 SR或N(R)2。在其它实施方案中，R’和R”各自独立地是R、OR或O(C)OR。 示例性的R’和R”基团包括氢、CH3、OH和OC(O)CH3。
如上文所概括定义的，当R5是T-C(R’)3或T-CH(R’)C(R”)3时，则 R6和R5上的R’基团任选一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂 原子的3-8元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在某些实施方案中，R5是 T-C(R’)3或T-C(R’)2C(R”)3，且R6和R5上的R’基团一起形成具有1-2个 独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-7元饱和环。在其它实施方案中，R5是T-C(R’)3或T-C(R’)2C(R”)3，且R6和R5上的R’基团一起形成具有1 个氧原子的6元饱和环。当T是价键时，这些化合物当R5是T-C(R’)3时 具有式IIa结构，当R5是T-C(R’)2C(R”)3时具有式IIb结构：
其中R’、R”、R1、R2、R3、R4、R7、R8、R9、R9’、Q和R10各自如上文 以及如上文及本文所定义的类和亚类中所概括定义的那样。
如上文所概括定义的，式I的R5基团尤其是适宜被保护的羟基基团、 适宜被保护的巯基基团或适宜被保护的氨基基团。羟基保护基团在本领域 上是熟知的，包括《有机合成中的保护基团》(“Protecting Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley & Sons， 1999)中所详细描述的那些，该文献整体引入本文作为参考。式I的R5基 团的适宜被保护的羟基基团的实例进一步包括但不限于酯、烯丙基醚、醚、 甲硅烷基醚、烷基醚、芳基烷基醚和烷氧基烷基醚。这类酯的实例包括甲 酸酯、乙酸酯、碳酸酯和磺酸酯。特定的实例包括甲酸酯、苯甲酰基甲酸 酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯 苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4，4-(亚乙基二硫基)戊酸酯、 新戊酸酯(三甲基乙酰基)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对 苄基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯以及碳酸酯如甲基、9-芴基甲基、乙 基、2，2，2-三氯乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、乙烯 基、烯丙基和对硝基苄基。这类甲硅烷基醚的实例包括三甲基甲硅烷基、 三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异 丙基甲硅烷基和其它三烷基甲硅烷基醚。烷基醚包括甲基、苄基、对甲氧 基苄基、3，4-二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基、烯丙基和烯丙氧基羰基醚 或衍生物。烷氧基烷基醚包括缩醛如甲氧基甲基、甲硫基甲基、(2-甲氧基 乙氧基)甲基、苄氧基甲基、β-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基和四氢吡喃基 醚。芳基烷基醚的实例包括苄基、对甲氧基苄基(MPM)、3，4-二甲氧基苄 基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基、 2-和4-皮考基。
巯基保护基团在本领域是熟知的，包括《有机合成中的保护基团》 (“Protecting Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene和P.G.M.Wuts， 第3版，John Wiley & Sons，1999)中所详细描述的那些，该文献整体引入本 文作为参考。式I的R5部分的适宜的巯基保护基团包括但不限于二硫化物、 硫醚、甲硅烷基硫醚、硫代酸酯、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯等。这类 基团的实例包括但不限于烷基硫醚、苄基和取代的苄基硫醚、三苯基甲基 硫醚、三氯乙氧基羰基，以上提到的只是一小部分。
根据本发明的其它方面，式I的R5部分是在中性条件下可除去、例如 用AgNO3、HgCl2等可除去的巯基保护基团。其它中性条件包括使用适宜 的还原剂进行还原。适宜的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、连 二亚硫酸盐、还原型谷胱甘肽、还原型谷氧还蛋白、还原型硫氧还蛋白、 取代的膦如三羧基乙基膦(TCEP)和任意基于肽或有机基础的还其它原剂， 或者本领域普通技术人员熟知的其它试剂。根据本发明的其它方面，式I 的R5部分是“可光裂解”的巯基保护基团。这类适宜的巯基保护基团是本 领域已知的，包括但不限于硝基苄基基团、四氢吡喃基(THP)基团、三苯 甲基基团、-CH2SCH3(MTM)、二甲基甲氧基甲基或-CH2-S-S-吡啶-2-基。 本领域普通技术人员将知道如本文所述的适宜羟基保护基团中有多种也适 合用作巯基保护基团。
在某些实施方案中，式I的R5基团是适宜被保护的氨基基团。氨基保 护基团在本领域是熟知的，包括《有机合成中的保护基团》(“Protecting Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版， John Wiley & Sons，1999)中所详细描述的那些，该文献整体引入本文作为 参考。所述R5部分的适宜的氨基保护基团进一步包括但不限于芳烷基胺、 氨基甲酸酯、环亚胺、烯丙基胺、酰胺等。这类基团的实例包括叔丁氧羰 基(BOC)、乙氧羰基、甲氧羰基、三氯乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、 苄氧羰基(CBZ)、烯丙基、邻苯二甲酰亚胺、苄基(Bn)、芴基甲基羰基 (Fmoc)、甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、苯基乙 酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。在某些实施方案中，R5部分的氨基保护 基团是邻苯二甲酰亚氨基。在其它实施方案中，R5部分的氨基保护基团是 叔丁氧羰基(BOC)基团。
如上文所概括定义的，式I的Q基团是价键或任选被取代的直链或支 链的、饱和或不饱和的C1-4亚烷基链，其中Q的最多两个亚甲基单元任选 地和独立地被-O-、-N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换。在某些实 施方案中，Q是任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的C1-2亚烷基 链，其中Q的最多一个亚甲基单元任选地被-O-、-N(R)-或-S-替换。在其 它实施方案中，Q是-O-。
如上文所概括定义的，式I的R10基团是R，适宜被保护的羟基基团， 适宜被保护的巯基基团，适宜被保护的氨基基团，任选被取代的具有0-4 个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和单环、部分不饱和单环或 芳基单环，任选被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10 元饱和双环、部分不饱和双环或芳基双环，可检测部分，聚合物残基，肽， 或者含糖基团或类糖部分。
在某些实施方案中，式I的R10基团是含糖基团。这类含糖基团是本 领域普通技术人员熟知的，包括Varki，A等人编辑的《糖生物学基础》 (“Essentials of Glycobiology”，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2002)中 所详细描述的那些。在某些实施方案中，式I的R10基团是糖苷。示例性 的R10基团包括阿拉伯吡喃糖苷(arabinopyranosides)和木吡喃糖苷 (xylopyranosides)。在某些实施方案中，式I的R10基团是木吡喃糖苷。在 某些实施方案中，式I的R10基团是阿拉伯吡喃糖苷。在其它实施方案中， 式I的R10基团是根据另一项实施方案，式I的R10基团是 另一项实施方案提供了其中R10是的式I化合物。
根据本发明的其它方面，式I的R10基团是糖类似物。这类糖类似物 是本领域普通技术人员熟知的，包括《糖生物学基础》(“Essentials of Glycobiology”)中所详细描述的那些。例如，本发明的糖类似物基团包括环 多醇等。在某些实施方案中，R10是环多醇部分，其中所述环多醇是在三个 或更多个环原子上各自含有一个羟基的环烷烃，如IUPAC规则所定义的 那样。在其它实施方案中，这类环多醇部分包括肌醇如鲨肌醇 (scylloinositol)。
另外，式I的R10基团的适宜的类糖部分包括非环状糖基团。这类基 团包括直链alkytols和赤藓糖醇，以上提到的只是一小部分。应当理解， 糖基团可以以环状或非环状形式存在。因此，糖基团的非环状形式也作为 式I的R10基团的适宜类糖部分包括在本发明中。
在某些实施方案中，式I的R10基团是可检测部分。在其它实施方案 中，式I的R10基团是在上文中如本文所定义的荧光标记物、荧光染料或 荧光团。
根据本发明的另一方面，式I的R10基团是聚合物残基。聚合物残基 是本领域熟知的，包括《蛋白质结合和交联化学》(“Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking”，Shan S.Wong，CRC出版社.Boca Raton， 佛罗里达州，1991)中详细描述的那些。式I的R10基团的适宜聚合物残基包 括聚(氧化烯)如PEG、聚(氨基酸)和能与本发明化合物结合的其它聚合物 残基。
如上文所概括定义的，式I的R10基团尤其是适宜被保护的羟基基团、 适宜被保护的巯基基团、适宜被保护的氨基基团。羟基保护基团是本领域 熟知的，包括《有机合成中的保护基团》(“Protecting Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley & Sons， 1999)中所详细描述的那些，该文献整体引入本文作为参考。式I的R10基 团的适宜羟基保护基团的实例进一步包括但不限于酯、烯丙基醚、醚、甲 硅烷基醚、烷基醚、芳基烷基醚和烷氧基烷基醚。这类酯的实例包括甲酸 酯、乙酸酯、碳酸酯和磺酸酯。特定的实例包括甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、 氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯苯氧 基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4，4-(亚乙基二硫基)戊酸酯、新 戊酸酯(三甲基乙酰基)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苄 基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯、碳酸酯如甲基、9-芴基甲基、乙基、 2，2，2-三氯乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、乙烯基、 烯丙基和对硝基苄基。这类甲硅烷基醚的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙 基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基 甲硅烷基和其它三烷基甲硅烷基醚。烷基醚包括甲基、苄基、对甲氧基苄 基、3，4-二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基、烯丙基和烯丙氧基羰基醚或衍 生物。烷氧基烷基醚包括缩醛如甲氧基甲基、甲硫基甲基、(2-甲氧基乙氧 基)甲基、苄氧基甲基、β-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基和四氢吡喃基醚。 芳基烷基醚的实例包括苄基、对甲氧基苄基(MPM)、3，4-二甲氧基苄基、 邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基、2- 和4-皮考基。
