小檗碱衍生物的合成及其在制备抗肿瘤药物和协同阿霉素抗肿瘤药物组合物中的应用.pdf

本发明涉及一种小檗碱衍生物及其制备方法和应用，该小檗碱衍生物结构通式为：其中R为烷基、苄基、取代苄基、苯基、取代苯基、杂环甲基或取代杂环甲基。本发明还涉及上述小檗碱衍生物与阿霉素的组合物及该组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的小檗碱衍生物不仅具有单独和协同阿霉素抗肿瘤作用，而且对于在治疗过程中引起的心肌损伤、体重减轻以及肠黏膜上皮细胞均有一定的保护作用，是阿霉素治疗癌症过程中理想的协同组合药物。

1.  一种小檗碱衍生物，其特征在于，所述小檗碱衍生物结构通式为：

其中R为烷基、苄基、取代苄基、苯基、取代苯基、杂环甲基或取代杂环甲基。

2.  根据权利要求书1所述的小檗碱衍生物，其特征在于，
所述烷基为具有1～20个碳原子的直链或支链烷基或者环烷基，或者末端有取代的烷基；
所述取代苄基的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代，所述取代基为卤素，或为1～6个碳原子的直链或支链烷基，或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，或为亚甲二氧基，或为3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基，或为氰基，或为硝基，或为1-4个碳原子的酰氧基，或为氨基，或为羟基，或为1-萘基，或为2-萘基，或为苯基或取代苯基；
所述取代苯基中的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代，所述取代基为卤素，或为1～6个碳原子的直链或支链烷基，或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，或为亚甲二氧基，或为3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基，或为氰基，或为硝基，或为1～4个碳原子的酰氧基，或为氨基，或为羟基，或为1-萘基，或为2-萘基，或为苄氧基或取代苄氧基；
所述杂环甲基或取代杂环甲基中的杂环为五元或六元单杂环，或为五元或六元稠杂环，或为苯基或取代苯基，所述取代基为苄氧基或取代苄氧基，或所述取代基为杂环甲氧基或取代杂环甲氧基，所述杂环为五元或六元单杂环以及五元或六元稠杂环，所述取代杂环中的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代；所述取代杂环中的取代基为卤素，或为1～4个碳原子的直链或支链烷基，或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，或为1～4个氟原子取代的具有1～4个 碳原子的直链或支链烷氧基，或为亚甲二氧基；或为具有3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基；或为氰基；或为硝基；或为1-4个碳原子的酰氧基；或为氨基；或为羟基；或为苯基；或为2-萘基；或为1-萘基。

3.  根据权利要求书1所述的小檗碱衍生物，其特征在于，
所述烷基为具有12～20个碳原子的烷基；
所述取代苄基中的取代基为3～4个碳原子的烷基，或为2～3个氟原子取代的具有1～2个碳原子的烷基，或为1～3个碳原子的烷氧基，或为1～4个氟原子取代的1～2个碳原子的烷基；
所述取代苯基中的取代基为3～4个碳原子的烷基，或为2～3个氟原子取代的具有1～2个碳原子的烷基，或为1～3个碳原子的烷氧基，或为1～4个氟原子取代的1～2个碳原子的烷基；
所述取代杂环甲基中的取代基为3～4个碳原子的烷基，或为1～3个碳原子的烷氧基，或为2～3个氟原子取代的1～2个碳原子的烷基，或为2～4个氟原子取代的3～4个碳原子的烷基。

4.  根据权利要求书1所述的小檗碱衍生物，其特征在于，
所述烷基为具有13～18个碳原子的烷基；
所述取代苄基中的取代基为异丙基，或为叔丁基，或为三氟甲基，或为甲氧基，或为乙氧基，或为三氟甲氧基；
所述取代苯基中的取代基为异丙基，或为叔丁基，或为三氟甲基，或为甲氧基，或为乙氧基，或为三氟甲氧基；
所述取代杂环甲基中的取代基为异丙基，或为叔丁基，或为甲氧基，或为乙氧基，或为三氟甲基，或为四氟丙氧基。

5.  权利要求书1-4任一所述的小檗碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.  权利要求书1-4任一所述小檗碱衍生物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
第一步：氯化小檗碱发生脱甲基反应生成氯化小檗红碱；
第二步：氯化小檗红碱在缚酸剂条件下，于溶剂中与炔丙基氯发生亲核取代反应生成中间产物，所述的中间产物的结构式为：

第三步：中间产物与取代叠氮化物发生环合反应生成所述的小檗碱衍生物。

7.  根据权利要求书6所述的制备方法，其特征在于，
所述脱甲基反应使用溶剂为乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述亲核取代反应使用缚酸剂为三甲胺、三乙胺、吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，所述溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯乙烷、二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；
所述环合反应使用溶液为CuSO₄·5H₂O和抗坏血酸钠水溶液，所用溶剂为二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺。

8.  一种抗肿瘤的组合物，其特征在于，它包含权利要求书1-4任一所述的小檗碱衍生物和阿霉素。

9.  根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述小檗碱衍生物和阿霉素摩尔配比为：(0.1～10)∶1。

10.  权利要求8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

小檗碱衍生物的合成及其在制备抗肿瘤药物和协同阿霉素抗肿瘤药物组合物中的应用
【技术领域】
本发明属于医药化学领域，具体涉及一种小檗碱衍生物及其制备方法和应用，以及小檗碱衍生物与阿霉素构成的药物组合物及其用途。
【背景技术】
恶性肿瘤常称癌症，是严重威胁人类健康的多发病和常见病。目前治疗恶性肿瘤的主要三大方法包括化学治疗(简称化疗)、外科手术治疗和放射治疗。应用传统细胞毒类抗肿瘤药或抗癌药进行化疗在肿瘤的综合性治疗中仍占据了相当重要的地位。部分恶性肿瘤如绒毛膜上皮癌、恶性淋巴癌等可能通过化疗治疗得到治愈，近年来兴起的靶向治疗为我们治愈癌症提供了新的方法和思路，然而面对90％以上实体瘤的治疗目前仍未能达到令人满意的疗效。影响化学治疗效果两大原因为：首先是药物的毒性反应过大，其次是对治疗药物产生了耐药性。细胞毒类化疗药由于对肿瘤细胞选择性的缺乏，在对肿瘤细胞产生杀伤的同时，对正常组织细胞也会产生不同程度的损伤作用。并且毒性反应的大小成为肿瘤化疗时药物用量受限的关键因素。
阿霉素又称多柔比星，为蒽环类抗生素，能嵌入DNA碱基之间，并紧密结合在DNA上，阻止RNA转录过程，抑制RNA的合成，也能阻止DNA的复制。S期细胞对它更为敏感。属于细胞周期非特异性药物。阿霉素抗瘤谱广，疗效高，在临床上被广泛用于多种肿瘤的治疗。主要作用于对常用抗恶性肿瘤药耐药的急性淋巴细胞白血病或粒细胞白血病、恶性淋巴肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌及膀胧癌等。但其使用后较大的不良反应制约了它的应用前景与范围。最严重的毒性反应为可引起心肌退行性病变，心肌间质水肿和心脏毒性。此外，还有消化道反应、皮肤色素沉着及脱发等不良反应。
从天然产物中挖掘活性成分并对其进行结构改造与修饰，是研究者们开发新药的重要途径之一。目前临床使用的各类药物中，许多都来自天然产物或它们的衍生物。小檗碱是从中草药黄连等植物中提取分离得到的一类异喹啉类生物碱，在传统中医里被长期用于治疗由细菌感染引起的胃肠道疾病。近年来研究发现小檗碱及其衍生物药理功能十分丰富，如抗疟、抗菌、抗肿瘤、抗心律失常、降糖、调脂等。在抗肿瘤作用方面小檗碱对多种肿瘤的增殖都有抑制作用，该类化合物可抑制K562(人血癌细胞)、YES(食管癌细胞)、HepG2(肝 癌细胞)、colon26/colon20(结肠癌细胞)、SGC-7901(人胃癌细胞)等多种肿瘤细胞的生长；能促进HL60(人早幼粒白血病细胞)、MGC-803和SGC-7901(人胃癌细胞)的分化；能诱导MGC-803和BGC-823人胃癌细胞凋亡。对于小檗碱9位取代衍生物的研究，一直是小檗碱衍生物研究的热点。许多研究者发现小檗红碱(小檗碱9位的甲氧基被羟基取代)本身也具备一定的抗肿瘤活性，但因其对正常细胞的毒性较大影响了它开发作为抗肿瘤药物的潜力。本专利对小檗碱9位进行新型侧链结构修饰，发现了一类新型小檗碱衍生物具有单独和协同阿霉素抗肿瘤的作用。
中国专利文献CN：201010558160.X，公告日2012年7月18日公开了小檗碱和阿霉素混合制剂在制备抗阿霉素性心功能障碍或抗肿瘤药物中的应用。这种混合制剂对阿霉素性心肌毒性有一定的抑制作用，但小檗碱和阿霉素单独使用抗肿瘤的作用并不明显。
然而，阿霉素对机体有毒副作用，因此，提高小檗碱单独和协同阿霉素抗肿瘤的作用，以达到增效减毒的目的是十分必要的。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供具有较好的抗肿瘤活性的小檗碱衍生物。
本发明的再一的目的是，提供上述小檗碱衍生物的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供上述小檗碱衍生物的用途。
本发明的第四个目的是，提供一种抗肿瘤的组合物。
本发明的第五个目的是，提供所述的抗肿瘤的组合物的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种小檗碱衍生物，结构通式为：

