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1、10申请公布号CN104073538A43申请公布日20141001CN104073538A21申请号201310098581222申请日20130325C12P21/06200601C07K1/20200601C07K1/1620060171申请人浙江海洋学院地址316004浙江省舟山市气象台路51号72发明人林慧敏邓尚贵张宾74专利代理机构宁波诚源专利事务所有限公司33102代理人袁忠卫54发明名称一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法57摘要一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法，其特征在于步骤为1）将鱼糜漂洗液过滤，用盐酸调节滤液PH值为5060，静置90120MIN，用NAO。
2、H调节PH值为8090，加入碱性蛋白酶，酶解810H后灭酶，离心，去除沉淀得到酶解液；2）按比例加入抗坏血酸和氯化亚铁，搅拌后调节PH至6080，抽真空震荡螯合3060MIN，离心去沉淀后真空浓缩，冷冻干燥，即为抗菌鱼蛋白铁肽粗提物；对粗提物进行一下纯化，得到成品抗菌鱼蛋白铁肽。本发明的提取方法具有操作简单、分离提取率高、成本低的特点，制得的抗菌鱼蛋白铁肽天然、无毒、无污染、高效抗菌，可以使鱼糜漂洗液中可溶性蛋白得到高值化利用。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104073538ACN。
3、104073538A1/1页21一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法，其特征在于步骤依次为1）将鱼糜漂洗液过滤，用盐酸调节滤液PH值为5060，静置90120MIN，用NAOH调节PH值为8090，加入碱性蛋白酶，酶解810H后灭酶，离心，去除沉淀，得到酶解液；2）按抗坏血酸与酶解液160MG80ML，氯化亚铁与酶解液130MG40ML的比例加入抗坏血酸和氯化亚铁，充分搅拌后调节PH至6080，抽真空震荡螯合3060MIN，离心去沉淀后真空浓缩，冷冻干燥，即为抗菌鱼蛋白铁肽粗提物；3）对上述所得到的抗菌鱼蛋白铁肽粗提物进行一下纯化，得到成品抗菌鱼蛋白铁肽。2根据权利要求1所述的方法，其特。
4、征在于所述鱼糜漂洗液的滤液与碱性蛋白酶的重量份数比为10047；所述碱性蛋白酶酶解温度为3050，所述灭酶的温度为90100，灭酶时间为1020MIN。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2）的螯合温度为3050，所述真空浓缩的温度为4060，浓缩时间为1012H；所述冷冻干燥的温度为6070，冷冻时间为2448H。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3）的纯化的具体步骤为将所述抗菌鱼蛋白铁肽粗提物经葡聚糖凝胶层析洗脱分离，有抗菌活性的层析组分再经反向高效液相色谱洗脱，收集洗脱液；接着对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，即为抗菌鱼蛋白铁肽。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于所。
5、述葡聚糖凝胶层析柱为SEPHADEXG50，所述洗脱液为PH6570，009011MOL/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为1620ML/H；所述反向高效液相色谱为XBRIGETMPREPC18；所述真空冷冻干燥温度为6070，冷冻时间为2436H。权利要求书CN104073538A1/5页3一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法技术领域0001本发明涉及一种鱼蛋白铁肽的提取方法，特别是关于一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法。背景技术0002鱼糜制品在中国的发展前景是十分广阔的。但是在鱼糜生产中，为了得到弹性好、色泽白的优质鱼糜，采肉后的碎鱼肉需用大量的清水进行漂洗。在漂洗过程中一定量的水。