巯基保护基团在本领域是熟知的，包括《有机合成中的保护基团》 (“Protecting Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene和P.G.M.Wuts， 第3版，John Wiley & Sons，1999)中所详细描述的那些，该文献整体引入本 文作为参考。式I的R10部分的适宜的巯基保护基团包括但不限于二硫化 物、硫醚、甲硅烷基硫醚、硫代酸酯、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯等。 这类基团的实例包括但不限于烷基硫醚、苄基和取代的苄基硫醚、三苯基 甲基硫醚、三氯乙氧基羰基，以上提到的只是一小部分。
根据本发明的其它方面，式I的R10部分是在中性条件下可除去、例 如用AgNO3、HgCl2等可除去的巯基保护基团。其它中性条件包括使用适 宜的还原剂进行还原。适宜的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、 连二亚硫酸盐、还原型谷胱甘肽、还原型谷氧还蛋白、还原型硫氧还蛋白、 取代的膦如三羧基乙基膦(TCEP)和任意基于肽或有机基础的还其它原剂， 或者本领域普通技术人员熟知的其它试剂。根据本发明的其它方面，式I 的R10部分是“可光裂解”的巯基保护基团。这类适宜的巯基保护基团是 本领域已知的，包括但不限于硝基苄基基团、四氢吡喃基(THP)基团、三 苯甲基基团、-CH2SCH3(MTM)、二甲基甲氧基甲基或-CH2-S-S-吡啶-2- 基。本领域普通技术人员将知道如本文所述的适宜羟基保护基团中有多种 也适合用作巯基保护基团。
在某些实施方案中，式I的R10基团是适宜被保护的氨基基团。氨基 保护基团在本领域是熟知的，包括《有机合成中的保护基团》(“Protecting Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版， John Wiley & Sons，1999)中所详细描述的那些，该文献整体引入本文作为 参考。所述R10部分的适宜的氨基保护基团进一步包括但不限于芳烷基胺、 氨基甲酸酯、环亚胺、烯丙基胺、酰胺等。这类基团的实例包括叔丁氧羰 基(BOC)、乙氧羰基、甲氧羰基、三氯乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、 苄氧羰基(CBZ)、烯丙基、邻苯二甲酰亚胺、苄基(Bn)、芴基甲基羰基 (Fmoc)、甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、苯基乙 酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。在某些实施方案中，R10部分的氨基保护 基团是邻苯二甲酰亚氨基。在其它实施方案中，R10部分的氨基保护基团是 叔丁氧羰基(BOC)基团。
在某些实施方案中，本发明提供了式I化合物，其中所述化合物不是 以下化合物中的任意一种、两种或全部三种：
包括其各自的立体异构体。
如上文所概述的，本发明提供了式I化合物或其可药用盐，
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中所定义的那样。 在某些实施方案中，本发明提供了具有如式I-a所示立体化学的式I化合 物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式I的R1和R2基团一起形成具有0-2个独立地 选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在其 它实施方案中，式I的R1和R2基团一起形成具有0-2个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的3-6元饱和环。在其它实施方案中，式I的R1和R2基 团一起形成3-6元饱和碳环。根据本发明的另一个方面，提供了式I-b化 合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。在其它实施方案中，本发明提供了式I-c化合物或其可药用 盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
如上文所概括定义的，环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是 饱和的、部分不饱和的或芳香性的。在某些实施方案中，环B是不饱和的 且R1和R2不存在，由此形成式II化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式II的n基团是0-1和式II的G基团是氧。
根据另一方面，本发明提供了式II-a化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式II-a的n基团是0-1和式II-a的G基团是氧。
在其它实施方案中，环B和环D均为不饱和的且R1、R2和R6不存在， 由此形成式III化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式III的n基团是0-1和式III的G基团是氧。
根据另一项实施方案，本发明提供了式IV化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。如本文所用的表示单键或双键。本领域普通技术人员可 以理解，当表示双键时，则R6不存在。相反地，当表示单键时， 则R6存在。因此，在某些实施方案中，表示双键且R6不存在。在某 些实施方案中，表示单键且R6如上文所定义。
根据另一方面，本发明提供了式IV-a的化合物或其可药用盐，
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式IV-a的G基团是氧。在其它实施方案中，式 IV-a的R4基团是R或适宜被保护的羟基基团OR。在其它实施方案中， 式IV-a的R4基团是R。
本发明的另一方面涉及式IV-b化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式IV-b的R1和R2基团一起形成具有0-2个独立 地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在 其它实施方案中，式IV-b的R1和R2基团一起形成具有0-2个独立地选自 氮、氧或硫的杂原子的3-6元饱和环。在其它实施方案中，式IV-b的R1和R2基团一起形成3-6元饱和碳环。根据本发明的另一个方面，提供了式 IV-c化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式IV-c的R7基团是-OH。
根据本发明的另一方面，提供了IV-d化合物或其可药用盐：
其中各变量如上文以及如上文及本文所定义的类和亚类中对式I化合物所 定义的那样。
在某些实施方案中，式IV-d的R7基团是-OH。
在一项实施方案中，本发明提供了式V化合物或其可药用盐：
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
n是0-2；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
m是0-2；
R5是T-C(R’)3、T-C(R’)2C(R”)3、R、适宜被保护的羟基基团OR、适 宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团N(R)2、 NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2，或
T各自独立地是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的 C1-6亚烷基链，其中T的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、 -N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；
R’和R”各自独立地选自R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
Q是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的C1-6亚烷基 链，其中Q的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、-N(R)-、-S-、 -C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换。
本文描述的式I化合物的实施方案单独地和组合地应用于式V化合物 的各个变量。
在某项实施方案中，Q是-O-。在其它实施方案中，Q是-NH-。
在其它实施方案中，本发明提供了制备式V-a化合物或其可药用盐的 方法，
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
n是0-2；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
m是0-2；
R5是T-C(R’)3、T-C(R’)2C(R”)3、R、适宜被保护的羟基基团OR、适 宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团N(R)2、 NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2，或
T各自独立地是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的 C1-6亚烷基链，其中T的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、 -N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；
R’和R”各自独立地选自R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；且
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
该方法包括如下步骤：
(a)提供式V-b化合物或其可药用盐，
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
n是0-2；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
m是0-2；
R5是T-C(R’)3、T-C(R’)2C(R”)3、R、适宜被保护的羟基基团OR、适 宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团N(R)2、 NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2，或
T各自独立地是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的 C1-6亚烷基链，其中T的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、 -N(R)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；
R’和R”各自独立地选自R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；且
R10是含糖或类糖部分，和
(b)用适宜的酶处理式V-b化合物以形成式V-a化合物。