其中，R为烷基、苄基、取代苄基、苯基、取代苯基、杂环甲基或取代杂环甲基；
所述烷基为具有1～20个碳原子的直链或支链烷基或者环烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、环丁基、2-甲基-1-环丙基、戊基、2-环丙基乙基、环戊基、己基、环己基、2-环戊基乙基、 庚基、2-环己基乙基、辛基、壬基和癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十七烷基，十八烷基，十九烷基，二十烷基，优选具有12～20个碳原子的烷基，特别优选13～18个碳原子的烷基；或者末端有取代的烷基，如乙氧羰基甲基、甲氧羰基甲基、乙氧羰基乙基、乙氧羰基丙基、乙氧羰基丁基、乙氧羰基戊基、苯基乙基。
所述取代苄基中的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代；所述取代基为卤素，如氟、氯、溴或碘原子；或为1～6个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基或新己基，优选3～4个碳原子的烷基，特别优选异丙基或叔丁基；或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、四氟丙基，优选2～3个氟原子取代的具有1～2个碳原子的烷基，特别优选三氟甲基；或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基，优选1～3个碳原子的烷氧基，特别优选甲氧基或乙氧基；或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如三氟甲氧基、三氟乙氧基或四氟丙氧基，优选1～4个氟原子取代的1～2个碳原子的烷基，特别优选三氟甲氧基；或为亚甲二氧基；或为3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基；或为氰基；或为硝基；或为1-4个碳原子的酰氧基；或为氨基；或为羟基；或为1-萘基；或为2-萘基；或为苯基或取代苯基，所述取代苯基中的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代；所述取代基为卤素，如氟、氯、溴或碘原子；或为1～6个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基或新己基，优选3～4个碳原子的烷基，特别优选异丙基或叔丁基；或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、四氟丙基，优选2～3个氟原子取代的具有1～2个碳原子的烷基，特别优选三氟甲基；或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基，优选1～3个碳原子的烷氧基，特别优选甲氧基或乙氧基；
所述取代苯基中的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代；所述取代基为卤素，如氟、氯、溴或碘原子；或为1～6个碳原子的直链或支链 烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基或新己基，优选3～4个碳原子的烷基，特别优选异丙基或叔丁基；或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、四氟丙基，优选2～3个氟原子取代的具有1～2个碳原子的烷基，特别优选三氟甲基；或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基，优选1～3个碳原子的烷氧基，特别优选甲氧基或乙氧基；或为1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如三氟甲氧基、三氟乙氧基或四氟丙氧基，优选1～4个氟原子取代的1～2个碳原子的烷基，特别优选三氟甲氧基；或为亚甲二氧基；或为3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基；或为氰基；或为硝基；或为1-4个碳原子的酰氧基；或为氨基；或为羟基；或为1-萘基；或为2-萘基；或为苄氧基或取代苄氧基，或所述取代基为卤素、1～6个碳原子的直链或支链烷基、1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基、1～4个碳原子的直链或支链烷氧基、1～4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷氧基、3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基、氰基、硝基；1-4个碳原子的酰氧基、氨基、羟基；或为杂环甲氧基或取代杂环甲氧基。
所述杂环甲基或取代杂环甲基中的杂环为五元或六元单杂环以及五元或六元稠杂环，如呋喃、噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、噁唑、噻唑、异噁唑、吡喃、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、吲哚、咔唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、喋啶、嘌呤或2，3-二氢苯并呋喃-6-基；或为苯基或取代苯基，所述取代基为苄氧基或取代苄氧基，或所述取代基为杂环甲氧基或取代杂环甲氧基，所述杂环为五元或六元单杂环以及五元或六元稠杂环，如呋喃、噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、噁唑、噻唑、异噁唑、吡喃、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、吲哚、咔唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、喋啶、嘌呤或2，3-二氢苯并呋喃-6-基；所述取代杂环中的取代基位于邻、间或对位，取代为单取代或多取代；所述取代杂环中的取代基为卤素，如氟、氯、溴或碘原子；或为1～4个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或仲丁基，优选3～4个碳原子的烷基，特别优选异丙基或叔丁基；或为1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基，优选具有1～3个碳原子的烷氧基，特别优选甲氧基或乙氧基；或为1～ 4个氟原子取代的1～4个碳原子的直链或支链烷基，如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基或三氟乙基四氟丙基，优选2～3个氟原子取代的1～2个碳原子的烷基，特别优选三氟甲基；或为1～4个氟原子取代的具有1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，如三氟甲氧基、三氟乙氧基或四氟丙氧基，优选2～4个氟原子取代的3～4个碳原子的烷基，特别优选四氟丙氧基；或为亚甲二氧基；或为具有3～6个碳原子的烯丙氧基或烷基取代烯丙氧基；或为氰基；或为硝基；或为1-4个碳原子的酰氧基；或为氨基；或为羟基；或为苯基；或为2-萘基；或为1-萘基。
本发明所述小檗碱衍生物为下列化合物1-104。该类衍生物的结构通式如下：

其中R如下表定义。
表1 小檗碱衍生物




为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的小檗碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的小檗碱衍生物制备方法。该方法包括下列步骤，反应路线如下：

