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1、10申请公布号CN104151411A43申请公布日20141119CN104151411A21申请号201310176083522申请日20130514C07K14/35200601C12N15/31200601C12N15/63200601C12N1/21200601C12N1/15200601C12N15/11200601C07K16/12200601C07K19/00200601A61K39/04200601A61K48/00200601A61K47/48200601A61P31/06200601G01N33/569200601C12Q1/68200601G01N33/68200601。
2、C12R1/3220060171申请人中国医学科学院病原生物学研究所地址100005北京市东城区东单三条48号72发明人刘立国金奇张笑冰张维佳74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人刘海罗54发明名称用于结核病诊断的蛋白以及药物组合物57摘要本发明属于生物化学和免疫学领域,涉及一种用于结核病诊断的蛋白以及药物组合物。具体地,本发明涉及一种分离的蛋白,其氨基酸序列如SEQIDNO1或SEQIDNO2所示。本发明的蛋白可以作为作为细胞水平的结核病免疫诊断分子标识或疫苗候选物,具有良好的符合率和反应强度。51INTCL权利要求书1页说明书20页序列表9页附图2页19中华人。
3、民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书20页序列表9页附图2页10申请公布号CN104151411ACN104151411A1/1页21一种分离的蛋白,其氨基酸序列如SEQIDNO1或SEQIDNO2所示。2一种分离的核苷酸,其编码权利要求1所述的蛋白;具体地,所述核苷酸的序列如SEQIDNO3或SEQIDNO4所示。3一种重组载体,其含有权利要求2所述的核苷酸。4一种重组宿主细胞,其含有权利要求3所述的重组载体。5一种引物对,其包含SEQIDNO7和SEQIDNO8所示的核苷酸序列,和/或包含SEQIDNO9和SEQIDNO10所示的核苷酸序列。6一种抗体,其能够与权利要。
4、求1所述的蛋白特异性结合;具体地,所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体;具体地,所述抗体连接有可检测的标记物。7一种抗体偶联物,包括抗体部分和偶联部分,其中,所述抗体部分为权利要求6所述的抗体,所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。8一种组合物,其含有权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的核苷酸、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组宿主细胞、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的抗体或者权利要求7所述的抗体偶联物;可选地,所述组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂;具体地,所述组合物为疫苗组合物,并且所述药学上可接受的载。
5、体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂。9一种试剂盒,其包含权利要求6所述的抗体、权利要求7所述的抗体偶联物、或者权利要求5所述的引物对;具体地,所述试剂盒为用于诊断结核病特别是肺肺结核或者检测结核杆菌的试剂盒。10一种筛选药物的模型,其包含权利要求1所述的蛋白或者权利要求2所述的核苷酸;具体地,所述药物为诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为抗结核杆菌的药物。11权利要求1所述的蛋白或者权利要求2所述的核苷酸在制备或者作为筛选药物的模型中的用途,具体地,所述所述药物为诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物。12。
6、权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的核苷酸、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组宿主细胞、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的抗体或者权利要求7所述的抗体偶联物在制备诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物(包括但不限于疫苗)或者制备检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物中的用途。权利要求书CN104151411A1/20页3用于结核病诊断的蛋白以及药物组合物技术领域0001本发明属于生物化学和免疫学领域,涉及一种用于结核病诊断的蛋白以及药物组合物。背景技术0002结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一,结核病是当今世界上成年人中的主要传染病,已对国际公共卫。
7、生构成严峻挑战。结核菌在感染人体以后,多处于潜伏状态或持续感染状态,它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一种微妙的平衡,感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下,10的感染者将发展为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人,一年能传染1015人。0003近五十年来,结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗水平与研究均有长足的进步。由于有效化疗药物异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺丁醇等的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广,使得结核病的发病率曾一度降低,以至于人们乐观地认为,结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期,由于过分乐观的估计形势,减少投资、缩减。