本文描述的实施方案单独地和组合地应用于式V-a和V-b化合物的变 量。
如本文所用的术语“适宜的酶”指能够除去式V-b化合物的R10糖部 分以形成式V-a化合物、即能够水解糖苷键的任意酶。这类酶是本领域技 术人员已知的。在某些实施方案中，适宜的酶有纤维素酶、木聚糖酶、木 糖苷酶、甘草酸水解酶或葡糖醛酸酶。在某些实施方案中，适宜的酶有纤 维素酶。在其它实施方案中，式V-b的R10基团的糖部分是阿拉伯吡喃糖 苷或木吡喃糖苷。该转化的细节在下文实施例部分中给出。
在某些实施方案中，本发明提供了任意的式V-c、V-d、V-e、V-f、V-g 或V-h化合物或其可药用盐：
其中各变量如本文式I化合物中所定义。
根据另一方面，本发明提供了式VI化合物或其可药用盐：
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
Q是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的C1-6亚烷基 链，其中Q的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、-N(R)-、-S-、 -C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；且
R10是R，适宜被保护的羟基基团，适宜被保护的巯基基团，适宜被保 护的氨基基团，任选被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子 的3-8元饱和单环、部分不饱和单环或芳基单环、任选被取代的具有0-4 个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元饱和双环、部分不饱和双环或 芳基双环，可检测部分，聚合物残基，肽，或者含糖或类糖部分。
本文描述的有关式I化合物的实施方案单独地和组合地应用于式VI 化合物。
在其它实施方案中，本发明提供了制备式VI化合物或其可药用盐的 方法：
其中：
环A、环B、环C、环D和环E各自独立地是饱和的、部分不饱和的 或芳香性的；
G是S、CH2、NR或O；
R1和R2各自独立地是卤素、R、适宜被保护的羟基基团OR、适宜被 保护的巯基基团SR或适宜被保护的氨基基团N(R)2，或者R1和R2一起形 成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部分不饱 和环或芳基环；
R各自独立地是氢，任选被取代的C1-6脂肪族基团，或任选被取代的 具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环，其中在相同氮原子上的两个R任选地与所述氮原子一起形成 具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和环、部分不饱和 环或芳基环；
R3、R4、R7和R8各自独立地选自卤素、R、适宜被保护的羟基基团 OR、适宜被保护的巯基基团SR、SO2R、OSO2R、适宜被保护的氨基基团 N(R)2、NR(CO)R、NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、 O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R6是卤素、R、OR、SR、SO2R、OSO2R、N(R)2、NR(CO)R、 NR(CO)(CO)R、NR(CO)N(R)2、NR(CO)OR、(CO)OR、O(CO)R、(CO)N(R)2或O(CO)N(R)2；
R9和R9’各自独立地选自卤素、R、OR、SR或N(R)2，或者R1和R2一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和环、部 分不饱和环或芳基环；
Q是价键或任选被取代的直链或支链的、饱和或不饱和的C1-6亚烷基 链，其中Q的最多两个亚甲基单元任选地和独立地被-O-、-N(R)-、-S-、 -C(O)-、-S(O)-或-S(O)2-替换；且
R10是R，适宜被保护的羟基基团，适宜被保护的巯基基团，适宜被保 护的氨基基团，任选被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子 的3-8元饱和单环、部分不饱和单环或芳基单环，任选被取代的具有0-4 个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元饱和双环、部分不饱和双环或 芳基双环，可检测部分，聚合物残基，肽，或者含糖或类糖部分，
该方法包括如下步骤：
(a)提供式VI-a化合物或其盐，
其中各变量如上文对式VI化合物中所定义，和
(b)除去式VI-a化合物中的乙酰基以形成式VI化合物。
本文描述的有关式I化合物的实施方案单独地和组合地应用于式VI-a 化合物。
在某些实施方案中，步骤(b)中乙酰基的除去通过用适宜的碱处理来完 成。在其它实施方案中，步骤(b)中乙酰基的除去通过在适宜溶剂中加热来 完成。在另一项实施方案中，步骤(b)中乙酰基的除去通过在约40至约 115℃加热来完成。在其它实施方案中，步骤(b)在约60至约90℃下进行。
适宜的溶剂是可以促进反应进程的单一溶剂或溶剂混合物。适宜的溶 剂可以溶解一种或多种反应组分，或者，适宜的溶剂可以促进一种或多种 反应组分的混悬液的振摇。可用于本发明的适宜溶剂的实例有质子溶剂、 卤代烃、醚、酯、芳香烃、极性或非极性非质子溶剂或它们的任意混合物。 这类混合物包括例如质子和非质子溶剂的混合物，如苯/甲醇/水；苯/水； DME/水等。在某些实施方案中，适宜的溶剂是极性非质子溶剂如醇。
适宜的碱是碱性足以除去式VI-a化合物的乙酰基以形成式VI化合物 的试剂。在某些实施方案中，适宜的碱是适宜的溶剂自身。例如，发现式 VI-a化合物的甲醇溶液的碱性足以除去乙酰基以形成式VI化合物。该转 化的细节在下文实施例部分中给出。在其它实施方案中，适宜的溶剂是有 机碱。在另一项实施方案中，适宜的碱是碱金属或碱土金属的醇盐或氢氧 化物。这类碱包括甲醇钠或氢氧化钠。在其它实施方案中，适宜的碱是氨。
在某些实施方案中，本发明提供了式VII或VIII化合物或其可药用盐，
其中各变量如本文对式I化合物中所定义。
在其它实施方案中，本发明提供了式IX或X化合物或其可药用盐，
其中各变量如本文对式I化合物中所定义。
本发明的示例性化合物列于下表1中：
表1.示例性的式I化合物
示例性的式IVa和V-g化合物列于下表2中：
4.提供本发明化合物的通用方法
通常而言，本发明的化合物可通过本领域技术人员已知用于类似化合 物的合成和/或半合成方法和通过下文实施例中详述的方法来制备或分离。
活性组分的分离
本发明的某些化合物是从黑升麻根、也称作总状升麻(cimicifuga racemosa)或总状类叶升麻(actaea racemosa)中分离的，阐明了这些化合物 的结构。可以获得黑升麻根的市售提取物、粉末和胶囊用于治疗各种绝经 和妇科紊乱。但是，已经出人意料地发现：存在于黑升麻根中的某些化合 物可用于调节和/或抑制β-淀粉样肽的生成。具体而言，已经从黑升麻根中 分离出并鉴定了某些化合物，其中，这些化合物可用于调节和/或抑制β- 淀粉样肽、特别是β-淀粉样肽(1-42)的生成。这些化合物被式I所囊括。这 些化合物可以以基本上不含通常见于根中的其它化合物的形式被分离出和 使用。或者，可以由根制备提取物，其中所述提取物富含本发明的化合物。
如上文和此处所述，本发明的某些化合物是从种植的或野生的黑升麻 根和根茎的标准提取物中分离出的。可以理解，该化合物也可以从在培养 基中生长的植物根组织或者从植物组织培养物的培养基中分离出。在培养 基中生长植物根组织的这些方法是本领域普通技术人员熟知的，包括 Pauline M.Doran编辑、哈伍德(Harwood)学术出版社出版的《发根、培养 和应用》(“Hairy Roots，Culture and Applications”，荷兰阿姆斯特丹，1997 年版权OPA(Overseas Publishers Association).阿姆斯特丹B.V.ISBN 90-5702-117-X)中所述的那些，该文献整体引入本文作为参考。
或者，本发明的化合物可通过半合成方法、以黑升麻和相关升麻属种 (无论是来自这些植物的根和根茎还是地上部分)的提取物中所存在的其它 化合物为原料而制得。本领域技术人员将认识到，合成前体可以由一种或 多种升麻属种获得，包括但不限于总状升麻(Cimicifuga racemosa)、兴安升 麻(Cimicifuga dahurica)、升麻(Cimicifuga foetida)、大三叶升麻(Cimicifuga heracleifolia)、小升麻(Cimicifuga japonica)、Cimicifuga acerina、Cimicifuga acerima、单穗升麻(Cimicifuga simplex)和Cimicifuga elata、Cimicifuga calthaefolia、Cimicifuga frigida、Cimicifuga laciniata、Cimicifuga mairei、 Cimicifuga rubifolia、Cimicifuga americana、Cimicifuga biternata和 Cimicifuga bifida或它们的变体。这可通过所分离的化合物或提取级分或化 合物的混合物进行化学或生物转化而实现。化学转化可通过温度、pH操作 和/或用各种溶剂进行处理来实现，但不限于此。生物转化可通过用植物组 织、植物组织提取物、其它微生物学生物体或者由任意生物体分离的酶处 理所分离的化合物或提取级分或化合物的混合物来实现，但不限于此。
在某些实施方案中，本发明提供了黑升麻根提取物，其中所述提取物 包含至少10％重量的本发明的化合物。在其它实施方案中，本发明提供了 黑升麻根提取物，其中所述提取物包含约10％重量至约50％重量的本发明 的化合物。在其它实施方案中，本发明提供了黑升麻根提取物，其中所述 提取物包含约10％重量至约50％重量的本发明的化合物，其中所述提取物 基本上不含黄肉楠碱(actein)。
根据另一项实施方案，本发明提供了基本上不含在黑升麻根中所存在 的其它化合物的式I化合物。如本文所用的术语“基本上不含”意指：与黑 升麻根或其提取物中所存在的化合物相比，该化合物由显著较高比例的式 I化合物组成。在一些实施方案中，本发明提供了约1％重量至约99％重量 的式I化合物。在某些实施方案中，式I化合物以约80％化学纯度以上的 纯度被提供。在其它实施方案中，式I化合物以约90％化学纯度以上的纯 度被提供。在其它实施方案中，式I化合物含有相对于HPLC色谱图的总 面积而言不多于约10.0％HPLC面积的黑升麻根的其它化合物。在其它实 施方案中，式I化合物含有相对于HPLC色谱图的总面积而言不多于约8.0 ％HPLC面积的黑升麻根的其它组分，在其它实施方案中，不多于约3％ 面积。
测定本发明化合物是否是基本上不含通常存在于黑升麻根中的其它化 合物的形式的方法对本领域普通技术人员而言是已知的，如下文所述。以 前从黑升麻根中分离和鉴定的化合物包括某些基于环木菠萝烷醇 (cycloartanol)的三萜类化合物，包括升麻苷(acteol)、乙酰基升麻苷、26- 脱氧升麻苷、升麻醇、黄肉楠碱、26-脱氧黄肉楠碱和升麻素苷。也已经分 离出和鉴定了(E)异阿魏酸和异黄酮——芒柄花黄素。这些化合物的代表物 质有以下结构：
因此，本发明的其它实施方案提供了基本上不含升麻苷、乙酰基升麻 苷、26-脱氧升麻苷、升麻醇、黄肉楠碱、26-脱氧黄肉楠碱和升麻素苷中 一种或多种的式I化合物。在某些实施方案中，本发明提供了基本上不含 升麻苷、乙酰升麻苷、26-脱氧升麻苷、升麻醇、黄肉楠碱、26-脱氧黄肉 楠碱和升麻素苷的式I化合物。
根据另一项实施方案，本发明提供了富含式I化合物的黑升麻根提取 物，其具有减少量的升麻苷、乙酰基升麻苷、26-脱氧升麻苷、升麻醇、黄 肉楠碱、26-脱氧黄肉楠碱和升麻素苷中的一种或多种。根据另一项实施方 案，本发明提供了富含式I化合物的黑升麻根提取物，其具有减少量的升 麻苷、乙酰基升麻苷、26-脱氧升麻苷、升麻醇、黄肉楠碱、26-脱氧黄肉 楠碱和升麻素苷的每一种。