(1)化合物I氯化小檗碱发生脱甲基反应生成化合物II氯化小檗红碱；
(2)化合物II氯化小檗红碱与炔丙基氯发生亲核取代反应生成化合物III；
(3)化合物III与取代叠氮化物发生环合反应生成目标化合物IV。
所述步骤(1)脱甲基反应为化合物I氯化小檗碱于适当溶剂中反应；所述溶剂为乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜等，优选四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜，特别优选N，N-二甲基甲酰胺；脱甲基反应的反应温度为130-190℃，优选150-190℃，特别优选180-190℃；所述步骤(1)脱甲基反应的反应时间为0.5-2小时，优选0.5-1小时，特别优选0.5小时。
所述步骤(2)亲核取代反应为化合物II氯化小檗红碱在缚酸剂存在下，于适当溶剂中反应；所述的缚酸剂为三甲胺，三乙胺，吡啶，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，氢氧化锂，氢氧化钠，氢氧化钾；所述溶剂为甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，二氯乙烷，二氯甲烷，四氢呋喃，二氧六环，N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜等，优选乙醇，乙腈，四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺，特别优选乙腈和 四氢呋喃；亲核取代反应的反应温度为50-110℃，优选60-90℃，特别优选70-80℃。
所述步骤(3)环合反应为化合物III在经典“点击化学反应”条件下，于适当溶剂中进行；所述点击化学反应条件为CuSO₄·5H₂O和抗坏血酸钠水溶液；所述溶剂为二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺等，优选四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺，特别优选N，N-二甲基甲酰胺；环合反应的反应温度为-20-50℃，优选0-30℃，特别优选20℃；所述步骤(3)环合反应的反应时间为1-12小时，优选2-8小时，特别优选3-5小时。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种抗肿瘤的组合物，它包含所述的小檗碱衍生物和阿霉素。
所述药物为由小檗碱衍生物和阿霉素组合物作为活性成分与药用载体组成的药物组合物；所述小檗碱衍生物和阿霉素组合物的摩尔配比为0.1∶1～10∶1。
所述活性成分为选自小檗碱衍生物1-104中的一个化合物；优选化合物为13、15、21、54、69、85或93；更优选13，15或54。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明中涉及的大部分化合物的抗肿瘤活性优于小檗碱，部分化合物的抗肿瘤活性增强的同时具有较低的细胞毒性。
2、本发明提供的小檗碱衍生物与抗肿瘤药阿霉素在一定比例下联合用药不仅具有协同抑制乳腺癌细胞增殖的作用，同时对阿霉素治疗过程中引起的心肌损伤、体重减轻以及肠黏膜上皮细胞均有一定的保护作用。
【附图说明】
附图1是小檗碱衍生物制备方法。
【具体实施方式】
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1、氯化小檗红碱(II)的合成
称取8g(0.0216mol)氯化小檗碱，投入250ml烧瓶，加入DMF120ml，190℃油浴回流25-30min，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)检测至原料点刚好消失而杂质点刚未出现时停止反应(产物Rf值约0.4，红色)。蒸干溶剂得BBR-1粗品7g，产率为85％，可直接用于下一步反应。
实施例2 9-O-丙炔基小檗碱(化合物III)的合成
称取0.54g(1.67mmol)氯化小檗红碱(化合物II)投入100ml烧瓶，加入0.24g(2.03mmol)炔丙基溴，60ml乙腈，70-80℃回流2.5h。TLC检测(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，可见产物点(Rf值约为0.45，黄色)，且烧瓶底部出现产物黄色沉淀。柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)得产物0.35g，产率为65％。
实施例3 化合物1-丙基-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物3)
50ml烧瓶中加入50mgNaN₃(0.77mmol)，76mg1-溴正丙烷(0.6mmol)10ml DMF70℃搅拌3h，冷却，投入9-O-丙炔基小檗碱(II)160mg(0.4mmol)，将CuSO₄.5H₂O30mg和抗坏血酸钠50mg分别配制成5ml的水溶液，加入反应体系。继续反应3h，TCL检测(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，产物点黄色(Rf值约0.45)。反应液加入10％氨水，以二氯甲烷100ml分三次萃取，萃取液以12％盐酸5ml洗涤两次，浓缩后柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝25∶1∶微量)，得40mg化合物3。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.72(s，1H)，8.95(s，1H)，8.40(s，1H)，8.20(dd，J＝9.2，3.8Hz，1H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.78(d，J＝3.3Hz，1H)，7.08(s，1H)，6.27-6.09(m，2H)，5.46(s，2H)，4.94(s，2H)，4.30(t，J＝6.9Hz，2H)，4.08(d，J＝9.0Hz，3H)，3.20(d，J＝4.7Hz，2H)，1.86-1.62(m，2H)，0.75(dt，J＝14.8，7.5Hz，3H).HR-ESI-MS calcd for C₂₅H₂₅N₄O₄[M-Cl]⁺445.1875，found445.1879.13CNMR(75MHz，DMSO)δ151.37，150.34，148.18，145.70，142.75，142.05，137.90，133.41，131.10，127.04，125.65，124.41，122.41，120.85，120.75，108.92，105.92，102.58，67.01，57.56，55.85，51.38，26.84，23.59，11.05。
实施例4 化合物1-仲丁烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物4)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物4。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.70(s，1H)，8.90(s，1H)，8.32(s，1H)，8.19(d，J＝8.8Hz，1H)，8.00(d，J＝8.9Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.08(s，1H)，6.16(s，2H)，5.47(s，2H)，4.91(s，2H)，4.11(d，J＝10.6Hz，4H)，3.18(s，2H)，0.69(d，J＝6.2Hz，6H).C₂₆H₂₇N₄O₄[M-Cl]⁺459.2032，found459.2027.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.44，150.35，148.19，145.66，142.56，141.86，137.88，133.39，131.08，127.01，126.08，124.46，122.50，120.80，120.73，108.93，105.90，102.58，66.76，57.56，56.71，55.88，29.51， 26.85，19.70。
实施例5 化合物1-戊基-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物6)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物6。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.70(s，1H)，8.92(s，1H)，8.38(s，1H)，8.18(d，J＝9.2Hz，1H)，8.06-7.95(m，1H)，7.75(s，1H)，7.07(s，1H)，6.15(s，2H)，5.45(s，2H)，4.92(t，J＝6.0Hz，2H)，4.31(t，J＝7.0Hz，2H)，4.08(s，3H)，3.19(t，J＝6.0Hz，2H)，1.80-1.61(m，2H)，1.33-1.07(m，4H)，0.77(q，J＝7.5Hz，3H).HR-ESI-MS calcd for C₂₇H₂₉N₄O₄[M-Cl]⁺473.2188，found473.2194.13C NMR(75MHz，DMSO)δ151.00，149.93，147.76，145.29，142.31，141.52，137.45，132.98，130.67，126.57，125.28，124.05，122.02，120.42，120.31，108.52，105.49，102.18，66.47，57.15，55.48，49.40，29.41，27.86，26.45，21.50，13.79。
实施例6 化合物1-庚基-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物8)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物8。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.68(s，1H)，8.92(s，1H)，8.30(s，1H)，8.21(d，J＝9.2Hz，1H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.09(s，1H)，6.16(s，2H)，5.46(s，2H)，4.90(t，J＝5.9Hz，2H)，4.30(t，J＝6.9Hz，2H)，4.09(s，3H)，3.18(t，J＝5.6Hz，2H)，1.76-1.60(m，2H)，1.21-0.93(m，8H)，0.80(t，J＝6.9Hz，3H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₃₃N₄O₄[M-Cl]⁺501.2501，found 501.2501.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.50，151.22，150.36，148.19，145.86，142.68，137.98，133.51，131.18，127.20，125.59，124.54，122.54，120.92，120.76，108.93，106.19，102.60，67.07，57.74，57.54，49.78，31.50，30.15，28.46，27.00，26.06，22.46，14.36。
实施例7、化合物1-壬基-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物10)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物10。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.69(s，1H)，8.92(s，1H)，8.33(s，1H)，8.20(d，J＝9.2Hz，1H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.08(s，1H)，6.16(s，2H)，5.46(s，2H)，4.91(s，2H)，4.30(t，J＝6.8Hz，2H)，4.09(s，3H)，3.18(s，2H)，1.77-1.55(m，2H)，1.04(dt，J＝38.9，6.7Hz，15H).HR-ESI-MS calcd for C₃₁H₃₇N₄O₄[M-Cl]⁺529.2814，found 529.2819.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.48，150.38，148.22，145.72，142.68，141.88， 137.89，133.39，131.09，127.05，125.66，124.47，122.51，120.86，120.74，108.96105.92，102.63，66.80，57.57，55.90，49.82，31.72，30.14，29.28，29.11，28.83，26.90，26.10，22.59，14.44。
实施例8、化合物1-十二烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物13)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物13。¹H NMR(300MHz，DMSO）δ9.70(s，1H)，8.93(s，1H)，8.33(s，1H)，8.23-8.18(m，1H)，8.03(dd，J＝14.7，9.1Hz，2H)，7.77(s，1H)，7.09(s，1H)，6.17(s，2H)，5.46(s，2H)，4.92(s，2H)，4.31(t，J＝6.4Hz，2H)，4.10(d，J＝1.1Hz，3H)，3.19(s，2H)，1.68(d，J＝6.5Hz，2H)，1.20(dt，J＝59.7，24.0Hz，18H)，0.78(d，J＝1.2Hz，3H).HR-ESI-MS calcd for C34H43N4O4[M-Cl]⁺571.3284，found571.3288.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.98，149.92，147.75，145.38，145.26，142.24，141.48，137.44，132.94，130.79，130.64，126.59，125.16，123.99，122.02，120.39，120.27，108.49，105.45，102.15，79.85，66.42，57.23，57.11，55.44，49.37，30.55，29.87，29.66，29.13，26.42，25.34，21.90，13.85。
实施例9、化合物1-十四烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物15)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物15。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.59(s，1H)，8.85(s，1H)，8.32(s，1H)，8.15(d，J＝9.2Hz，1H)，7.95(d，J＝9.1Hz，1H)，)，7.77(s，1H)，7.08(d，J＝6.8Hz，1H)，6.18(d，J＝4.9Hz，2H)，6.05(s，2H)，5.44(s，2H)，4.71(t，J＝5.8Hz，2H)，4.02(s，3H)，3.09-2.98(m，2H)，2.09-1.92(m，2H)，1.90-1.34(m，22H)，1.24-0.75(m，3H).HR-ESI-MS calcd for C₃₆H₄₇N₄O₄[M-Cl]⁺599.3597，found599.3593.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.95，149.93，147.75，145.24，142.13，141.74，137.55，132.97，130.69，126.63，125.06，123.26，121.99，120.44，120.31，108.43，105.48，102.09，66.81，59.08，57.11，55.48，49.34，32.78，31.30，28.98，26.45，24.51，14.01。
实施例10 化合物1-(亚甲基环己烷)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物20)
