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1、10申请公布号CN104072603A43申请公布日20141001CN104072603A21申请号201310102159X22申请日20130327C07K14/605200601C07K1/06200601C07K1/0420060171申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址518057广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层72发明人宓鹏程潘俊锋马亚平袁建成74专利代理机构深圳市深佳知识产权代理事务所普通合伙44285代理人唐华明54发明名称一种合成替度鲁肽的方法57摘要本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成替度鲁肽的方法。本发明所述方法按照替度鲁肽肽链N端至C端的。
2、氨基酸顺序，先合成233氨基酸多肽片段，然后和N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS或其盐进行偶联合成得到替度鲁肽，其中所述X保护基为BOC保护基或TRT保护基，所述Y保护基为TRT保护基、BUM保护基、MTT保护基、BOC保护基或者MMT保护基。本发明首先按照替度鲁肽肽序合成233片段，然后再将233多肽片段与由特定保护基保护的HIS合成原料在特定的偶联体系下偶联获得替度鲁肽，解决了现有合成方法中由于合成原料以及偶联方法的不当造成HIS的消旋杂质含量较高，替度鲁肽纯度较低的问题。51INTCL权利要求书2页说明书13页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申。
3、请权利要求书2页说明书13页序列表1页附图2页10申请公布号CN104072603ACN104072603A1/2页21一种合成替度鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1、固相合成在SEQIDNO1所示氨基酸序列N端、ASP侧链上、SER侧链上、GLU侧链上、ASN侧链上、THR侧链上、ARG侧链上、GLN侧链上、TRP侧链上和LYS侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂的多肽片段树脂；步骤2、所述多肽片段树脂脱N端保护基，与N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS盐在双试剂偶联体系和有机碱的作用下进行偶联反应，得到替度鲁肽树脂；其中。
4、，所述X保护基为BOC保护基或TRT保护基，所述Y保护基为TRT保护基、BUM保护基、BOC保护基、MTT保护基或者MMT保护基；所述双试剂偶联体系由A试剂和B试剂组成，A试剂选自HBTU、HATU、PYBOP、PYAOP中的一种，B试剂选自HOAT、HOBT中的一种，所述有机碱为DIPEA或TMP；步骤3、将替度鲁肽树脂脱除N端X保护基后裂解，获得替度鲁肽粗品，经RPHPLC纯化后获得替度鲁肽纯品。2根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述树脂为CTC树脂或者WANG树脂。3根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1具体为步骤11、FMOCASP（OTBU）OH在HOBT/DMAP/DIC三。
5、试剂偶联体系或者有机碱DIPEA作用下与树脂进行偶联反应得到FMOCASP（OTBU）树脂；步骤12、FMOCASP（OTBU）树脂脱除FMOC保护基得到HASP（OTBU）树脂，FMOCTHR（TBU）OH在HOBT/DIC双试剂偶联体系作用下与HASP（OTBU）树脂进行偶联反应得到FMOCTHR（TBU）ASP（OTBU）树脂；步骤13、按照SEQIDNO1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将FMOCILEOH、FMOCLYS（BOC）OH、FMOCTHR（TBU）OH、FMOCGLN（TRT）OH、FMOCILEOH、FMOCLEUOH、FMOCTRP（BOC）OH、FMOCAS。
6、N（TRT）OH、FMOCILEOH、FMOCPHEOH、FMOCASP（OTBU）OH、FMOCARG（PDF）OH、FMOCALAOH、FMOCALAOH、FMOCLEUOH、FMOCASN（TRT）OH、FMOCASP（OTBU）OH、FMOCLEUOH、FMOCILEOH、FMOCTHR（TBU）OH、FMOCASN（TRT）OH、FMOCMETOH、FMOCGLU（OTBU）OH、FMOCASP（OTBU）OH、FMOCSER（TBU）OH、FMOCPHEOH、FMOCSER（TBU）OH、FMOCGLYOH、FMOCASP（OTBU）OH和FMOCGLYOH按照步骤12偶联方式进行。
7、氨基酸延伸偶联，得到GLYASPOTBUGLYSERTBUPHESERTBUASPOTBUGLUOTBUMETASNTRTTHRTBUILELEUASPOTBUASNTRTLEUALAALAARGPBFASPOTBUPHEILEASNTRTTRPBOCLEUILEGLNTRTTHRLYSBOCILETHRTBUASPOTBU树脂，即多肽片段树脂；其中，所述FMOC为氨基酸N端保护基，所述OTBU、TBU、TRT、BOC、PBF为氨基酸侧链保护基。4根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤11所述FMOCASP（OTBU）OH、HOBT、DMAP、DIC的摩尔比为1120112。5根据权利要求3。
8、所述方法，其特征在于，步骤11所述FMOCASP（OTBU）OH和DIPEA的摩尔比为13。6根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤12和13所述各氨基酸与HOBT、DIC的摩尔比为11212。权利要求书CN104072603A2/2页37根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS盐与A试剂、B试剂、有机碱的摩尔比为11122。8根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS为TRTHIS（TRT）OH或BOCHIS（BOC）OH，所述N端偶联。
9、有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS盐为BOCHIS（BOC）OHDCHA。9根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述裂解为采用体积比TFAPHSMEEDTTISH2OPHENOL为80852525250302的混合裂解液裂解。10根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述偶联反应以NMP、DMF、DCM中的一种或两种为溶剂。权利要求书CN104072603A1/13页4一种合成替度鲁肽的方法技术领域0001本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成替度鲁肽的方法。背景技术0002替度鲁肽，英文名为TEDUGLUTIDE，一种胰高血糖素样肽2（GLP2）类似物，一种天然生成的激素，可。