在本领域熟知多种技术用于提取、分离和/或纯化黑升麻根中的单个活 性组分。本发明包括如本文所述的这类活性组分的鉴别和将这类组分加入 到如本文所述的本发明组合物中。
黑升麻提取物的单个活性组分可如本文所述来鉴定，可以使用本领域 已知的任意技术来分离和/或纯化。活性组分可以由任意形式的根自身或本 发明提取物或可市售获得的提取物的混合物的煎煮液等进行纯化。可用于 纯化的各种技术包括过滤、选择性沉淀、用有机溶剂提取、用含水溶剂提 取、柱色谱法(硅胶)、高效液相色谱法(HPLC)和本领域普通技术人员已知 的其它方法。
根据某些实施方案，本发明的提取物是采用来自黑升麻根的分离级分 的提取物。分离级分指已经从根自身中移出的、例如通过色谱手段、蒸馏、 沉淀、提取、过滤或其它方法从根自身中移出的附加量的根物质。在其它 实施方案中，根提取物和级分通过色谱法、蒸馏、沉淀或提取由此除去。 这类提取和分离技术是本领域技术人员熟知的。一些这类技术的细节自在 下文实施例部分中详细给出。
根据本发明的其它实施方案，活性化合物的存在和纯度通过化学方法、 包括核磁光谱法(NMR)、质谱法、红外光谱法(IR)、紫外可见光谱法、元 素分析和旋光测定法、折射法进行评价，以上提到的只是一小部分。这类 分析方法是本领域技术人员已知的。在其它实施方案中，从黑升麻根中分 离的活性化合物的化学结构通过本领域普通技术人员已知的方法进行测 定，包括NMR、质谱法、红外光谱法(IR)、紫外可见光谱法、元素分析、 旋光测定法、折射法和X-射线结晶学，以上提到的只是一小部分。
尽管上文和此处描述了某些示例性的实施方案，应当理解，可以按照 上文所概括描述的方法、采用适当的原料通过本领域普通技术人员通常可 获知的方法制备本发明的根提取物。
5.用途、制剂和施用
可药用组合物
根据本发明的另一方面，提供了可药用组合物，其中这些组合物包含 任意如本文所述的化合物以及任选地包含可药用载体、辅剂或基质。在某 些实施方案中，这些组合物任选地还包含一种或多种另外的治疗剂。
应当理解，某些本发明化合物可以以用于治疗的游离形式存在，或者 酌情以其可药用盐形式存在。
如本文所用的术语“可药用盐”指这样的盐：在合理的医学判断范围 内适用于与人和低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏 反应等，并且具有合理的利益/风险比。“可药用盐”指当施用于接受者时 能够直接地或间接地提供本发明化合物或其具有药物活性的代谢物或残基 的无毒的本发明化合物的盐或其酯的盐。如本文所用的术语“其具有药物 活性的代谢物或残基”指其代谢物或残基也是本发明的具有药物活性的化 合物。
可药用盐在本领域是众所周知的。例如，S.M.Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19中详细描述了可药用盐，该文献引 入本文作为参考。本发明化合物的可药用盐包括由适宜的无机和有机酸和 碱衍生的那些。可药用的无毒的酸加成盐的实例包括氨基基团与无机酸如 盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、 酒石酸、枸橼酸、琥珀酸或丙二酸形成的盐或者通过采用本领域所用的其 它方法如离子交换形成的盐。其它可药用盐包括已二酸盐、海藻酸盐、抗 坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸 盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、枸橼酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十 二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、 葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳 糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二 酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈 酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味 酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫 氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。从适当的碱衍生的盐包括 碱金属、碱土金属、氨和N+(C1-4烷基)4盐。本发明还包括本文所公开化合 物的任意碱性含氮基团的季铵化。水或油的可溶性或可分散性产物可通过 这种季铵化作用获得。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、 镁等。其它可药用盐酌情包括无毒的铵盐、季铵盐和采用抗衡离子如卤离 子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基 磺酸根形成的胺阳离子。
本发明的组合物可另外地包含可药用载体、辅剂或基质，如本文所用 的可药用载体、辅剂或基质包括任意和所有的溶剂、稀释剂或其它液体基 质、分散或混悬助剂、表面活性剂、等张调节剂、增稠剂或乳化剂、防腐 剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适用于预期特定剂型的那样。《雷氏药物 科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack 出版公司，伊斯顿，Pa.，1980)公开了各种在配制可药用组合物中使用的载 体以及制备该可药用组合物的已知技术。除了任意常规载体基质与本发明 化合物不相配伍(例如通过产生任意不期望的生物学效应或者以有害的方 式与可药用组合物的任意其它组分相互作用)的情况外，其应用在本发明的 范围内。可用作可药用载体的一些材料的实例包括但不限于：离子交换剂、 氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸 盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、 水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、 胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯- 聚氧丙烯嵌段聚合物、羊毛脂、糖类如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米 淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙 酸纤维素；粉状西黄蓍胶；麦芽糖(malt)；明胶；滑石粉；赋形剂如可可 脂和栓剂蜡；油如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和 大豆油；二醇类，如丙二醇或聚乙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼 脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等张盐水；林 格氏(Ringer’s)溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液以及其它无毒的可配伍润滑剂 如月桂硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味 剂和芳香剂，根据制剂人员的判断，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合 物中。
本发明所提供的组合物可用于组合治疗，即该组合物可以与一种或多 种其它所需治疗剂或医学操作同时、在其之前或之后施用。在组合方案中 使用的治疗(治疗剂或操作)的特定组合将考虑所需治疗剂和/或操作的相容 性以及所要实现的预期治疗效果。还应当理解，所用治疗对相同紊乱而言 可实现预期作用(例如本文所述的化合物可与其它用于治疗相同紊乱的治 疗剂同时施用)，或者它们可实现不同的作用(例如控制任何副作用)。
例如，可用于治疗神经变性紊乱的已知物质可以与本发明的组合物组 合以治疗神经变性紊乱，例如阿尔茨海默病。这类可用于治疗神经变性紊 乱的已知物质的实例包括但不限于用于阿尔茨海默病的治疗，例如乙酰胆 碱酯酶抑制剂，包括多奈哌齐、美金刚(和相关化合物如NMDA抑制剂)、 用于帕金森病的治疗，例如L-DOPA/卡比多巴、恩他卡朋、罗 吡尼洛、普拉克索、溴隐亭、培高利特、trihexephendyl和金刚烷胺；用 于治疗多发性硬化症(MS)的物质，例如β-干扰素(如和)、 和米托蒽醌；利鲁唑和抗帕金森药。对于可用于治疗神经变性 紊乱的最新治疗的更广的讨论，参见FDA在http://www.fda.gov上批准的 药物名单以及《默克手册》(“The Merch Manual”，第17版，1999)，其整 体内容引入本文作为参考。
在其它实施方案中，本发明的化合物与可用于治疗神经变性紊乱如阿 尔茨海默病的其它物质组合，其中这类物质包括β-分泌酶抑制剂、γ-分泌 酶抑制剂、聚集抑制剂、金属螫合剂、抗氧化剂和神经保护剂。
如本文所用的术语“组合”和相关术语指按照本发明同时或依次施用 治疗剂。例如，本发明的化合物可以与其它治疗剂同时或以独立的单位剂 型依次或以单一单位剂型一起使用。因此，本发明提供了包含式I化合物、 另外的治疗剂以及可药用载体、辅剂或基质的单一单位剂型。
本发明的物质抑制剂的其它实例还可以与包括但不限于如下的那些组 合：哮喘治疗，例如沙丁胺醇和；用于治疗精神分裂症的物质，例 如再普乐、维思通、思瑞康和氟哌啶醇；抗炎药，例如皮质类固醇、TNF 阻滞剂、IL-1RA、硫唑嘌呤、环磷酰胺和柳氮磺吡啶；免疫调节剂和免疫 抑制剂，例如环孢素、他克莫司、雷帕霉素、麦考酚酸吗乙酯、干扰素、 皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和柳氮磺吡啶；神经营养因子，例如乙 酰胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥药、离子通道阻断剂， 用于治疗心血管病的物质如β-阻断剂、ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐/酯 类、钙通道阻断剂和他汀类；用于治疗肝脏疾病的物质，例如皮质类固醇、 考来烯胺、干扰素和抗病毒药；用于治疗血液病的物质，例如皮质类固醇、 抗白血病药和生长因子；和用于治疗免疫缺陷疾病的物质，例如γ-球蛋白。
存在于本发明组合物中的另外的治疗剂的量将不多于以包含该治疗剂 作为唯一活性剂的组合物所通常施用的量。在某些实施方案中，该组合物 中的另外治疗剂的量为包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中所通常存 在的量的约50％至100％。
在供选的实施方案中，使用不含有另外治疗剂的组合物的本发明的方 法包括单独地给所述患者施用另外治疗剂的另外步骤。当这些另外的治疗 剂被单独施用时，它们可以在本发明组合物的施用之前、与之相继或在其 之后施用于患者。
本发明的可药用组合物可以经口、直肠、胃肠道外、脑池内、阴道内、 腹膜内、局部(以粉末、软膏或滴剂形式)、颊部、以口或鼻喷剂等施用于 人或其它动物，这取决于所治疗紊乱的严重性。在某些实施方案中，本发 明的化合物可以以每天约0.01mg/kg至约50mg/kg、优选约1mg/kg至约 25mg/kg受治疗者体重的剂量水平、每日一次或多次经口服或胃肠道外施 用以获得预期的治疗作用。
用于口服施用的液体剂型包括但不限于可药用乳剂、微乳剂、溶液剂、 混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型可含有本领域常用 的惰性稀释剂如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙 酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、 油(具体是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、 甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯及它们的混合物。 除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括辅剂如润湿剂、乳化剂和助悬剂、 甜味剂、矫味剂和芳香剂。