50ml烧瓶中加入50mg NaN₃(0.77mmol)，120mg溴甲基环己烷(0.6mmol)10ml DMF室温搅拌3h，投入9-O-丙炔基小檗碱(II)160mg(0.4mmol)，将CuSO₄.5H₂O30mg和抗坏血酸钠50mg分别配制成5ml的水溶液，加入反应体 系。继续反应3h，TCL检测(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，产物点黄色(Rf值约0.45，与底物很接近)。反应液加入10％氨水，以二氯甲烷100ml分三次萃取，萃取液以12％盐酸5ml洗涤两次，浓缩后柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝25∶1∶微量)，得60mg化合物20。¹HNMR(300MHz，DMSO)δ9.73(s，1H)，8.95(s，1H)，8.30(s，1H)，8.20(d，J＝9.0Hz，1H)，7.99(d，J＝9.1Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.09(s，1H)，6.17(s，2H)，5.47(s，2H)，4.93(s，2H)，4.15(d，J＝6.9Hz，2H)，4.10(s，3H)，3.19(s，2H)，1.05(ddd，J＝78.8，57.2，45.1Hz，11H).HR-ESI-MS calcd for C29H31N4O4[M-CH⁺499.2345，found499.2349.¹³C NMR(75MHz，)δ151.49，150.35，148.19，145.75，142.43，141.75，137.84，133.34，131.08，127.00，126.21，124.40，122.53，120.84，120.73，108.94，105.87，102.61，66.72，57.55，55.87，55.50，38.54，30.00，26.88，26.14，25.47。
实施例11、化合物1-(4-亚甲基联苯)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物21)
参照实施例10方法投料以及后处理得化合物21。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.65(s，1H)，8.92(s，1H)，8.47(s，1H)，8.21(d，J＝9.4Hz，1H)，8.01(d，J＝8.4Hz，1H)，7.71(s，1H)，7.64-7.29(m，7H)，7.08(d，J＝7.2Hz，2H)，6.96(s，1H)，6.14(s，2H)，5.61(s，2H)，5.50(s，2H)，4.77(s，2H)，4.09(s，3H)，3.02(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C35H29N4O4[M-Cl]⁺569.2188，found569.2193.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.12，149.83，147.67，145.09，142.48，141.22，139.80，139.19，137.35，135.15，132.82，130.43，128.84，127.90，127.60，126.81，126.49，125.65，124.07，122.10，120.19，108.34，105.28，102.06，66.07，57.05，55.23，52.30，26.25。
实施例12、化合物1-苄基-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物25)
50ml烧瓶中加入50mg NaN₃(0.77mmol)，110mg溴化苄(0.6mmol)，10mlDMF室温搅拌3h，投入9-O-丙炔基小檗碱(II)160mg(0.4mmol)，将CuSO₄.5H₂O30mg和抗坏血酸钠50mg分别配制成5ml的水溶液，加入反应体系。继续反应3h，TCL检测(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，产物点黄色(Rf值约0.45，与底物很接近)。反应液加入10％氨水，以二氯甲烷100ml分三次萃取，萃取液以12％盐酸5ml洗涤两次，浓缩后柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝25∶1∶微量)，得60mg化合物25。¹HNMR(300MHz，DMSO)δ9.64(s，1H)， 8.94(d，J＝15.5Hz，1H)，8.38(s，1H)，8.21(t，J＝9.3Hz，1H)，8.03(t，J＝12.0Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.19(ddd，J＝38.5，14.7，7.5Hz，6H)，6.18(s，2H)，5.57(s，2H)，5.46(s，2H)，4.80(s，2H)，4.06(s，3H)，3.11(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₅N₄O₄[M-Cl]⁺494.1875，found494.1880；¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.49，150.38，148.22，145.65，143.07，141.82，137.89，136.48，133.36，131.11，129.17，128.51，128.07，127.03，125.94，124.52，122.50，120.87，120.78，108.93，105.92，102.61，66.82，57.53，55.78，53.24，26.81。
实施例13、化合物1-(2-氯-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物27)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物27。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.65(s，1H)，8.91(s，1H)，8.40(s，1H)，8.17-8.09(m，1H)，8.00(d，J＝9.4Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.38(d，J＝7.5Hz，1H)，7.29-7.21(m，2H)，7.05(s，2H)，6.15(s，2H)，5.64(s，2H)，5.45(s，2H)，4.82(s，2H)，4.04(s，3H)，3.10(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄ClN₄O₄[M-Cl]⁺528.1486，found528.1477.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.13，149.98，147.83，145.29，142.46，141.28，137.44，133.22，133.01，132.72，130.72，130.58，130.39，129.70，127.79，126.54，126.18，124.29，122.15，120.48，108.59，105.60，102.26，66.25，57.19，55.50，50.77，34.21，26.47。
实施例14、化合物1-(2-溴-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物28)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物28。¹H NMR(，300MHz，DMSO)δ9.66(s，1H)，8.93(s，1H)，8.34(s，1H)，8.21(d，J＝9.2Hz，1H)，8.01(d，J＝9.1Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.60(d，J＝2.1Hz，1H)，7.45-7.38(m，1H)，7.37(d，J＝2.1Hz，1H)，7.15-6.97(m，2H)，6.18(s，2H)，5.65(s，2H)，5.48(s，2H)，4.83(s，2H)，4.08(s，3H)，3.22-3.02(m，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄BrN₄O₄[M-Cl]⁺573.0980，found573.0956.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.46，150.40，148.24，146.09，142.88，142.01，138.11，134.49，134.15，133.37，132.76，132.23，131.08，129.57，128.28，127.11，126.34，124.60，122.49，120.82，120.79，108.95，106.16，102.78，66.91，57.54，55.97，50.56，27.05。
实施例15、化合物1-(3-氟-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物29)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物29。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.69(s，1H)，8.93(s，1H)，8.47(s，1H)，8.20(d，J＝9.2Hz，1H)，8.00(d，J＝9.0Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.34(dd，J＝14.2，7.5Hz，1H)，7.03(dt，J＝23.2，6.5Hz，4H)，6.18(s，2H)，5.62(s，2H)，5.47(s，2H)，4.85(s，2H)，4.07(s，3H)，3.13(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄FN₄O₄[M-Cl]⁺512.17815，found512.17695.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.96，149.93，147.78，145.38，142.65，141.46，137.47，132.99，130.90，130.73，130.58，126.66，125.63，124.02，123.78，122.00，120.34，120.23，115.13，114.83，114.49，108.39，105.52，102.16，66.59，57.01，55.51，52.20，26.39。
实施例16、化合物1-(4-三氟甲氧基-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物39)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物39。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.67(s，1H)，8.91(s，1H)，8.54(s，1H)，8.16(d，J＝9.3Hz，1H)，8.02(d，J＝9.2Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.33-7.21(m，4H)，7.05(s，1H)，6.14(s，2H)，5.62(s，2H)，5.45(s，2H)，4.84(t，J＝5.9Hz，2H)，4.04(s，3H)，3.16-3.06(m，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₄F₃N₄O₅[M-Cl]⁺577.1698，found577.1702.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.15，150.02，148.15，147.86，145.31，142.79，141.41，137.50，135.58，133.03，130.76，129.93(3C)，126.62，125.94，124.31，122.12，121.38(2C)，120.48，120.42，108.59，105.62，102.26，66.37，57.22，55.51，52.01，26.50。
实施例17、化合物1-(4-三氟甲基-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物40)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物40。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.75(s，1H)，8.96(s，1H)，8.56(s，1H)，8.23(d，J＝9.2Hz，1H)，8.04(d，J＝9.1Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.71(d，J＝8.1Hz，2H)，7.39(d，J＝8.0Hz，2H)，7.10(s，1H)，6.20(s，2H)，5.77(s，2H)，5.51(s，2H)，4.91(t，J＝5.5Hz，2H)，4.11(s，3H)，3.18(d，J＝5.6Hz，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₄F₃N₄O₄[M-Cl]⁺562.1749，found562.1755.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.96，149.91，147.74，145.25，142.76，141.44，140.71，137.42，132.91，130.62，128.40(3C)，126.54，125.88，125.65，125.60，124.05，121.94，120.35，120.27，108.45，105.44，102.13，66.40，57.08，55.38，52.11，26.37。
实施例18、化合物1-(4-氰-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物43)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物43。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.68(s，1H)，8.92(s，1H)，8.52(s，1H)，8.20(d，J＝9.0Hz，1H)，8.01(d，J＝8.9Hz，1H)，7.82-7.66(m，3H)，7.23(d，J＝7.7Hz，2H)，7.05(s，1H)，6.16(s，2H)，5.71(s，2H)，5.48(s，2H)，4.82(s，2H)，4.08(s，3H)，3.07(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₄N₅O₄[M-Cl]⁺519.1828，found519.1832.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.04，150.00，147.83，145.18，142.68，141.46，141.24，137.35，132.85，132.61，130.56，128.28，126.52，126.01，124.11，122.02，120.30，118.38，110.85，108.41，105.41，102.14，66.23，57.09，55.31，52.09，26.33。
实施例19、化合物1-(对甲基磺酸基-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物51)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物51。¹H NMR(，300MHz，DMSO)δ9.73(s，1H)，8.93(s，1H)，8.53(s，1H)，8.19(d，J＝9.2Hz，1H)，8.01(d，J＝9.2Hz，1H)，7.89(d，J＝8.3Hz，2H)，7.77(s，1H)，7.45(d，J＝8.3Hz，2H)，7.07(s，1H)，6.17(s，2H)，5.77(s，2H)，5.47(s，2H)，4.90(t，J＝5.6Hz，2H)，4.06(s，3H)，3.19(s，3H)，3.17(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₇N₄O₆S[M-Cl]⁺572.1651，found572.1656.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.86，149.9l，147.75，145.27，142.83，141.71，141.57，140.52，137.47，132.94，130.65，128.60(2c)，127.45(2c)，126.54，125.84，124.01，121.87，120.36，120.27，108.45，105.47，102.13，66.54，57.08，55.40，52.12，43.44，26.39。