8、机构,放松对结核病的治疗与管理,结核病又在许多国家死灰复燃,发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于“全球紧急状态”,并呼吁“迅速采取行动与结核病危机进行斗争”,这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。耐药及耐多药结核病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。0004在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题。故此需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法。0005目前结核病毒诊断方法有(一)痰菌检查痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行,准确性较高,痰中查出结核菌,就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本,即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊。
9、断肺结核“金指标”但诊断率低,培养周期长。痰结核菌培养,结果可信度高,并能做结核菌药敏试验,但需时68周,应用受到限制。(二)射线检查胸部线检查可以早期发现结核病,而且可以确定病灶的部位、性质、范围,了解发病情况及用于治疗效果的判断,并且开展方便,病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变,可以弥补一般线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆,需要专业医生确证。(三)肺结核病免疫学诊断1常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验,该试验阳性是感染过结核菌的证据之一,但是假阳性率高,容易误诊。2血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断,也容易出现假阳率。3BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢。
10、物,一般两周可分离出分枝杆菌,但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。5聚合酶链反应(PCR),优点是敏感性可达98100,缺点是特异性较差。(四)其他检查只能作为辅助诊断,不能作为诊断依据。1纤维支气管镜检查,可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变,并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能,对于诊断和鉴别诊断特别有用。2胸腔镜和纵隔镜检查,均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结,并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3超声波检查,主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。说明书CN104151411A2/20页40006结核分枝杆菌(MTB)培养物滤液中有一种早期分泌抗原靶蛋白EARLYSECRE。
11、TORYANTIGENICTARGET,ESAT6,GENBANK登录号为NC_00962,GI57117165,相对分子质量为6000,在MTB感染早期即可被机体的免疫系统所识别,是重要的T细胞抗原抗原。ESAT6来源的合成多肽被广泛地用于外周血MTB特异性干扰素IFN应答情况的检测,临床上用于诊断是否有MTB感染指标之一RAVNPMUNKMEANDERSENABPROSPECTIVEEVALUATIONOFAWHOLEBLOODTESTUSINGMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSPECIFICANTIGENSESAT6ANDCFP10FORDIAGNOSISOFACTIV。
12、ETUBERCULOSIS2005;HARBCEMOETTEINGERTWIKERHGEVIDENCEFOROCEURRENCEOFTHEESAT6PROTEININMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISANDVIRULENTMYCOBACTERIUMBOVISANDFORITSABSENCEINMYCABACTERIUMBOVISBCG1996;ZHANG,M,HWANG,MLIAO,ETAL2010“DIAGNOSISOFLATENTTUBERCULOSISINFECTIONINBACILLECALMETTEGUERINVACCINATEDSUBJECTSINCHINABYIN。
13、TERFERONGAMMAELISPOTASSAY“INTJTUBERCLUNGDIS141215561563。0007尽管如此,目前尚需要发现新的诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识,以及新的检测诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的方法和试剂。发明内容0008本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,得到了一类蛋白,本发明人惊奇地发现,本发明的蛋白能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识,并且其具有良好的敏感性和特异性。由此提供了下述发明0009本发明的一个方面涉及一种分离的蛋白,其氨基酸序列如SEQIDNO1(本发明中有时称为RV0232)或SEQIDNO2(本发明中有时称为RV1031)所示。