可注射制剂如无菌可注射水性或油性混悬剂可按照已知技术、采用适 宜的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在胃肠道 外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液或乳剂，例如 在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的基质和溶剂中，可以采用的有水、林 格氏溶液U.S.P和等张氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油被常规地用作 溶剂或混悬介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的单 或二甘油酯。另外，在可注射制剂的制备中可以使用脂肪酸如油酸。
可注射制剂可以被灭菌，例如通过截留细菌的滤器过滤，或者通过在 使用前加入能溶于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组 合物形式的灭菌剂。
为了延长本发明化合物的作用，通常需要延缓化合物从皮下或肌肉注 射的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形物质的液体混悬剂来 实现。化合物的吸收速率则依赖于其溶出速率，而溶出速率又可以依赖于 结晶大小和晶型。或者，经胃肠道外施用的化合物形式的延迟吸收通过将 化合物溶于或混悬于油基质中得以实现。可注射贮库形式可通过将化合物 在生物可降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微囊基质而制得。根据 化合物与聚合物的比例以及所用特定聚合物的属性，可以控制化合物的释 放速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注 射贮库制剂还可以通过将化合物包埋在与身体组织可相容的脂质体或微乳 中而制得。
用于经直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，其可以通过将本发明化 合物与适宜的无刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合而 制得，所述赋形剂在环境温度下是固体、但在体温下是液体，因此在直肠 或阴道腔内可融化并释放出活性化合物。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。 在这类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的可药用赋形剂或载体混 合，所述赋形剂或载体例如有枸橼酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂 如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂如羧甲基纤维素、 海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂如甘油， d)崩解剂如琼脂--琼脂、碳酸钙、土豆淀粉、木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸 盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂如石蜡，f)吸收促进剂如季铵化合物，g)润湿剂 如十六醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂如高岭土和膨润土，和i)润滑剂如 滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸钠，及它们的混 合物。对胶囊剂、片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲物质。
还可以采用诸如乳糖或奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的 赋形剂将相似类型的固体组合物用作软和硬填充明胶胶囊的填充物。片剂、 糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳层如肠溶衣以 及药物制剂领域中熟知的其它包衣进行制备。它们可任选地含有遮光剂， 并且也可以是仅仅释放活性成分或者优选地在肠道的某一部分任选地以延 迟方式仅仅释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚 合物物质和蜡。还可以采用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等的赋 形剂将相似类型的固体组合物用作软和硬填充明胶胶囊的填充物。
活性化合物还可以是具有一种或多种如上所述的赋形剂的微囊化形 式。片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳层 如肠溶衣、控释包衣以及药物制剂领域中熟知的其它包衣进行制备。在这 类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉 混合。正如通常实践那样，这类剂型除了惰性稀释剂以外还可包含另外的 物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。对胶囊 剂、片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲物质。它们可任选地含有遮光 剂，并且也可以是仅仅释放活性成分或者优选地在肠道的某一部分任选地 以延迟方式仅仅释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包 括聚合物物质和蜡。
本发明化合物的用于局部或经皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏 剂、洗剂、凝胶剂、粉末剂、溶液剂、喷剂、吸入剂或贴剂。活性组分在 无菌条件下与可药用载体和任何可能需要的所需防腐剂或缓冲剂混合。眼 用制剂、滴耳剂和滴眼剂也在本发明的范围内。另外，本发明包括透皮贴 剂的使用，透皮贴剂具有向身体提供控制递送的化合物的另外优点。这类 剂型可通过将化合物溶于或分散于适宜介质中制得。还可以使用吸收促进 剂来增加化合物穿过皮肤的通量。速率可通过提供速率控制膜或通过将化 合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。
在一些实施方案中，本发明提供了以约1％重量至约99％重量的量含 有任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化 合物的组合物。在其它实施方案中，含有任意式I、II、III、IV-a、IV-b、 IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物的组合物含有相对于HPLC色 谱图的总面积而言不多于约10.0％HPLC面积的黑升麻根的其它组分。在 其它实施方案中，含有任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、 VIII、IX或X化合物的组合物含有相对于HPLC色谱图的总面积而言不 多于约8.0％HPLC面积的黑升麻根的其它组分，在其它实施方案中，不 多于约3％面积。
化合物和可药用组合物的用途
本发明的化合物可用于调节和/或抑制患者中β-淀粉样(1-42)肽的生 成。因此，本发明的化合物可用于治疗患者中与β-淀粉样(1-42)肽的生成 相关的紊乱或减轻其严重性。
根据本发明的方法，所述化合物、提取物和组合物可采用有效治疗神 经变性紊乱或减轻其严重性的任意量和任意施用途径进行施用。所需的准 确用量可根据种属、年龄和受治疗者的一般状况、感染严重性、具体活性 剂、施用方式等而在受治疗者之间不同。
在某些实施方案中，本发明提供了用于调节和/或抑制患者中β-淀粉样 (1-42)肽生成的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、 IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或包含所述化合 物的可药用组合物。在其它实施方案中，本发明提供了选择性调节和/或抑 制患者中β-淀粉样(1-42)肽生成的方法，其中所述方法包括给所述患者施 用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化 合物或其可药用组合物。在另外的其它实施方案中，本发明提供了降低患 者中β-淀粉样(1-42)肽水平的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任 意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物 或其可药用组合物。在其它实施方案中，本发明提供了降低细胞中β-淀粉 样(1-42)肽水平的方法，该方法包括将所述细胞与任意式I、II、III、IV-a、 IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物接触。另一项实施方案 提供了降低细胞中β-淀粉样(1-42)肽而基本上不降低细胞中β-淀粉样(1-40) 肽水平的方法，该方法包括将所述细胞与任意式I、II、III、IV-a、IV-b、 IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物接触。另一项实施方案提供了 降低细胞中β-淀粉样(1-42)肽和提高细胞中β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样 (1-39)肽中至少一者的方法，该方法包括将所述细胞与任意式I、II、III、 IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物接触。
如本文所用的术语“降低”或“减少”指：与不施用任意式I、II、III、 IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物的β-淀粉样肽的 量相比，通过施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、 VIII、IX或X化合物获得的β-淀粉样肽的量相对降低。例如，β-淀粉样(1-42) 肽的降低指：在任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、 IX或X化合物存在下的β-淀粉样(1-42)肽的量比在没有任意式I、II、III、 IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物存在下的β-淀粉 样(1-42)肽的量低。
在其它实施方案中，本发明提供了选择性降低患者中β-淀粉样(1-42) 肽水平的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、 IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。在 某些实施方案中，本发明提供了降低患者中β-淀粉样(1-42)肽水平而基本 上不降低β-淀粉样(1-40)肽水平的方法，其中所述方法包括给所述患者施 用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化 合物或其可药用组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了降低患者中β-淀粉样(1-42)肽水平 和提高β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样(1-39)肽中至少一者的方法，其中所述 方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、 VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。