实施例20、化合物1-十六烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物54)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物54。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.68(s，1H)，8.92(s，1H)，8.33-8.17(m，2H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.09(s，1H)，6.17(s，2H)，5.46(s，2H)，4.90(s，2H)，4.30(t，J＝6.9Hz，2H)，4.10(s，3H)，3.19(s，2H)，1.76-1.62(m，2H)，1.23(s，26H)，0.85(t，J＝6.2Hz，3H).HR-ESI-MS calcd for C₃₈H₅₁N₄O₄[M-Cl]⁺627.3910，found 627.3914.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.23，150.38，148.2l，145.84，145.78，142.69，142.03，141.28，138.21，137.91，133.43，131.24，131.09，127.03，125.59，124.80，124.49，122.60，122.54，120.82，108.94，105.98，105.94，102.61，80.32， 79.28，67.02，61.44，57.65，57.57，55.80，31.78，30.14，29.54，29.20，28.81，26.83，26.11。
实施例21、化合物1-环丁烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物59)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物59。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ10.00-9.62(m，1H)，8.96(d，J＝11.4Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.29-8.09(m，1H)，7.99(dd，J＝9.1，3.1Hz，1H)，7.74(s，1H)，7.06(s，1H)，6.18(d，J＝16.3Hz，2H)，5.55-5.05(m，2H)，4.98(dd，J＝12.8，6.7Hz，2H)，4.07(dd，J＝7.3，3.4Hz，3H)，3.24(d，J＝31.3Hz，2H)，2.14(dd，J＝12.5，5.7Hz，1H)，2.02-1.57(m，4H).HR-ESI-MS calcd for C₂₅H₂₃N₄O₄[M-Cl]⁺444.1719，found444.1726.¹³C NMR(75 MHz，DMSO)δ151.38，150.37，148.20，145.68，142.98，142.04，137.96，133.41，133.30，131.14，127.06，125.74，124.47，122.43，120.86，120.74，118.84，108.94，105.92，102.59，66.94，57.55，55.87，52.09，26.83。
实施例22、化合物1-环己烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物62)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物62。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.69(s，1H)，8.94(d，J＝9.1Hz，1H)，8.45(s，1H)，8.19(dd，J＝9.1，4.7Hz，1H)，8.00(dd，J＝9.0，4.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.08(s，1H)，6.16(s，2H)，5.44(d，J＝15.8Hz，2H)，4.92(s，2H)，4.12-4.03(m，3H)，3.17(t，J＝5.4Hz，3H)，2.18-1.92(m，2H)，1.89-1.57(m，4H)，1.55-1.30(m，2H)，1.31-0.75(m，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₈H₂₉N₄O₄[M-Cl]⁺486.2188，found486.2185.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.28，150.08，148.07，145.53，142.52，141.98，137.75，133.32，131.03，127.09，126.83，124.37，123.67，122.19，120.84，120.67，108.67，105.56，102.32，66.91，62.23，59.28，57.93，55.67，48.62，33.07，26.55，24.83。
实施例23、化合物1-丙酸乙酯-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物64)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物64。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.70(s，1H)，8.98(d，J＝12.3Hz，1H)，8.44(s，1H)，8.21(dd，J＝9.1，6.3Hz，1H)，8.04(dd，J＝15.6，9.2Hz，1H)，7.79(d，J＝5.7Hz，1H)，7.08(s，1H)，6.16(s，2H)，5.44(s，2H)，5.02-4.87(m，2H)，4.56(t，J＝6.5Hz，2H)，4.08(d，J＝6.8Hz，3H)， 3.92(q，J＝7.1Hz，2H)，3.20(s，2H)，2.92(t，J＝6.5Hz，2H)，1.11(dd，J＝28.4，21.3Hz，3H).HR-ESI-MS calcd for C₂₇H₂₇N₄O₆[M-Cl]⁺503.1930，found503.1936.¹³CNMR(75MHz，DMSO)δ170.72，151.35，150.29，148.15，145.69，142.70，141.97，137.92，133.40，131.13，126.97，126.12，124.46，122.42，120.90，108.91，105.92，102.57，80.31，66.85，60.71，57.55，55.83，45.74，34.27，26.81，14.42。
实施例24、化合物1-戊酸乙酯-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物66)
参照实施例3方法投料以及后处理得化合物66。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.70(s，1H)，8.92(s，1H)，8.37(s，1H)，8.20(d，J＝9.2Hz，1H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.08(s，1H)，6.16(s，2H)，5.45(s，2H)，4.92(t，J＝5.8Hz，2H)，4.35(t，J＝6.9Hz，2H)，4.08(d，J＝7.5Hz，3H)，4.04-3.94(m，2H)，3.19(t，J＝5.9Hz，2H)，2.30-2.21(m，2H)，1.79-1.20(m，4H)，1.17-1.10(m，3H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₃₁N₄O₆[M-Cl]⁺531.2243，found531.2249.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ173.11(d，J＝12.6Hz)，151.34，150.33，148.17，145.68，142.77，142.01，137.90，133.39，131.11，127.00，125.66，124.42，122.39，120.86，120.74，108.91，105.91，102.58，66.95，60.26，57.54，55.86，49.48，33.12，29.49，27.98，26.85，21.66，14.56。
实施例25、化合物1-苯乙基-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物69)
50ml烧瓶中加入50mg NaN₃(0.77mmol)和110mg(0.6mmo1)溴乙基苯，10ml DMF室温搅拌4h，备用。向上述反应混合液依次加入化合物9-O-丙炔基小檗碱(II)160mg(0.4mmol)，CuSO₄.5H₂O(30mg)和抗坏血酸钠(50mg)分别配制成5ml的水溶液，继续室温搅拌反应3h，TCL检测(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，产物点黄色(Rf值约0.45，与底物很接近)。反应结束后，处理时在反应液加入10％氨水，以二氯甲烷100ml分三次萃取，萃取液以12％盐酸10ml再次萃取两次。柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)最终得产物60mg化合物69。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.69(s，1H)，8.94(s，1H)，8.36(s，1H)，8.20(d，J＝8.8Hz，1H)，8.01(d，J＝8.9Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.19(t，J＝8.2Hz，3H)，7.14-7.02(m，3H)，6.16(s，2H)，5.43(s，2H)，4.92(s，2H)，4.61(t，J＝6.8Hz，2H)，4.07(s，3H)，3.14(dd，J＝16.0，8.7Hz，4H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₇N₄O₄ [M-Cl]⁺508.2032，found508.2036.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.79，149.88，147.72，145.22，142.26，141.59，137.55，137.45，132.95，130.66，128.59，128.38，126.57，125.17，123.92，121.86，120.41，120.30，108.46，105.45，102.12，66.51，57.08，55.40，50.43，35.64，30.71，26.38。
实施例26、化合物1-(苄基甲基醚)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物70)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物70。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.72(d，J＝10.6Hz，1H)，8.93(d，J＝12.2Hz，1H)，8.61(d，J＝13.2Hz，1H)，8.20(t，J＝7.7Hz，1H)，8.01(d，J＝9.1Hz，1H)，7.83-7.69(m，1H)，7.39-7.19(m，4H)，7.18-7.00(m，2H)，6.16(s，2H)，5.83(d，J＝13.5Hz，2H)，5.48(d，J＝15.3Hz，2H)，5.03-4.81(m，2H)，4.41(s，2H)，4.12-4.04(m，3H)，3.18(dd，J＝17.1，6.3Hz，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₇N₄O₅[M-Cl]⁺523.1981，found523.1981.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.36，150.32，148.14，145.67，143.41，141.89，137.89，137.12，133.37，131.08，129.14，128.80，128.32，128.07，127.02，126.37，124.49，122.37，120.77，120.73，108.89，105.91，102.57，78.05，70.90，66.78，62.42，57.56，55.81，26.81。
实施例27、化合物3，4-二甲氧基-2-((4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑-1-y1)甲基吡啶的合成(表1中化合物71)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物71。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.62(s，1H)，8.91(s，1H)，8.29-8.16(m，2H)，8.01(t，J＝7.5Hz，2H)，7.79(s，1H)，7.12-7.00(m，2H)，6.18(s，2H)，5.61(s，2H)，5.45(s，2H)，4.83(t，J＝6.0Hz，2H)，4.08(s，3H)，3.85(s，3H)，3.70(s，3H)，3.22-3.07(m，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₈N₅O₆[M-Cl]⁺555.2039，found555.2045.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ158.82(s)，151.49(s)，150.37(s)，148.22(s)，148.04(s)，146.26(s)，145.74(s)，143.36(s)，142.61(s)，141.94(s)，137.84(s)，133.34(s)，131.10(s)，127.04(s)，126.60(s)，124.47(s)，122.51(s)，120.87(s)，120.72(s)，109.15(s)，108.93(s)，105.91(s)，102.62(s)，66.93(s)，61.07(s)，57.51(s)，56.55(s)，55.84(s)，50.09(s)，26.81(s)。
实施例28、化合物4-(3-甲氧基丙氧基)-2-((4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑-1-yl)甲基)吡啶的合成(表1中化合物73)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物73。1H NMR(300MHz，DMSO) δ9.71(s，1H)，8.95(s，1H)，8.72(s，1H)，8.64(d，J＝6.1Hz，1H)，8.19(d，J＝9.2Hz，1H)，7.99(d，J＝9.2Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.48(dd，J＝28.6，22.2Hz，2H)，7.09(s，1H)，6.17(s，2H)，6.03(s，2H)，5.47(s，2H)，4.88(d，J＝28.1Hz，2H)，4.31(t，J＝6.1Hz，2H)，4.08(d，J＝7.3Hz，3H)，3.22(d，J＝9.4Hz，5H)，3.18(s，2H)，2.00(p，J＝6.1Hz，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₃₂N₅O₆[M-Cl]⁺583.2352，found583.2356.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.72，149.85，147.69，145.23，142.70，142.61，141.49，137.42，132.86，130.66，126.49，126.19，124.84，123.89，121.81，120.38，120.24，108.92，108.45，105.47，102.13，68.02，67.54，66.41，57.99，57.08，55.43，48.31，34.00，28.29，26.36，10.06。
实施例29、化合物1-(1，3二氧环戊烷-4-y1)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物75)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物75。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.67(s，1H)，8.94(s，1H)，8.29(s，1H)，8.20(d，J＝9.1Hz，1H)，8.00(d，J＝8.9Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.20-6.96(m，1H)，6.16(s，2H)，5.45(s，2H)，5.15(t，J＝3.7Hz，1H)，4.91(s，2H)，4.56(t，J＝15.6Hz，2H)，4.07(d，J＝8.7Hz，4H)，3.70(t，J＝8.7Hz，3H)，3.19(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₆H₂₅N₄O₆[M-Cl]⁺489.1774，found489.1781.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.38，150.32，148.16，145.68，142.73，141.94，137.87，133.37，131.10，126.98，126.73，124.47，122.43，120.85，120.73，108.92，105.91，102.58，101.04，66.87，65.06，57.53，55.86，55.40，51.93，26.83。