6、溶性蛋白质、色素、脂类等物质溶于水中，作为废水而废弃，十分可惜。鱼糜漂洗液中所含的必需氨基酸齐全，各种氨基酸组成合理，易被人体消化吸收利用，是一种优质蛋白质。从鱼糜漂洗水中提取的蛋白，可作为蛋白源添加到食品中供人食用，也可以添加到饲料中，供各种动物养殖用，用途广泛。我国每年远洋捕捞量至少达几万吨,漂洗液达几十万吨,数量相当可观。因此从漂洗液中提取氨基酸和蛋白质，并高效利用提取的氨基酸和蛋白质，具有重要的经济价值和社会意义。0003现代生物代谢研究发现，蛋白经消化酶水解后，并不都是被水解成氨基酸形式被吸收，更多则是以短肽或寡肽形式吸收，刘洋等研究鳀鱼水解肽用于促动物生长（鳀鱼蛋白酶水解物的营养评。
7、价J青岛海洋大学学报,1996,2613743）等。水解肽金属配合物是由可溶性金属离子同多肽按一定摩尔比结合而成的有机元素鳌合物，具有稳定性高、吸收快、适口性好、生物效价高等特点。如邓尚贵等研究低值鱼下脚料水解肽铁螯合物具有抗菌作用（低值鱼蛋白多肽铁螯合物的酶解制备及其抗氧化、抗菌活性J湛江海洋大学学报，2006，2645458）、WORST等（WORSTDJ,OTTOBR,DEGRAFFJIRONREPRESSIBLEOUTERMEMBRANEPROTEINSOFHELICOBACTERPYLORIINVOLVEDINHEMEUPTAKEJINFECTIMMUN,1995,634161416。
8、5）研究发现多肽铁螯合物体内吸收率为无机铁络合物的49倍。酪蛋白特定多肽经磷酸化后，形成的酪磷肽可螯合CU、CA及ZN等元素，具有防治骨质疏松、调节血压等功效。此外，研究发现部分蛋白肽FE配合物能自由地通过成熟的胎盘而到达特定的靶点器官（MARIAKKIRONSPECIATIONININTESTINALCONTENTSOFRATSFEDMEALCOMPOSEDOFMEATANDNONMEATSOURCESOFPROTEINANDFATJFOODCHEM,1995,524756）。这些研究结果说明水解肽金属配合物是一种安全的，可食用的物质。0004因此，有效利用鱼糜漂洗液中的可溶性蛋白制备有抗菌。
9、抗氧化功效的功能性食品或食品配料，可为实现鱼资源的综合利用、提高其附加值开辟新的途径。发明内容0005本发明所要解决的技术问题是提供一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法，具有操作简单、分离提取率高、成本低的特点，制得的抗菌鱼蛋白铁肽具有天然、无毒、无污染、高效抗菌等优点。0006本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼说明书CN104073538A2/5页4蛋白铁肽的方法，其特征在于步骤依次为00071）将鱼糜漂洗液过滤，用盐酸调节滤液PH值为5060，静置90120MIN，用NAOH调节PH值为8090，加入碱性蛋白酶，酶解810H后灭酶，离心，去除沉淀，得。
10、到酶解液；00082）按抗坏血酸与酶解液160MG80ML，氯化亚铁与酶解液130MG40ML的比例加入抗坏血酸和氯化亚铁，充分搅拌后调节PH至6080，抽真空震荡螯合3060MIN，离心去沉淀后真空浓缩，冷冻干燥，即为抗菌鱼蛋白铁肽粗提物；00093）对上述所得到的抗菌鱼蛋白铁肽粗提物进行一下纯化，得到成品抗菌鱼蛋白铁肽。0010作为优选，所述鱼糜漂洗液的滤液与碱性蛋白酶的重量份数比为10047；所述碱性蛋白酶酶解温度为3050，所述灭酶的温度为90100，灭酶时间为1020MIN。0011作为优选，所述步骤2）的螯合温度为3050，所述真空浓缩的温度为4060，浓缩时间为1012H；所述冷。