如本文所用的、有关β-淀粉样肽的量的术语“增加”或“提高”指： 与不施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX 或X化合物(或不使细胞与任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、 VII、VIII、IX或X化合物接触)的β-淀粉样肽的量相比，通过施用任意式 I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物(或使 细胞与式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化 合物接触)获得的β-淀粉样肽的量相对升高。例如，β-淀粉样(1-37)肽的增 加指：在任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIH、IX 或X化合物存在下的β-淀粉样(1-37)肽的量比在没有任意式I、II、III、IV-a、 IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物存在下的β-淀粉样(1-37) 肽的量高。例如，β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样(1-39)肽的相对量可以通过 增加β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样(1-39)肽生成或通过降低较长β-淀粉样肽 如β-淀粉样(1-40)肽和/或β-淀粉样(1-42)肽生成得以增加。另外，可以理解： 如本文所用的、有关β-淀粉样肽的量的术语“增加”或“提高”指通过施 用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化 合物获得的β-淀粉样肽的量的绝对升高。因此，在某些实施方案中，本发 明提供了增加β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样(1-39)肽中至少一者的绝对水平 的方法，其中所述方法包括所所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、 IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。在其它实 施方案中，本发明提供了增加β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样(1-39)肽中至少 一者的水平的方法，其中所述增加是相对于较长β-淀粉样肽如β-淀粉样 (1-40)肽和/或β-淀粉样(1-42)肽或全长β-淀粉样肽的量而言的，其中所述方 法包括所所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、 VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。
本领域普通技术人员将理解：当β-淀粉样(1-42)肽的选择性降低是尤 其有利时，β-淀粉样肽的总比例是重要的。在某些实施方案中，本发明的 化合物降低了β-淀粉样(1-42)肽比β-淀粉样(1-40)肽的总比例。因此，本发 明的另一方面提供了降低患者中β-淀粉样(1-42)肽比β-淀粉样(1-40)肽的比 例的方法，该方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、 V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。在某些实施方案 中，β-淀粉样(1-42)肽比β-淀粉样(1-40)肽的比例从约0.1至约0.4的范围降 低至约0.05至约0.08的范围。
在其它实施方案中，本发明提供了降低细胞中β-淀粉样(1-42)肽比β- 淀粉样(1-40)肽的比例的方法，该方法包括将细胞与任意式I、II、III、IV-a、 IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物接触。在某些实施方案 中，β-淀粉样(1-42)肽比β-淀粉样(1-40)肽的比例从约0.1至约0.4的范围降 低至约0.05至约0.08的范围。
根据一个方面，本发明提供了治疗与β-淀粉样(1-42)肽相关的紊乱或 减轻其严重性的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、 IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合 物。这类紊乱包括神经变性紊乱如阿尔茨海默病、帕金森病和唐氏综合征。
这类紊乱还包括包涵体肌炎(周围肌肉中A-β沉积，导致周围神经病)、 脑淀粉样血管病(在脑血管中的淀粉状)和弱的认知受损。
“高A-β42”是一种基于血浆、CSF测定和/和遗传筛查的可测定的情 况，其在症状性疾病之前出现，尤其是在家族性患者中。这一概念与胆固 醇升高和心脏病之间的关系类似。因而，本发明的另一方面提供了预防与 β-淀粉样(1-42)肽升高有关的疾病的方法，其中所述方法包括给所述患者施 用式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物 或其可药用组合物。
在其它实施方案中，本发明提供了治疗其中A-β-淀粉样变性可以是潜 在方面或者共存和加剧因素的疾病的方法，其中所述方法包括给所述患者 施用式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合 物或其可药用盐。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗患者紊乱的方法，其中所述方 法包括给所述患者施用式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、 VIII、IX或X化合物或其可药用组合物，并且其中所述紊乱是卢伊体痴呆 (与α-突触核蛋白在认知神经元中卢伊体中的沉积有关；α-突触核蛋白更经 常与运动神经元中的沉积和帕金森病的病因学有关)、帕金森病、白内障 (A-β在眼晶状体中聚集)、Tau病变(例如额颞叶痴呆(frontotemporal dementia))、亨廷顿病、ALS/Lou Gerhig病、2型糖尿病(胰岛IAPP聚集 物在尺寸和序列上与A-β类似，具有2型糖尿病增加了痴呆风险)、转甲状 腺素蛋白淀粉样蛋白病(TTR，该疾病的一个实例是在心脏肌肉中导致心肌 病)、朊病毒病(包括克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病、格-施-沙 (Gerstmann--ScheInker)综合征、家族致命性失眠症和库鲁病)和 CJD。
在其它实施方案中，本发明提供了治疗患者中阿尔茨海默病或减轻其 严重性的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、 IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。
不希望被任何特定理论所束缚，据信本发明的化合物是选择性降低β- 淀粉样(1-42)肽水平的γ-分泌酶的调节剂。因此，本发明的另一项实施方案 提供了调节患者的γ-分泌酶的方法，该方法包括给所述患者施用任意式I、 II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药 用组合物。在某些实施方案中，本发明的化合物是γ-分泌酶抑制剂。所述 方法可用于治疗与γ-分泌酶相关的任何紊乱或减轻其严重性。这类紊乱包 括但不限于神经变性紊乱如阿尔茨海默病。
Notch/δ信号传导途径在种属中高度保守，在脊椎动物和无脊椎动物 发育中均广泛地用于调节胚胎发育中的细胞命运。参见Gaiano和Fishell， “Notch在促进神经胶质和神经干细胞命运中的作用”(“The Role of Notch In Promoting Glial and Neural Stem Cell Fates”，Annu.Rev.Neurosci. 2002，25：471-90)。Notch与γ-分泌酶复合物相互作用，并且具有与多种其 它蛋白质和信号传导途径的相互作用。Notch1与淀粉状前体蛋白竞争γ- 分泌酶，Notch信号传导途径的激活向下调节PS-1基因表达。参见Lleo 等人，“Notch1与淀粉状前体蛋白竞争γ-分泌酶和向下调节早老素-1基因 表达”(“Notch1 Competes with the Amyloid Precursor Protein for γ-Secretase and Down-regulates Presenilin-1Gene Expression”，Journal of Biological Chemistry 2003，48：47370-47375)。Notch受体通过γ-分泌酶与T 细胞受体信号传导协同作用进行加工，由此支持外周T细胞活化。Notch1 可以通过在Tbx21启动子上形成的复合物直接调节Tbx21。参见Minter 等人，“γ-分泌酶抑制剂通过阻止Tbx21的Notch向上调节从而在体内和 体外阻止了1型T辅助细胞极化”(“Inhibitors of γ-secretase block in vivo and in vitro T helper type 1 polarization by preventing Notch upregulation of Tbx21”，Nature Immunology 2005，7：680-688。在体外，γ-分泌酶抑制剂 消减了Notch、干扰素-γ和Tbx21在TH1-极化CD4+细胞中的表达。在体 内，施用γ-分泌酶抑制剂显著阻碍了多发性硬化小鼠实验性自身免疫脑脊 髓炎模型中TH1-介导疾病的发展，这提示了使用这类化合物来治疗TH1- 介导的自身免疫疾病的可能性(参见上述引文)。γ-分泌酶的抑制可改变淋巴 细胞生成和肠细胞分化(Wong等人，“γ-分泌酶抑制剂LY-411，575进行的 长期治疗抑制了β-淀粉样肽生成和改变了淋巴细胞生成和肠细胞分化” (Chronic Treatment with the γ-Secretase inhibitor LY-411，575 inhibits β-Amyloid Peptide Production and Alters Lymphopoiesis and intestinal Cell Differentiation)，Journal of Biological Chemistry，2004，26：12876- 12882)，包括杯形细胞化生的诱导。参见Milano等人，“通过g-分泌酶抑 制剂调节Notch过程导致了肠杯形细胞化生和已知说明肠促分泌谱系分化 的基因的诱导”(Modulation of Notch Processing by g-Secretase inhibitors Causes intestinal Goblet Cell Metaplasia and induction of Genes Known to Specify Gut Secretory Lineage Differentiation)，Toxicological Sciences 2004， 82：341-358。
可以改变淀粉状前体蛋白(“APP”)过程和降低β-淀粉样肽的致病形式 的生成而不影响Notch过程的策略是非常期望的。而且，如上文所述，已 经证明γ-分泌酶的抑制在体外和体内可抑制Th细胞的极化，因而可用于 治疗与Th1细胞有关的疾病。Th1细胞在多种器官特异性自身免疫疾病、 节段性回肠炎、幽门螺杆菌引起的消化性溃疡、急性肾脏同种异体移植物 排斥和不能解释的复发性流产的致病中有涉及，上述疾病只是一小部分。