实施例30、化合物3-异丙基-5-((4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑-1-yl)甲基)-1，2，4-恶二唑的合成(表1中化合物77)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物77。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.72(s，1H)，8.95(s，1H)，8.54(s，1H)，8.22(d，J＝9.2Hz，1H)，8.01(d，J＝9.1Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.09(s，1H)，6.17(s，2H)，6.12(s，2H)，5.51(s，2H)，4.90(s，2H)，4.09(s，3H)，3.18(s，2H)，2.98(dt，J＝13.7，6.9Hz，1H)，1.22(d，J＝4.9Hz，1H)，1.18(d，J＝6.9Hz，6H).HR-ESI-MS calcd for C₂₈H₂₇N₆O₅[M-Cl]⁺528.2042，found528.2046.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ175.38，151.52，150.35，148.21，145.77，143.32，141.97，138.12，133.51，131.21，127.11，127.06，124.66，124.59，122.48，120.98，120.81，120.75，108.97，105.99，102.65，93.52，66.85，57.57，45.39，26.52，20.55(2C)。
实施例31、化合物1-(萘-1-亚甲基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物81)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物81。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.60(s，1H)，8.85(s，1H)，8.32(s，1H)，8.15(d，J＝9.2Hz，1H)，8.09-8.02(m，1H)，7.96(d，J＝9.1Hz，1H)，7.92-7.82(m，2H)，7.79(d，J＝8.4Hz，1H)，7.55-7.39(m，3H)，7.26(d，J＝6.8Hz，1H)，7.08(d，J＝6.8Hz，1H)，6.19(d，J＝4.9Hz，2H)，6.05(s，2H)，5.45(s，2H)，4.72(t，J＝5.8Hz，2H)，4.03(s，3H)，3.12-2.97(m，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₃H₂₇N₄O₄[M-Cl]⁺544.2032，found544.2036.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.93，149.88，147.72)，145.07，142.44，141.20，137.25，133.24，132.76，131.40，130.57，130.47，129.00，128.60，127.06，126.76，126.41，126.16，125.52，125.46，123.99，123.05，121.94，120.33，120.23，108.44，105.44，102.13，66.24，56.98，55.20，50.76，26.28。
实施例32、化合物4-((4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑-1-yl)甲基)喹啉-2-酮的合成(表1中化合物83)
参照实施例25方法投料以及后处理得化合物83。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.59(s，1H)，8.85(s，1H)，8.32(s，1H)，8.15(d，J＝9.2Hz，1H)，8.08-8.02(m，1H)，7.95(d，J＝9.1Hz，1H)，7.91-7.79(m，2H)，7.77(s，1H)，7.54-7.47(m，2H)，7.46-7.39(m，1H)，7.25(d，J＝6.8Hz，1H)，7.08(d，J＝6.8Hz，1H)，6.18(d，J＝4.9Hz，2H)，6.05(s，2H)，5.44(s，2H)，4.71(t，J＝5.8Hz，2H)，4.02(s，3H)，3.09-2.98(m，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₂H₂₆N₅O₅[M-Cl]⁺561.1933，found561.1938.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.93，149.89，147.72，145.08，142.45，141.20，137.25，133.25，132.76，131.41，130.57，130.48，129.01，128.60，127.06，126.76，126.41，126.16，125.52，125.46，124.00，123.05，121.94，120.34，120.24，108.45，105.45，102.13，66.25，56.98，55.20，50.76，26.28。
实施例33、化合物1-(2-甲基-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物84)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物84。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.67(s，1H)，8.92(s，1H)，8.42(s，1H)，8.20(d，J＝9.2Hz，1H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.36-7.22(m，3H)，7.15-7.05(m，2H)，6.18(s，2H)，5.60(s，2H)，5.47(s，2H)，4.83(d，J＝6.0Hz，2H)，4.07(s，3H)，3.17-3.07(m，2H)，1.30-1.20(m，3H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₇N₄O₄[M-Cl]⁺508.2032，found 508.1731.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ150.97，149.94，147.83，145.38，145.25，142.68(s)，141.44，138.43，137.46，133.35，132.89，130.60，128.04)，127.65，126.61，126.39，125.64，124.09，122.02，120.43，120.32，108.51，105.50，102.22，66.44，57.02，55.35，52.06，29.09，26.39。
实施例34、化合物1-(4-叔丁基-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物85)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物85。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.71(s，1H)，8.96(s，1H)，8.40(s，1H)，8.21(d，J＝9.1Hz，1H)，8.01(d，J＝9.1Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.28(d，J＝8.2Hz，2H)，7.13-6.96(m，3H)，6.17(s，2H)，5.54(s，2H)，5.46(s，2H)，4.88(s，2H)，4.06(s，3H)，3.15(s，2H)，1.20(s，9H).HR-ESI-MS calcd for C₃₃H₃₃N₄O₄[M-Cl]⁺550.2501，found550.2507.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ155.73，151.21，150.25，148.07，142.78，138.13，133.60，132.96，130.98，127.28，126.64，125.38，124.41，122.13，120.38，120.30，120.22，119.12，105.65，102.35，100.43，78.61，57.21，55.56，52.50，34.45，30.95，29.23。
实施例35、化合物1-(4-甲氧基-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物86)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物86。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.65(s，1H)，8.94(s，1H)，8.48(s，1H)，8.17(d，J＝8.6Hz，1H)，8.01(d，J＝8.3Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.09(d，J＝8.1Hz，3H)，6.79(d，J＝7.0Hz，2H)，6.16(s，2H)，5.47(s，2H)，5.44(s，2H)，4.83(s，2H)，4.05(s，3H)，3.64(s，3H)，3.09(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₃₀H₂₇N₄O₅[M-Cl]⁺523.1981，found523.1987.¹³CNMR(75MHz，DMSO)δ159.57，151.57，150.39，148.23，145.68，143.03，141.83，137.86，133.42，131.12，129.75，128.45，127.04，125.92，124.63，122.56，120.84，114.53，108.95，106.04，102.65，66.86，57.62，55.84，55.64，52.80.26.88。
实施例36、化合物1-(2，4，6-三氯-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物93)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物93。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.57(s，1H)，8.90(s，1H)，8.17(d，J＝9.1Hz，1H)，8.07-7.92(m，2H)，7.81(s，1H)，6.75(s，2H)，6.18(s，2H)，5.44(s，4H)，4.65(s，2H)，4.05(s，3H)，3.10(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₂Cl₃N₄O₄[M-Cl]⁺596.07066，found596.2349.¹³C NMR(75 MHz，DMSO)δ151.15，149.93，147.80，145.19，141.93，141.05，137.72，137.53，137.32，132.81，130.59，128.98，128.62，126.51，124.99，124.06，122.19，120.40，120.25，108.50，105.50，102.29，66.02，57.03，55.17，47.50，19.22。
实施例37、化合物1-(2，6-二氟-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物95)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物95。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.66(s，1H)，8.93(s，1H)，8.34(s，1H)，8.19(d，J＝8.9Hz，1H)，8.00(d，J＝8.7Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.43(s，1H)，7.09(s，3H)，6.18(s，2H)，5.63(s，2H)，5.44(s，2H)，4.85(s，2H)，4.06(s，3H)，3.15(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₃F₂N₄O₄[M-Cl]⁺530.1687，found530.1683.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ159.26，150.98，150.15，149.83，147.96，145.19，142.77，141.62，137.76，133.14，131.69，130.66，126.66，125.65，124.09，122.02，120.49，112.05，111.93，111.79，108.53，108.30，105.51，102.19，99.15，66.29，57.08，55.47，26.46。
实施例38、化合物1-(2，4-二溴-苄基)-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑的合成(表1中化合物99)
参照实施例12方法投料以及后处理得化合物99。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.67(s，1H)，8.92(s，1H)，8.31(s，1H)，8.19(d，J＝8.1Hz，1H)，8.01(s，1H)，7.79(s，1H)，7.60(s，1H)，7.22(s，1H)，7.03(d，J＝28.1Hz，2H)，6.18(s，2H)，5.64(s，2H)，5.49(s，2H)，4.83(s，2H)，4.07(s，3H)，3.13(s，2H).HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₃Cl₂N₄O₄[M-Cl]⁺562.1096，found562.1091.¹³C NMR(75MHz，DMSO)δ151.62，150.58，145.84，143.12，139.79，135.46，133.39，131.24，130.96，130.85，128.76，127.14，126.45，123.38，122.65，122.34，120.93，120.84，109.05，105.99，102.84，102.77，98.27，96.17，67.35，58.44，56.21，54.21，27.63。
实施例39、MTT法测定本发明的小檗碱衍生物对肿瘤细胞增殖的作用(单用)
1)肿瘤细胞的接种：将实验所需处于对数生长期的肿瘤细胞按5000-12000cell/孔接种于96孔酶标板上，体积为100μl/孔。
2)加药：药物以二倍比梯度稀释，每药设8个浓度，每个浓度3个复孔，设置调零组与空白对照组，96孔板外圈孔加入PBS。细胞接种过夜后，加入含药培养基100μl/孔。
3)MTT法测定药物作用：药物作用24h/48h后，轻轻吸尽含药培养液，将新的细胞培养液与配制好的MTT溶液按10∶1的比例混匀，每孔加入110μl， 置于培养箱中继续培养4h后取出，吸出每孔中的液体后加入DMSO，每孔150μl，振荡器上600r振摇10min后酶标仪测定每孔对应的OD值，以630nm为参比波长，570nm处测定OD值。
4)计算细胞增殖抑制率：并用PASWStatistics18Logit回归考查量效曲线拟合度，计算IC₅₀值。
抑制率(％)＝(1-加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％。
5)部分化合物的实验结果见表2。
实施例40、MTT法测定本发明的小檗碱衍生物对HUVEC细胞的毒性
1)HUVEC细胞的接种：将实验所需处于对数生长期的肿瘤细胞按5000cell/孔接种于96孔酶标板上，体积为100μl/孔。
2)加药：药物以二倍比梯度稀释，每药设8个浓度，每个浓度3个复孔，设置调零组与空白对照组，96孔板外圈孔加入PBS。细胞接种过夜后，加入含药培养基100μl/孔。
3)MTT法测定药物作用：药物作用24h/48h后，轻轻吸尽含药培养液，将新的细胞培养液与配制好的MTT溶液按10∶1的比例混匀，每孔加入110μl，置于培养箱中继续培养4h后取出，吸出每孔中的液体后加入DMSO，每孔150μl，振荡器上600r振摇10min后酶标仪测定每孔对应的OD值，以630nm为参比波长，570nm处测定OD值。
4)计算细胞增殖抑制率：并用PASWStatistics18Logit回归考查量效曲线拟合度，计算IC₅₀值。
5)部分化合物的实验结果见表2。
表2小檗碱衍生物单用对四株人肿瘤细胞及正常细胞的半数抑制浓度(IC₅₀，μM)