10、减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。该药增加了这些细胞的数量，后者可增加小肠吸收、减少腹泻。欧洲商品名为REVESTIVE，在美国商品名为GATTEX。在临床上用于治疗成人短肠综合征。该药成为首个被推荐应用于这种罕见却使患者极其虚弱疾病的药物，结构式和肽序如下00030004在替度鲁肽的现有合成方法中，主要是采用纯固相顺序偶联的方法，如专利CN10182087A，其以WANG树脂为载体，采用常规顺序偶联，最终切割得到替度鲁肽。但是该专利在合成N末端的HIS时，采用FMOC固相常规的偶联原料如FMOCHISTRTOH及常用偶联方法，造成HIS的消旋杂质，并且杂质通过纯化方法难。
11、以去除，导致替度鲁肽产品纯度的降低而杂质DHIS替度鲁肽含量较高。发明内容0005有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成替度鲁肽的方法，使得本发明所述方说明书CN104072603A2/13页5法能够提高其纯度，降低杂质DHIS替度鲁肽含量。0006为实现上述目的，本发明提供如下技术方案0007一种合成替度鲁肽的方法，包括以下步骤0008步骤1、固相合成在SEQIDNO1所示氨基酸序列N端、ASP侧链上、SER侧链上、GLU侧链上、ASN侧链上、THR侧链上、ARG侧链上、GLN侧链上、TRP侧链上和LYS侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂的多肽片段树脂；0009步骤2、所述多肽片段树脂脱N。
12、端保护基，与N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS盐在双试剂偶联体系和有机碱的作用下进行偶联反应，得到替度鲁肽树脂；0010其中，所述X保护基为BOC保护基或TRT保护基，所述Y保护基为TRT保护基、BUM保护基、BOC保护基、MTT保护基或者MMT保护基；所述双试剂偶联体系由A试剂和B试剂组成，A试剂选自HBTU、HATU、PYBOP、PYAOP中的一种，B试剂选自HOAT、HOBT中的一种，所述有机碱为DIPEA或TMP；0011步骤3、将替度鲁肽树脂脱除N端X保护基后裂解，获得替度鲁肽粗品，经RPHPLC纯化后获得替度鲁肽纯品。。
13、0012其中，作为优选所述树脂为CTC树脂或者WANG树脂。在步骤1的合成中，除本发明所限定的保护基外，也可以采用其他合适的保护基对氨基酸加以保护。0013作为优选，步骤2中所述A试剂为HATU，所述B试剂为HOAT，所述有机碱为TMP。0014在本发明所述方法中，首先按照替度鲁肽肽序合成233片段，然后再将233多肽片段与由特定保护基保护的HIS合成原料在特定的偶联体系下偶联获得替度鲁肽，解决了现有合成方法中由于合成原料以及偶联方法的不当造成HIS的消旋杂质，最终导致替度鲁肽纯度降低杂质和DHIS替度鲁肽含量较高的问题。以替度鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式0015HHIS1GLY。
14、2ASP3GLY4SER5PHE6SER7ASP8GLU9MET10ASN11THR12ILE13LEU14ASP15ASN16LEU17ALA18ALA19ARG20ASP21PHE22ILE23ASN24TRP25LEU26ILE27GLN28THR29LYS30ILE31THR32ASP33OH0016SEQIDNO1所示氨基酸序列即为上式中编号233的多肽序列。本发明在步骤1中固相合成的多肽片段树脂是在SEQIDNO1所示氨基酸序列基础上，在其N端、ASP侧链上、SER侧链上、GLU侧链上、ASN侧链上、THR侧链上、ARG侧链上、TRP侧链上、ARG侧链上、GLN侧链上和LYS侧链上。
15、偶联有保护基且在C端偶联有树脂。在本技术领域可以通过保护氨基酸合成原料进行合成。0017本发明所述保护基是在氨基酸合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。本发明中对偶联有保护基的氨基酸表示形式也是本领域常用表示形式，为本领域技术人员所熟知，如FMOCASP（OTBU）OH，FMOC为氨基酸N端保护基，括号里的OTBU为ASP侧链保护基，本发明其他保护氨基酸合成原料均可参照此说明。0018作为优选方案，步骤1。
16、具体为0019步骤11、FMOCASP（OTBU）OH在HOBT/DMAP/DIC三试剂偶联体系或者有机碱说明书CN104072603A3/13页6DIPEA作用下与树脂进行偶联反应得到FMOCASP（OTBU）树脂；0020步骤12、FMOCASP（OTBU）树脂脱除FMOC保护基得到HASP（OTBU）树脂，FMOCTHR（TBU）OH在HOBT/DIC双试剂偶联体系作用下与HASP（OTBU）树脂进行偶联反应得到FMOCTHR（TBU）ASP（OTBU）树脂；0021步骤13、按照SEQIDNO1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将FMOCILEOH、FMOCLYS（BOC）OH、。
17、FMOCTHR（TBU）OH、FMOCGLN（TRT）OH、FMOCILEOH、FMOCLEUOH、FMOCTRP（BOC）OH、FMOCASN（TRT）OH、FMOCILEOH、FMOCPHEOH、FMOCASP（OTBU）OH、FMOCARG（PDF）OH、FMOCALAOH、FMOCALAOH、FMOCLEUOH、FMOCASN（TRT）OH、FMOCASP（OTBU）OH、FMOCLEUOH、FMOCILEOH、FMOCTHR（TBU）OH、FMOCASN（TRT）OH、FMOCMETOH、FMOCGLU（OTBU）OH、FMOCASP（OTBU）OH、FMOCSER（TBU）OH、F。
18、MOCPHEOH、FMOCSER（TBU）OH、FMOCGLYOH、FMOCASP（OTBU）OH和FMOCGLYOH按照步骤12偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到GLYASPOTBUGLYSERTBUPHESERTBUASPOTBUGLUOTBUMETASNTRTTHRTBUILELEUASPOTBUASNTRTLEUALAALAARGPBFASPOTBUPHEILEASNTRTTRPBOCLEUILEGLNTRTTHRLYSBOCILETHRTBUASPOTBU树脂，即多肽片段树脂；0022其中，所述FMOC为氨基酸N端保护基，所述OTBU、TBU、TRT、BOC、PBF为氨基酸侧链保护基。。
19、0023在步骤1的优选方案基础上，进一步优选，步骤11所述FMOCASP（OTBU）OH、HOBT、DMAP、DIC的摩尔比为1120112，所述FMOCASP（OTBU）OH和DIPEA的摩尔比为13，步骤12和13所述各氨基酸与HOBT、DIC的摩尔比为11212。0024在步骤1固相合成多肽片段树脂的优选方案中，所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与树脂偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和羧基的缩合反应）进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端FMOC保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DB。