根据一项实施方案，本发明涉及抑制患者中Th1细胞形成的方法，该 方法包括给所述患者施用本发明的化合物或包含所述化合物的组合物的步 骤。在某些实施方案中，本发明提供了治疗一种或多种自身免疫疾病、包 括肠易激惹综合征、节段性回肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、幽门螺杆 菌引起的消化性溃疡、急性肾脏同种异体移植物排斥、多发性硬化或系统 性红斑狼疮的方法，其中所述方法包括给所述患者施用按照本发明的方法 制备的任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或 X化合物或包含所述化合物的可药用组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了调节和/或抑制患者中β-淀粉样肽生 成而不影响Notch过程的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式 I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或包 含所述化合物的可药用组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了抑制患者中β-淀粉样(1-42)肽生成 而不影响Notch过程的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式I、 II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或包含所 述化合物的可药用组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了降低患者中β-淀粉样(1-42)肽水平 和升高β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉样(1-39)肽中至少一者且不影响Notch过 程的方法，其中所述方法包括给所述患者施用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、 IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化合物或其可药用组合物。
因此，本发明的另一方面提供了降低患者中β-淀粉样(1-42)肽比β-淀 粉样(1-40)肽的比例且不影响Notch过程的方法，该方法包括给所述患者施 用任意式I、II、III、IV-a、IV-b、IV-c、V、VI、VII、VIII、IX或X化 合物或其可药用组合物。在某些实施方案中，β-淀粉样(1-42)肽比β-淀粉样 (1-40)肽的比例从约0.1至约0.4的范围降低至约0.05至0.08的范围。
为了容易施用和剂量均一，优选将本发明的化合物配制成剂量单位形 式。如本文所用的表述“剂量单位形式”指适于所治疗患者的活性剂的物 理上不连续单位。但是可以理解，本发明的化合物和组合物的总日用量将 由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对任意特定患者或生物体而言 的特定有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗紊乱及紊乱的严重性； 所用具体化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健 康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用具体化合物的排泄速率； 治疗持续时间；与所用特定化合物组合使用的或巧合使用的药物，以及医 药领域所熟知的因素。如本文所用的术语“患者”指动物，优选哺乳动物， 最优选人。
实施例
在下述分离方案中使用的黑升麻提取物可以从勃林殷格翰营养公司 (Boehringer Ingelheim Nutriceuticals)以客户订单获得。该提取物基本上等 同于黑升麻提取物的USP制备物，其中使用约50％乙醇水溶液提取粉末 状根和根茎，然后浓缩至近干。
如本文所用的下述化合物编号对应于以下化合物：
化合物1：β-D-木吡喃糖苷，(3，12，16，23R，24R，25S，26S)-12-(乙酰氧 基)-16，23：23，26：24，25-三环氧-26-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-基。
还称作“黄肉楠碱”C37H56O11；分子量：676.83；登记号18642-44-9。
化合物2：升麻醇3-β-D-木吡喃糖苷；C35H56O9，分子量：620.81；登记号 27994-11-2。
化合物3：升麻醇3-α-L-阿糖胞苷。C35H56O9，分子量：620.81；登记号 256925-92-5。
化合物4：24-O-乙酰基氢升麻醇(＝acetylhydroshengmanol)3-β-D-木吡喃 糖苷。C37H60O11，分子量：680.87；登记号78213-32-8。
化合物5：24-O-乙酰基氢升麻醇3-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。C37H60O11，分子 量：680.87。
化合物6：24-O-乙酰基氢升麻醇3-β-D-木吡喃糖苷(Δ-16，17)-烯醇醚。 C37H58O10，分子量：662.85。
化合物7：24-O-乙酰基氢升麻醇3-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(Δ-16，17)-烯醇醚。 C37H58O10，分子量：662.85。
化合物8：24-表-24-O-乙酰基氢升麻醇3-β-D-木吡喃糖苷。C37H60O11，分子 量：680.87。
化合物9：24-表-24-O-乙酰基氢升麻醇3-β-D-木吡喃糖苷(Δ-16，17)-烯醇醚。 C37H58O10，分子量：662.85。
分离方案1
快速柱色谱法
将黑升麻提取物(15.6g)于25℃混悬在150ml 4∶1(v/v)甲醇-水混合物 中。使用机械搅拌器，将所得浆状液在该温度下剧烈搅拌30分钟，得到棕 色乳浊液。持续搅拌下向该乳浊液中加入51g硅胶(ICN silica 32-63)。 使用旋转蒸发仪于25℃真空浓缩该混合物，直至获得大部分均匀的驼-棕色 粉末。采用60cm长、50mm内径的玻璃柱将该物质进行硅胶(ICN silica 32-6360A)柱色谱法。
在准备柱色谱法时，将硅胶倾入500ml 20∶1二氯甲烷-甲醇混合物中， 将所得浆状液注入玻璃柱中。使硅胶静置30分钟，用1cm厚的沙层覆盖。 随后，将吸附在硅胶上的提取物倾入20∶1二氯甲烷-甲醇混合物中，将所 得浆状液倾入柱顶部的沙层上。然后用以下溶剂混合物在0.4巴(氩气)压力 下洗脱硅胶柱：
1.0ml二氯甲烷-甲醇(20∶1)，然后
770ml二氯甲烷-甲醇(10∶1)，然后
800ml二氯甲烷-甲醇(7∶1)，然后
550ml二氯甲烷-甲醇(5∶1)。
收集八份200ml级分(标为sat14-0至sat14-7)，然后收集11份100ml 级分(标为sat14-8至sat14-18)。所有级分通过薄层色谱法(TLC)、采用 Bakerflex硅胶板、用5∶1二氯甲烷-甲醇溶剂混合物洗脱进行分析。展开后， 将硅胶板用茴香醛染料染色。根据TLC分析结果，将级分sat14-9至 sat14-12于25℃真空蒸发至干，取10mg这些级分的样品通过1H-NMR光 谱法、使用CD3OD作为溶剂进行分析，分别参见图1和图2。对2.53ppm 处出现的宽的多重峰和4.86ppm处的2.2Hz二重峰进行图谱解析，因为这 些信号是化合物7和6的特征信号。这四种样品的另外的dqf-COSY谱证 实2.53和4.86ppm处的信号事实上属于化合物7和6。由级分sat14-10的 1H-NMR谱可以得出如下结论：该样品含有最高浓度的化合物7和6，而 且级分sat14-9中可检测到略少量的这些化合物。级分sat14-11似乎含有 痕量的7和6，而在级分sat14-12中不能检测到这些化合物。根据这些结 果，选择级分sat14-10以供经由HPLC进行进一步纯化。或者，也可以使 用级分sat14-9，以得到所需要的另外的化合物4至7。
级分sat14-10的主要组分是黄肉楠碱(1)(JNP2002，65，601-605)，它从 该级分的甲醇溶液中结晶。通过重结晶获得纯的黄肉楠碱。级分sat14-11 的主要组分是升麻醇β-D-木吡喃糖苷(2)和升麻醇α-L-阿糖胞苷(3)，它们 以约2∶1的混合物从该级分中结晶出(JNP 2000，65，905-910和1391-1397)。 C-18柱反相HPLC分级
将级分sat14-10溶于3.5ml甲醇中。将该溶液通过HPLC、采用 SUPELCO Discovery RP-18柱(25cm长，10mm内径)和AGILENT 1100 系列HPLC系统、包括自动进样器和用于190-400nm波长检测的二极管阵 列检测器进行分级。使用如下溶剂梯度：由前2分钟30％(v/v)水的甲醇溶 液开始，接着水含量线性降低，在20分钟时达到100％甲醇。在达到100％ 甲醇2分钟后，水含量增加至30％并于该浓度保持另外8分钟。对于整个 样品sat14-10的分离，需要进样100次、每次35μl。收集9个级分，标为 sat15-1至sat15-9。分别参见图3和4。化合物4至7在级分sat15-1、15-2、 15-4和15-5中洗脱出。级分sat15-1、15-2、15-4和15-5的1H NMR谱示 于图4a和4b中。
用于分离6、4和9的C-8柱反相HPLC分级
将级分sat15-5溶于1.5ml甲醇中。将该溶液通过HPLC、采用 SUPELCO supelcosil LC-8柱(25cm长，10mm内径)和如上所述的 AGILENT 1100系列HPLC系统进行分级。使用如下溶剂梯度：由前2分 钟40％(v/v)水的甲醇溶液开始，接着水含量线性降低，在20分钟时达到 100％甲醇。在达到100％甲醇2分钟后，水含量增加至40％并于该浓度保 持另外8分钟。对于整个样品sat15-5的分离，需要进样50次、每次30μl。 收集5个级分，标为sat16-1至sat16-5(图5)。化合物6在级分sat16-3中 洗脱出，而化合物4在级分sat16-1中洗脱出。在级分15-5中获得了少量 纯的9。图6显示了所得9.8mg 98％纯的6的1H NMR谱。
用于分离8的C-8柱反相HPLC分级
将级分sat15-8溶于0.65ml甲醇中。将该溶液通过HPLC、采用 SUPELCO supelcosil LC-8柱(25cm长，10mm内径)和如上所述的 AGILENT 1100系列HPLC系统进行分级。使用如下溶剂梯度：由前2分 钟40％(v/v)水的甲醇溶液开始，接着水含量线性降低，在20分钟时达到 100％甲醇。在达到100％甲醇2分钟后，水含量增加至40％并于该浓度保 持另外8分钟。收集7个级分，标为sat18-1至sat18-7。化合物8在级分 sat18-6中洗脱出。NMR-光谱分析、包括NOESY谱显示，在甲醇溶液中 化合物8与相应的酮相互转变。稀甲醇溶液含有约4％酮和96％半缩醛形 式。
用于分离7和5的C-8柱反相HPLC分级
将级分sat15-2溶于0.5ml甲醇中。将该溶液通过HPLC、采用 SUPELCO supelcosil LC-8柱(25cm长，10mm内径)和如上所述的 AGILENT 1100系列HPLC系统进行分级。使用如下溶剂梯度：由前2分 钟40％(v/v)水的甲醇溶液开始，接着水含量线性降低，在20分钟时达到 100％甲醇。在达到100％甲醇2分钟后，水含量增加至40％并于该浓度保 持另外8分钟。收集5个级分，标为sat19-3至sat19-7。在级分sat19-7中 获得纯的化合物7，而纯的化合物5在级分sat19-5中获得。
分离方案2
下文给出了用于分离化合物6的供选分离/纯化方案。本领域普通技术 人员将认识到在分离化合物6时，本发明的其它化合物通过本方法可富集 和/或分离。图7描述了分离方法的概要。