实施例41、本发明的小檗碱衍生物联合阿霉素对抗MCF-7的细胞活性测试
1)MCF-7细胞的接种铺板：将实验所需处于对数生长期的MCF-7细胞按10000cell/孔接种于96孔酶标板上，体积为100μl/孔。96孔板四周加PBS200μl。
2)加药：小檗碱衍生物以二倍比梯度稀释(第4列至第11列，共8个梯度)，每药设8个浓度，每个浓度3个复孔，96孔板第一列为调零组，第二列为空白对照组，细胞接种过夜后，加入含小檗碱衍生物培养基50μl/孔，加入含多柔比星培养基50μl/孔(此时每孔已是200μl)。
3)MTT法测定药物作用：药物作用24h/48h后，轻轻吸尽含药培养液， 将新的细胞培养液与配制好的MTT溶液按10∶1的比例混匀，每孔加入110μl，置于培养箱中继续培养4h后取出，吸出每孔中的液体后加入DMSO，每孔150μl，振荡器上600r振摇10min后酶标仪测定每孔对应的OD值，以630nm为参比波长，570nm处测定OD值。
4)计算细胞增殖抑制率：并用PASWStatistics18Logit回归考查量效曲线拟合度，计算IC₅₀值。抑制率(％)＝(1-加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％。
5)部分化合物的实验结果见表3。
实施例42、本发明的小檗碱衍生物联合阿霉素对抗MCF-7/ADR的细胞活性测试
1)MCF-7/ADR细胞的接种铺板：将实验所需处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞按12000cell/孔接种于96孔酶标板上，体积为100μl/孔。96孔板四周加PBS200μl。
2)加药：小檗碱衍生物以二倍比梯度稀释(第4列至第11列，共8个梯度)，每药设8个浓度，每个浓度3个复孔，96孔板第一列为调零组，第二列为空白对照组，细胞接种过夜后，加入含小檗碱衍生物培养基50μl/孔，加入含多柔比星培养基50μl/孔(此时每孔已是200μl)。
3)MTT法测定药物作用：药物作用24h/48h后，轻轻吸尽含药培养液，将新的细胞培养液与配制好的MTT溶液按10∶1的比例混匀，每孔加入110μl，置于培养箱中继续培养4h后取出，吸出每孔中的液体后加入DMSO，每孔150μl，振荡器上600r振摇10min后酶标仪测定每孔对应的OD值，以630nm为参比波长，570nm处测定OD值。
4)计算细胞增殖抑制率：并用PASWStatistics18Logit回归考查量效曲线拟合度，计算IC₅₀值。抑制率(％)＝(1-加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％。
5)部分化合物的实验结果见表3。
表3小檗碱衍生物协同阿霉素对抗MCF-7和MCF-7/ADR肿瘤细胞抑制率(％)