20、LK脱除N端保护基。由于不断有氨基酸和树脂偶联，所合成的多肽片段树脂是不断变化的，作为优选，每个待偶联的保护氨基酸合成材料与之前已经合成的多肽片段树脂的摩尔比为231，此优选比例适用于本发明所有方案中。0025作为优选，步骤2所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS盐与A试剂、B试剂、有机碱的摩尔比为11122。0026作为优选，所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS为TRTHIS（TRT）OH或BOCHIS（BOC）OH，所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的HIS盐为BOCHIS（BOC）OHDCHA。00。
21、27在步骤3的裂解步骤中，本发明优选为采用体积比TFAPHSMEEDTTISH2OPHENOL为80852525250302的混合裂解液裂解。0028在本发明技术方案中，所有偶联反应优选以NMP、DMF、DCM中的一种或两种为溶剂，其中，当以NMP、DMF、DCM中的两种为溶剂时，两种溶剂的体积比优选为11。此外，本发明所有偶联反应的反应温度均优选为030。0029在本发明所述方法步骤3中，作为优选方案，所述RPHPLC纯化具体为说明书CN104072603A4/13页70030将替度鲁肽粗品用水溶解后，采用RPHPLC系统，波长230NM，色谱柱为50250MM反相C18柱，常规02TFA/。
22、乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分得到替度鲁肽纯品。0031在临床应用中，替度鲁肽本身不太稳定，需要以替度鲁肽醋酸盐形式存在，故本发明还包括将替度鲁肽精品用RPHPLC系统转盐步骤，具体为0032将替度鲁肽纯品溶液采用RPHPLC系统，色谱柱为50250MM反相C18柱，01醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到替度鲁肽醋酸盐。0033由本发明所述方法合成的替度鲁肽经SCXHPLC检测，纯度为99以上，杂质DHIS替度鲁肽在02左右，而采用常规原料和合成方法合成的替度鲁肽，纯度为947，杂质DHIS替度鲁肽在4左右。0034由以上技术方案可知，本发明首先按照替度鲁肽肽序合。
23、成233片段，然后再将233多肽片段与由特定保护基保护的HIS合成原料在特定的偶联体系下偶联获得替度鲁肽，解决了现有合成方法中由于合成原料以及偶联方法的不当造成HIS的消旋杂质含量较高，替度鲁肽纯度较低的问题。附图说明0035图1所示为本发明合成方法合成的替度鲁肽SCXHPLC峰图；0036图2所示为采用FMOCHIS（TRT）OH为原料以常规方法合成的替度鲁肽SCXHPLC峰图。具体实施方式0037本发明公开了一种合成替度鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的。
24、方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。0038在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用WANG树脂和2CTC树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。0039表1英文缩写释义说明书CN104072603A5/13页8004000410042下面结合实施例，进一步阐述本发明。说明书CN104072603A6/13页90043实施例1替代度为01MMOL/G的FMOCAS。
25、POTBUWANG树脂的合成0044称取替代度为05MMOL/G的WANG树脂40G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取494GFMOCASPOTBUOH（12MMOL）、195GHOBT（144MMOL）和015GDMAP（012MMOL）溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入225MLDIC（144MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ML封闭液（吡啶/乙酸酐11，400MMOL400MMOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FM。
26、OCASPOTBUWANG树脂。检测替代度为0100MMOL/G。0045实施例2替代度为02MMOL/G的FMOCASPOTBUWANG树脂的合成0046称取替代度为05MMOL/G的WANG树脂40G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取989GFMOCASPOTBUOH（24MMOL）、390GHOBT（288MMOL）和029GDMAP（024MMOL）溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入450MLDIC（288MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ML封闭液（吡啶/乙酸酐11，400MMO。
27、L400MMOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCASPOTBUWANG树脂。检测替代度为0198MMOL/G。0047实施例3替代度为04MMOL/G的FMOCASPOTBUWANG树脂的合成0048称取替代度为05MMOL/G的WANG树脂40G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取1978GFMOCASPOTBUOH（48MMOL）、778GHOBT（576MMOL）和058GDMAP（048MMOL）溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入900MLDIC（576MM。
28、OL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ML封闭液（吡啶/乙酸酐11，400MMOL400MMOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCASPOTBUWANG树脂。检测替代度为0402MMOL/G。0049实施例4替代度为01MMOL/G的FMOCASPOTBUCTC树脂的合成0050称取替代度为05MMOL/G的CTC树脂40G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取198GFMOCASPOTBUOH（48MMOL）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入167M。