11、冻干燥的温度为6070，冷冻时间为2448H。0012作为改进，所述步骤3）的纯化的具体步骤为将所述抗菌鱼蛋白铁肽粗提物经葡聚糖凝胶层析洗脱分离，有抗菌活性的层析组分再经反向高效液相色谱洗脱，收集洗脱液；接着对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，即为抗菌鱼蛋白铁肽。0013最后，所述葡聚糖凝胶层析柱为SEPHADEXG50，所述洗脱液为PH6570，009011MOL/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为1620ML/H；所述反向高效液相色谱为XBRIGETMPREPC18；所述真空冷冻干燥温度为6070，冷冻时间为2436H。0014与现有技术相比，本发明的优点在于以鱼加工废弃物鱼糜漂洗液为原料，通过酶解、螯。
12、合、纯化进行提取，不仅原料来源广泛，而且变废为宝、成本低，可以满足大规模深加工的需要；制得的亚铁抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物物质。本发明操作方便、分离提取率高，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。附图说明0015图1是本发明实施例的抗菌鱼蛋白铁肽粗提物的SEPHADEXG50层析曲线；0016图2是本发明实施例的抗菌鱼蛋白铁肽的反向高效液相色谱XBRIGETMPREPC18洗脱曲线图；0017图3是本发明实施例的抗菌鱼蛋白铁肽抑制大肠杆菌的扫描电镜图，其中A、为对照，没有被亚铁螯合抗菌肽作用的大肠杆菌细胞；B、作用8H的大肠杆菌细胞。
13、；C、作用16H的大肠杆菌细胞。具体实施方式0018以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。0019实施例子10020一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法，具体步骤为00211、将鱼糜漂洗液用纱布进行过滤，去除油脂、碎鱼骨等物质，用盐酸调节滤液PH值为55，静置100MIN，用NAOH调节PH值为85，加入碱性蛋白酶，滤液与碱性蛋白酶的重说明书CN104073538A3/5页5量份数比为1005，酶解温度为40，酶解9H后，在95进行灭酶15MIN，然后离心，去除沉淀，得到酶解液；00222、向酶解液中加入抗坏血酸和氯化亚铁，抗坏血酸与酶解液体积份数之比为3080（MGML），氯化亚。
14、铁与酶解液体积份数之比为2040（MGML）；螯合温度为40，抽真空震荡螯合45MIN，离心，去沉淀，成为抗菌鱼蛋白铁肽的粗提物。00233、真空浓缩抗菌鱼蛋白铁肽粗提物，40，浓缩11H；浓缩物60冷冻干燥24H，得粗提物冻干粉。00244、将螯合抗菌肽粗提物冻干粉经葡聚糖凝胶SEPHADEXG50过柱分离，洗脱液为PH68，01MOL/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为18ML/H，收集约180ML洗脱液。0025见图1所示，抗菌鱼蛋白铁肽的粗提物经葡聚糖凝胶SEPHADEXG50层析柱后有四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100UL进行抗菌实验，抑菌试验显示第一个洗脱峰（F2）有抑菌活性。00265、洗。
15、脱峰F2经反向高效液相色谱为XBRIGETMPREPC18分离出现四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100UL进行抗菌实验，抑菌试验显示第二个洗脱峰（见图2F23）有抑菌活性。00276、收集洗脱峰F23，60真空冷冻干燥24H，成为抗菌鱼蛋白铁肽纯品，在20下保存抗菌鱼蛋白铁肽。0028下面对上述制得的抗菌鱼蛋白铁肽进行抗菌实验0029采用牛津杯法，对实施例提取的抗菌鱼蛋白铁肽进行抗菌活性实验。细菌为大肠杆菌。0030抗菌鱼蛋白铁肽对大肠杆菌的最低抑菌浓度如表1所示，最低杀菌浓度结果如表2所示。0031表1鱼糜漂洗液抗菌鱼蛋白铁肽的最低抑菌浓度00320033注“”表示有菌落生长，“”表示无菌落生长。