实施例43、MTT法测定小檗碱衍生物1-十六烷-4-(9-O-亚甲基小檗碱)-1氢-1，2，3-三唑(表1中化合物54)与阿霉素合用对MCF-7细胞增殖的影响
(1)MCF-7细胞的接种：将实验所需处于对数生长期的MCF-7细胞按10000cell/孔接种于96孔酶标板上，体积为100μl/孔。
(2)加药：药物以二倍比梯度稀释，每药设8个浓度，每个浓度3个复孔，设置调零组与空白对照组，96孔板外圈孔加入PBS。细胞接种过夜后，加入含药培养基100μl/孔。
(3)MTT法测定药物作用：药物作用24h/48h后，吸尽每孔中的含药培养液，将新的细胞培养液与配制好的MTT溶液按10∶1的比例混匀，每孔加入110μl，置于培养箱中继续培养4h后取出，吸出每孔中的液体后加入DMSO，每孔150μl，振荡器上600r振摇10min后酶标仪测定每孔对应的OD值，以630nm为参比波长，570nm处测定OD值。
(4)计算药物对细胞增殖的抑制率：用PASWstatistics18Logit回归考查量效曲线拟合度，计算IC₅₀值。
抑制率(％)＝(对照组细胞平均吸光值-加药组细胞平均吸光值)/对照组细胞平均吸光值×100％。
(5)A、B两药联合指数CI的计算与评价：CI＝A合用IC₅₀/单用A的IC₅₀+B合用IC₅₀/单用B的IC₅₀，CI＜1协同，CI＝1相加，CI＞1无关或拮抗。
(6)数据处理：实验结果数据用Mean±SD表示，两组独立样本均数间的比较用t检验进行统计分析，检验结果P＜0.05则被认为均数间具有显著性差异。所有数据均采用PASWstatistics18软件进行处理。
实验结果见表4。结果表明小檗碱衍生物54与阿霉素联用可以明显提高对MCF-7细胞的抑制率，两药在不同比例下合用时，协同抑制作用显著，且在24h时，小檗碱衍生物54与阿霉素以3∶1的比例联用对MCF-7细胞的协同抑制效果最好；药物作用48h时，小檗碱衍生物54与阿霉素也以3∶1的比例联用对MCF-7细胞的协同抑制效果最好。
表4小檗碱衍生物54与阿霉素联用对MCF-7细胞的抑制作用


以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。