29、LDIPEA（96MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，反应5MIN后，再次加入083MLDIPEA（48MMOL），室温反应05小时。用DMF洗涤3次，加入162MLCH3OH（400MMOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCASPOTBUCTC树脂。检测替代度为0098MMOL/G。0051实施例5替代度为02MMOL/G的FMOCASPOTBUCTC树脂的合成0052称取替代度为05MMOL/G的CTC树脂40G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取396GFMOCASPOTBU。
30、OH（96MMOL）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入334MLDIPEA（192MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，反应5MIN后，再次加入167MLDIPEA（96MMOL），室温反应05小时。用DMF洗涤3次，加入162MLCH3OH（400MMOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCASPOTBUCTC树脂。检测替代度为0210MMOL/G。0053实施例6替代度为04MMOL/G的FMOCASPOTBUCTC树脂的合成说明书CN104072603A7/13页100054称取替代度为05MMOL/G的CTC树脂4。
31、0G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取791GFMOCASPOTBUOH（192MMOL）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入668MLDIPEA（384MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，反应5MIN后，再次加入334MLDIPEA（96MMOL），室温反应05小时。用DMF洗涤3次，加入162MLCH3OH（400MMOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCASPOTBUCTC树脂。检测替代度为0402MMOL/G。0055实施例7替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的合成005。
32、6称取替代度为0198MMOL/G的FMOCASPOTBUWANG树脂1010G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取2385GFMOCTHRTBUOH（60MMOL），973GHOBT（72MMOL），溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入1126MLDIC（72MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法。
33、检测判断反应终点。重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成233片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（233片段）WANG树脂1882G。0057实施例8替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的合成0058称取替代度为0220MMOL/G的FMOCASPOTBUCTC树脂909G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取2385GFMOCTHRTBUOH（60MMOL），973GHOBT（72MMO。
34、L），溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入1126MLDIC（72MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成233片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（233片段）CTC树脂1719G。0059实施例9BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的。
35、原位法合成0060称取替度鲁肽233片段WANG树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0061实施例10BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0062称取替。
36、度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂说明书CN104072603A108/13页11无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0063实施例11BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原。
37、位法合成0064称取替度鲁肽233片段WANG树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP溶液，搅拌反应5MIN后，滴加2086MLDIPEA（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0065实施例12BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0066称取。
38、替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP溶液，搅拌反应5MIN后，滴加2086MLDIPEA（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0067实施例13BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0068称取替度鲁肽233片段CT。
39、C树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDCM溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0069实施例14BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0070称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固。
40、相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDMF/DCM（11）溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0071实施例15BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0072称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中。