16、0034表2鱼糜漂洗液抗菌鱼蛋白铁肽的最低杀菌浓度0035说明书CN104073538A4/5页60036注“”表示有菌落生长，“”表示无菌落生长0037实验结果表明抗菌鱼蛋白铁肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为020MG/ML，最小杀菌浓度为026MG/ML，扫描电镜结果表明抗菌鱼蛋白铁肽主要作用大肠杆菌的细胞膜，随着培养时间的延长，原本清晰可见的细胞之间的界限变模糊；单个细菌细胞表面出现明显的模糊、粗糙区域，两端有空洞出现。说明抗菌鱼蛋白铁肽对大肠杆菌是通过破坏细胞两端的细胞膜达到杀菌作用的。0038实施例子20039一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法，具体步骤为00401、将鱼糜漂洗液。
17、用纱布进行过滤，去除油脂、碎鱼骨等物质，用盐酸调节滤液PH值为50，静置120MIN，用NAOH调节PH值为90，加入碱性蛋白酶，滤液与碱性蛋白酶的重量份数比为1007，酶解温度为50，酶解8H后，在90进行灭酶20MIN，然后离心，去除沉淀，得到酶解液；00412、向酶解液中加入抗坏血酸和氯化亚铁，抗坏血酸与酶解液体积份数之比为5080（MGML），氯化亚铁与酶解液体积份数之比为3040（MGML）；螯合温度为50，抽真空震荡螯合30MIN，离心，去沉淀，成为抗菌鱼蛋白铁肽的粗提物。00423、真空浓缩抗菌鱼蛋白铁肽粗提物，60，浓缩10H；浓缩物60冷冻干燥36H，得粗提物冻干粉。0043。
18、4、将螯合抗菌肽粗提物冻干粉经葡聚糖凝胶SEPHADEXG50过柱分离，洗脱液为PH68，01MOL/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为18ML/H，收集约180ML洗脱液。0044见图1所示，抗菌鱼蛋白铁肽的粗提物经葡聚糖凝胶SEPHADEXG50层析柱后有四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100UL进行抗菌实验，抑菌试验显示第一个洗脱峰（F2）有抑菌活性。00455、洗脱峰F2经反向高效液相色谱为XBRIGETMPREPC18分离出现四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100UL进行抗菌实验，抑菌试验显示第二个洗脱峰（见图2F23）有抑菌活性。00466、收集洗脱峰F23，60真空冷冻干燥36H，成为抗菌鱼蛋白铁肽。
19、纯品，在20下保存抗菌鱼蛋白铁肽。0047实施例子30048一种从鱼糜漂洗液中提取抗菌鱼蛋白铁肽的方法，具体步骤为00491、将鱼糜漂洗液用纱布进行过滤，去除油脂、碎鱼骨等物质，用盐酸调节滤液PH值为60，静置90MIN，用NAOH调节PH值为80，加入碱性蛋白酶，滤液与碱性蛋白酶的重量份数比为1004，酶解温度为30，酶解10H后，在100进行灭酶10MIN，然后离心，去除沉淀，得到酶解液；00502、向酶解液中加入抗坏血酸和氯化亚铁，抗坏血酸与酶解液体积份数之比为1080（MGML），氯化亚铁与酶解液体积份数之比为1040（MGML）；螯合温度为30，抽真空震荡螯合60MIN，离心，去沉淀。
20、，成为抗菌鱼蛋白铁肽的粗提物。00513、真空浓缩抗菌鱼蛋白铁肽粗提物，40，浓缩12H；浓缩物60冷冻干燥36H，得粗提物冻干粉。00524、将螯合抗菌肽粗提物冻干粉经葡聚糖凝胶SEPHADEXG50过柱分离，洗脱液为PH68，01MOL/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为18ML/H，收集约180ML洗脱液。说明书CN104073538A5/5页70053见图1所示，抗菌鱼蛋白铁肽的粗提物经葡聚糖凝胶SEPHADEXG50层析柱后有四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100UL进行抗菌实验，抑菌试验显示第一个洗脱峰（F2）有抑菌活性。00545、洗脱峰F2经反向高效液相色谱为XBRIGETMPREPC18分离出现四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100UL进行抗菌实验，抑菌试验显示第二个洗脱峰（见图2F23）有抑菌活性。00556、收集洗脱峰F23，60真空冷冻干燥36H，成为抗菌鱼蛋白铁肽纯品，在20下保存抗菌鱼蛋白铁肽。说明书CN104073538A1/2页8图1图2说明书附图CN104073538A2/2页9图3说明书附图CN104073538A。