14、。所述蛋白为用于结核病诊断或结核杆菌检测的蛋白。0010RV0232的氨基酸序列150AA0011KGSLFQYFADKRDLYAFIADIASQRVRSYMEDLIRELDPNRPFFEFLTDLLDGWVAYFAEHPRERALHAAATLEVDTDARISVRSVLHRHYLDVLRPLVRDAHARGDLRADSDTGALMSLLLLIFPHLALAPYMRGLDPILGLDEPTPEQ(SEQIDNO1)0012RV1031的氨基酸序列189AA0013MRRQLLPALTMLLVFTVITGIVYPLAVTGVGQLFFGDQANGALLERDGQVIGSAHIGQQFTAAKYF。
15、HPRPSSAGDGYDAAASSGSNLGPTNEKLLAAVAERVTAYRKENNLPADTLVPVDAVTGSGSGLDPAISVVNAKLQAPRVAQARNISIRQVERLIEDHTDARGLGFLGERAVNVLRLNLALDRL(SEQIDNO2)0014本发明的另一方面一种分离的核苷酸,其编码本发明的蛋白;具体地,所述核苷酸的序列如SEQIDNO3或SEQIDNO4所示。0015RV0232的核苷酸序列(读码框)450BP0016AAGGGCAGCCTGTTCCAGTACTTCGCGGACAAGCGCGACCTCTACGCGTTTATTGCCGACATCGCCAGCCAGC。
16、GAGTCCGCTCCTACATGGAGGACCTGATCCGCGAGCTGGACCCGAACCGGCCGTTCTTCGAATTCCTCACCGACCTGCTCGATGGCTGGGTCGCCTACTTCGCCGAGCATCCTCGGGAACGTGCGTTGCATGCTGCGGCGACCCTGGAGGTCGACACCGATGCCCGCATCAGCGTGCGCAGCGTCCTGCACCGCCACTACCTGGACGTGCTACGGCCGCTGGTGCGCGACGCGCACGCGCGGGGCGACCTGCGCGCAGATTCCGACACCGGTGCATTGATGTCGCTGCTGCTGCTG说明书C。
17、N104151411A3/20页5ATCTTTCCGCACCTGGCGCTGGCTCCATACATGCGTGGTTTGGATCCGATCCTGGGCCTCGACGAGCCCACACCTGAGCAG(SEQIDNO3)0017RV1031的核苷酸序列(读码框)570BP0018ATGCGTCGTCAATTACTGCCCGCGCTCACCATGCTGTTGGTGTTCACCGTCATCACCGGCATCGTCTACCCGCTTGCCGTGACCGGCGTCGGGCAACTGTTCTTCGGTGACCAGGCGAACGGCGCGCTGCTCGAGCGGGACGGGCAGGTCATCGGCTCCGCC。
18、CACATCGGCCAGCAGTTCACCGCCGCGAAGTACTTCCACCCGCGCCCCTCGTCGGCAGGCGACGGTTACGACGCTGCGGCGAGCTCGGGCTCCAACCTGGGACCGACGAACGAGAAGCTGCTGGCGGCCGTCGCTGAACGGGTCACCGCCTACCGCAAGGAAAACAATCTGCCGGCCGATACGCTGGTTCCGGTCGACGCGGTTACCGGCTCGGGTTCCGGGCTGGACCCGGCCATATCGGTGGTCAATGCCAAGCTGCAGGCACCGCGGGTGGCGCAGGCGCGCAATATCTCGATAAGG。
19、CAGGTCGAGCGTCTGATCGAGGACCACACCGACGCGCGTGGTCTCGGCTTCCTGGGCGAGCGCGCGGTGAACGTGCTCAGGCTGAACCTCGCATTGGATCGCCTCTGA(SEQIDNO4)0019RV0232和RV1031的读码框的核苷酸序列可以由实施例1或2中的相应的质粒或PCR产物测序得到,并可进一步根据读码框核苷酸序列推知编码的氨基酸序列。当然,上述的读码框的核苷酸序列也可以通过人工合成得到。所述蛋白可以通过将读码框序列通过合适的表达载体和宿主细胞得到。0020本发明的再一方面涉及一种重组载体,其含有本发明的核苷酸。0021本发明的再一方面。
20、涉及一种重组宿主细胞,其含有本发明的重组载体。0022本发明的再一方面涉及一种引物对,其包含SEQIDNO7和SEQIDNO8所示的核苷酸序列,和/或包含SEQIDNO9和SEQIDNO10所示的核苷酸序列。具体地,所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO7和SEQIDNO8所示,和/或如SEQIDNO9和SEQIDNO10所示。0023本发明的再一方面涉及一种抗体,其能够与本发明的蛋白(RV0232和/或RV1031)特异性结合;具体地,所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体;具体地,所述抗体连接有可检测的标记物。0024所述多克隆抗体或单克隆抗体可以参照本领域人员知悉的方法制备。0025在本发明中。
21、,术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义,例如抗原抗体间的结合。0026本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物,包括抗体部分和偶联部分,其中,所述抗体部分为本发明的抗体,所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。0027本发明的再一方面涉及一种组合物,其含有本发明的蛋白(RV0232和/或RV1031)、本发明的核苷酸、本发明的重组载体、本发明的重组宿主细胞、本发明的引物对、本发明的抗体、或者本发明的抗体偶联物;可选地,所述组合物(药物组合物)还含有药学上可接受的载体或赋形剂;具体地,所述组合物为疫苗组合物,并且所述药学上可接受的载体或。
22、赋形剂为疫苗用载体或赋形剂。0028在本发明中,术语“疫苗用载体或赋形剂”是指选自如下物质的一种或多种,包括但不限于PH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。具体地,例如,PH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液,表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂。其中,非离子型表面活性剂包括但不限于TWEEN80。佐剂包括但不限于氢氧化铝,氟氏完全佐剂。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。说明书CN104151411A4/20页60029本发明的再一方面涉及一种试剂盒,其包含本发明的抗体、本发明的抗体偶联物、或者本发明的引物对;具体地,所述试剂盒为用于诊断结核病特别是肺肺结核或者检测结核。