41、，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在25环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0073实施例16BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0074称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2说明书C。
42、N104072603A119/13页12次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDCM溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在25环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0075实施例17BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0076称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中。
43、，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDMF/DCM（11）溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在25环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0077实施例18BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0078称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DM。
44、F洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP/DCM（11）溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在25环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0079实施例19BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0080称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2。
45、次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLNMP溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在30环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。0081实施例20BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0082称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入。
46、到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDCM溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在30环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0083实施例21BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0084称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF。
47、洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDMF溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在30环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂说明书CN104072603A1210/13页13无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0085实施例22BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0086称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加。
48、入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2281GHATU（60MMOL）、980GHOAT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDMF/DMF11溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在30环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0087实施例23BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0088称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应。
49、柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、2275GHBTU（60MMOL）、973GHOBT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDMF/DMF11溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在30环境下反应2H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0089实施例24BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0090称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取3222GBOCHISBOCOHDCHA（60MMOL）、3122GPYBOP（60MMOL）、973GHOBT（72MMOL）加入树脂中，加500MLDMF/DMF11溶液，搅拌反应5MIN后，滴加1581MLTMP（120MMOL），在0环境下反应3H。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。0091实施例25BOCHISBOCOHDCHA与替度鲁肽233片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成0092称取替度鲁肽233片段CTC树脂15MMOL加入。