该纯化方案使用以下设备：
(a)带二极管阵列检测器(DAD)的Hitachi HPLC系统
(b)Nova PrepTM 8000半制备型HPLC，带远程PC控制器，使用LC ReSponderTM应用软件
(c)Hitachi UV检测器L-7400
(d)Sedex 55蒸发激光散射(ELSD)检测器
(e)75L Biotage硅胶柱(KP-Sil；P/N FKO-1107-19073；批号027075L)
(f)75L Biotage C18柱(Bakerbond，40μ)
(g)75S Biotage C18柱(Vydac，40μ)
(h)分析型HPLC柱：Phenomenex Luna C18，3μ，4.6×100mm
(I)半制备型HPLC柱：Phenomenex Luna C8HPLC柱，20×250mm
(j)半制备型HPLC柱：YMC AQ C18HPLC柱，21.2×250mm；和
(k)制备型HPLC柱：ES工业型C18制备型HPLC柱，5×25em。
用于测定化合物6的纯度的分析方法如下：
柱： Phenomenex Luna C18，3μ，4.6×100mm
流动相： 用A.35％乙腈、B.含0.05％乙酸的30％Nanopure水和
C.35％MeOH进行的等浓度洗脱
流速： 1mL/min
检测： 205，230nm，DAD；和ELSD
运行时间： 8min
柱温： 32℃。
该方法用于提取物、级分和最终产物的分析。
化合物6在这些条件下在约5.5分钟洗脱出来。
将50g黑升麻提取物(″BCE″)粗品在Biotage硅胶柱(7.5×30cm)上进行 分级。装样后，将柱子用5％MeOH/DCM(10L)和10％MeOH/DCM(5L) 洗脱，收集500ml级分。流速为150-200ml/min。HPLC(UV 230nm)显示 化合物6存在于级分23(2.6g)和24(2.3g)中。选择级分23(F23)用于在半 制备型C8柱上进一步纯化。
进行10次试验获得约10mg化合物6。将溶于0.3ml MeOH中的50mg F23在Phenomenex Luna C-8(21.2×250mm，10μ，100A)半制备型柱中上 样。将柱子以9.9mL/min流速用70％MeOH在H2O中的溶液洗脱，用 UV在205nm下监测。分别收集在半制备型HPLC示踪图(图8)中显示的 35分钟和38分钟时洗脱的峰。
将10次试验中收集的35分钟峰的级分合并，在环境温度下蒸发溶剂。 将所得固体在冷冻干燥机上干燥，得到10.3mg化合物6(2609-165-7)。产 物2609-165-7的HPLC(图9)呈现出保留时间(RT)为4.5分钟的极性杂质 峰(11.3％)，尽管各级分的HPLC显示出仅一个主峰(图10)。显然，化合 物6在过程中缓慢转化成了极性更强的化合物。据发现，该极性更强的化 合物是化合物6的脱乙酰基衍生物，如在m/z 643显示出强的[M+Na]+峰的 SSI-MS(图11)和其中没有乙酰基甲基的单峰的所分离杂质在4.5分钟的质 子NMR(图12)中所显而易见的那样。
用化合物6进行的一些稳定性试验表明，脱乙酰化在略呈碱性的 MeOH溶液中发生。但是，它在略酸性溶液中是稳定的。因此，将2609-165-7 在Luna C8柱上用含0.05％AcOH的70％MeOH/30％水作为洗脱剂再次 进行处理，得到3.4mg化合物6(2609-172-11)。图13显示了2609-172-11 的HPLC色谱图。图14和15显示了质子NMR(在CD3OD中)和SSI-MS。
在另一方法中，将250g黑升麻提取物(BCE)与1250mL MeOH在烧杯 中于室温搅拌1小时。不是所有固体都溶解，但是滤液的HPLC分析表明 起始提取物中的所有化合物6都溶解了(～250mg)。虽然如此，将未过滤的 混合物加入在5L圆底烧瓶中的750g硅胶(ICN，60-200μ)中。在旋转蒸发仪 上借助真空除去MeOH，得到重1100g干燥粉末，具有9％残留甲醇。
将在硅胶制备物上干燥的BCE分成四份，每份约270g。将混合物在 SIM中上样，首先用500-600mL二氯甲烷洗涤以除去非极性物质和残留甲 醇。将SIM与75L硅胶柱(KP-Sil；P/N FK0-1107-19073；批号027075L； 7.5×25cm或1750mL)连接。将主柱以60psi径向加压。体系用丙酮以流量 速度100mL/min洗脱，收集500-1000mL级分。在化合物6洗脱后，将柱 子用1.0L MeOH洗涤，用2L丙酮再平衡。在级分1和2中已经从柱子中 洗脱出大约900-1000mL丙酮后，观察到化合物6主要在级分3(1000mL) 中洗脱。前4次实验得到约224mg化合物6。由100g BCE和500mL MeOH 和300g硅胶制得第二批用于硅胶Biotage的起始物质。类似于前4次，用 该起始物质进行两次另外的Biotage(5和6)，得到另外93mg化合物6。合 并6次实验的产物汇集物并在减压下蒸发至干燥固体。
将来自硅胶Biotage的干燥固体(90g)溶于720mL MeOH中，在搅拌下 缓慢加入480mL H2O。沉淀出一些暗的焦油状固体，经滤器过滤除去。将 混浊的滤液上样到75L(7.5×25cm)Bakerbond40μBiotage C18柱上。 上样后(试验无化合物6)，将柱子用5L 60％(v/v)MeOH/H2O、然后用4L 70％MeOH/H2O洗涤，然后用4L 80％MeOH/H2O洗脱化合物6。在洗 脱后，用2L MeOH洗涤柱子。整个过程流速为约60mL/min，MeOH/H2O 流动相含有0.05％乙酸以防止化合物6降解。将产物汇集物(4L)减压浓缩 直至基本上除去所有的MeOH，在布氏漏斗上收集所得沉淀固体，在室温 下借助高真空进行干燥。
将焦油状固体溶于2升来自大规模试验并含有约22mg化合物6的 MeOH洗涤物中，其中所述焦油状固体经过滤从第一批大规模C18填料制 备物中移出并含有约32mg化合物6。将混合物蒸发至1升，与0.67升水 混合。沉淀出一些焦油状固体，将其在滤器上收集，溶于200mL MeOH 中，与134mL水混合。同样过滤该混合物以除去少量焦油，将滤液与第一 次的滤液合并，装载到75S(7.5×9.0cm；400mL)Vydac40μBiotage C18柱上。将柱子用1升60％MeOH/H2O和2升70％MeOH/H2O洗涤， 用1升80％MeOH/H2O(流动相还含有0.05％乙酸)洗脱。将产物汇集物蒸 发，类似于大规模Biotage试验经过滤收集固体。
将第一批得自C18Biotage柱的产物汇集物(16.69g)与70mL MeOH混 合。将混合物超声，过滤除去沉淀。将滤液在ES Industries Chromegabond WR C18柱上以流速177mL/min、采用含有0.05％乙酸的70％MeOH/30％ 水作为洗脱剂进行色谱法(5次，每次14mL)。合并每次试验的6-14分钟的 级分，蒸发除去MeOH。通过离心收集除去MeOH后的沉淀，在冷冻干 燥机上干燥，得到6.6g干燥固体2609-173-16(化合物6，3.2％)。
将第二批来自C18Biotage柱的产物汇集物(4.3g)以类似方式处理，得 到2.0g干燥固体2609-173-27(化合物6，3.06％)。合并2609-173-16和 2609-176-27，得到8.6g的2609-174-6。
将2609-174-6(400mg)溶于1.3mL含有0.1％AcOH的MeOH中。将 溶液装载在Phenomenex Luna C8柱上，用含有0.05％AcOH的68％ MeOH/32％水以24mL/min流速洗脱。
根据分析型HPLC，合并每次试验(总共22次)的15.8至19.8分钟的 级分，蒸发除去MeOH，冷冻干燥至干，得到2609-174-28(1.4g，含有12.6％ 化合物6)。将2609-174-28用于最后在YMC-AQ C18柱上分离化合物6。 总共进行28次试验。
将2609-174-28(50mg)溶于0.25mL含有0.1％AcOH的MeOH中。将 溶液进样到YMC AQ C18柱上。将柱子用含有0.05％乙酸的70％ MeOH/30％水以9.9mL/min洗脱。根据分析型HPLC特性，将20次试验 的通常在48.4-50.4分钟的所选择级分汇集、蒸发并冷冻干燥，得到化合物 6(2609-176-30，85mg)。
还将在临近48.4分钟之前收集的、主要含有化合物6的级分合并，干 燥，得到2609-176-35(50mg)。将2609-176-35用相同的柱子和流动相再次 处理(3次)，得到另一批化合物6，将其与2609-176-30合并，得到102mg 色谱纯度为～95％的产物(2609-177-10)。图16、17、18和19分别显示了化 合物6(2609-176-10)的HPLC色谱图(UV 205、230nm和ELSD)和质子 NMR谱。2609-176-10的质子NMR与化合物6的标准品一致。化合物6 的SSI-MS(图20)显示出与化合物6的分子式C37H58O10一致的在m/z 685 处的强[M+Na]+峰。
酶的碳水化合物的除去
将化合物6(10mg)溶于5mL MeOH中。将磷酸钾缓冲液(50mM，pH 6.0，10mL)加入该MeOH溶液中。将纤维素酶(西格玛产品号C0615，20mg) 溶于10mL磷酸钾缓冲溶液中。然后将化合物6的溶液加入纤维素酶溶液 中，将混合物于37℃温育3天。
通过HPLC如下监测反应进程：将反应混合物的等分试样(20μL)加入 含有0.1％乙酸(v/v)的MeOH(80μL)中。然后采用20分钟MeOH-水梯度 在25cm×4.6mm ID SUPELCOSIL LC-8反相HPLC柱(5um粒径)上分析 样品。
温育3天后，将20mL CH2Cl2加入反应混合物中，将其剧烈振摇，然 后于2000rpm离心3分钟。除去水层，用20mL CH2Cl2另外萃取两次。 合并有机层，除去溶剂，得到9.6mg粗产物。将粗产物溶于最少体积的20∶1 CH2Cl2-MeOH中，经硅胶柱、采用相同的溶剂混合物进行色谱法。采用 钼酸铈染色(1％CeSO4，5％(NH4)Mo7O24·4H2O(w/v)和10％浓H2SO4(v/v)) 和15∶1CH2Cl2-MeOH溶剂混合物通过TLC监测柱子进展。汇集含有Rf为0.26的物质的级分，得到化合物I-16(化合物编号来自上文的表1)。
化合物6的脱乙酰化
将化合物6(88％色谱纯度)用1％氨进行处理，获得化合物I-13(化合 物编号来自上文的表1)。
将化合物6(88％色谱纯度)于85℃加热1小时，获得化合物I-13(化 合物编号来自上文的表1)。
生物学分析
A.确定式I化合物抑制Aβ-42的能力的分析
可以在体外和体内分析作为β-淀粉样(1-42)肽抑制剂的本发明化合物 以及包含所述化合物的提取物。该分析方法在美国专利6,649,196中有详细 描述，该文献整体引入本文作为参考。
根据以与US 6,649,196中所述基本相同的方式进行的基于细胞的分 析，发现本发明的化合物选择性地降低β-淀粉样(1-42)肽。
B.确定式I化合物影响总Aβ比例的能力的分析
采用基本与Wang等人，J.Biol.Chem.1996，50：31894-31902，“The Profile of Soluble Amyloid βProtein in Cultured Cell Media”中所述类似 的分析方案，对本发明的化合物进行了体外分析以确定它们对β-淀粉样 (1-42)肽总比例的影响，所述文献整体引入本文作为参考。该分析采用免疫 沉淀和质谱(IP-MS)对β-淀粉样蛋白进行了定量。以化合物6作为举例， 发现该化合物降低了β-淀粉样(1-42)肽而增加了β-淀粉样(1-37)肽和β-淀粉 样(1-39)肽。这些结果描绘于图21中。
还按照Wang等人描述的方法在7W细胞(APPwt)和7PA2细胞 (APPV717F)中分析了化合物6。APP717突变增加了β-淀粉样(1-42)肽的相对 量。该分析显示，化合物6降低了β-淀粉样(1-42)肽而增加了β-淀粉样(1-39) 肽。这些结果描绘于图22中。
尽管我们已经描述了大量本发明的实施方案，但是显然可以改变我们 的基本实施例以提供利用本发明化合物和方法的其它实施方案。因此，可 以理解，本发明的范围由所附权利要求限定，而非通过已经以举例方式表 示的具体实施方案来限定。