23、杆菌的试剂盒。0030本发明的再一方面涉及一种筛选药物的模型,其包含本发明的蛋白(RV0232和/或RV1031)或者本发明的核苷酸;具体地,所述药物为诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为抗结核杆菌的药物。0031例如,可以通过被筛选的药物是否能够检测本发明的蛋白(RV0232和/或RV1031)或者本发明的核苷酸,来判断被筛选的药物是否能够用作诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为抗结核杆菌的药物。0032本发明的再一方面涉及本发明的蛋白或者本发明的核苷酸在制备或者作为筛选药物的模型中的用途,具体地,所述所述药物为诊断和/或治疗和。
24、/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物。0033本发明的再一方面涉及本发明的蛋白(RV0232和/或RV1031)、本发明的核苷酸、本发明的重组载体、本发明的重组宿主细胞、本发明的引物对、本发明的抗体或者本发明的抗体偶联物在制备诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物(包括但不限于疫苗)或者制备检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物中的用途。0034本发明的再一方面涉及一种在体内或体外检测结核杆菌的方法,包括使用本发明的抗体或者本发明的引物对的步骤;具体地,所述方法为抗原检测方法(例如WESTERNBLOT或者ELISA)或者PCR法。。
25、一种在体内或体外检测结核杆菌的方法,其为ELISPOT法。检测的样本包括但不限于被检测者的痰液、血液、组织、淋巴细胞、DNA等等。0035本发明的再一方面涉及一种诊断结核病特别是肺结核的方法,包括使用本发明的抗体或者本发明的引物对的步骤;具体地,所述方法为抗原检测方法(例如WESTERNBLOT或者ELISA)或者PCR法。一种诊断结核病特别是肺结核的方法,其为ELISPOT法。0036下面还给出了本发明涉及的部分术语的解释。0037表达载体0038本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体,该载体可以包括。
26、一个或多个方便的限制位点,以便在这些位点插入或取代编码本发明的蛋白或抗体的核酸序列。或者,可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时,可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作地连接。0039重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。0040载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构,可独立于染色体进行复制),例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者,。
27、载体是一个当导入宿主细胞时,将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外,可应用单个载体或质粒,或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒,或转座子。说明书CN104151411A5/20页70041优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因,其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性,或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的DAL基因,或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。0042优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中,或保证载体在细胞中独。
28、立于细胞基因组而进行自主复制的元件。0043就进行自主复制的情况而言,载体还可以包含复制起点,使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如,FEHRLICH,1978,美国国家科学院学报751433)。0044可以向宿主细胞插入一个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少一个附加拷贝插入宿主细胞基因组中,或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记,通过在有合适选择试剂存在下培养细胞,挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。0045用于连接上述各元件来构建本发明。
29、所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如SAMBROOK等,分子克隆实验手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989)。0046宿主细胞0047本发明还涉及包含可用来重组生产本发明的蛋白或抗体的本发明所述核酸序列(多核苷酸)的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞,从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于本发明的蛋白或抗体编码基因及其来源。0048宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞,例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人。
30、员熟知的技术将载体导入宿主细胞。0049制备方法0050本发明还涉及重组制备本发明本发明的蛋白或抗体的方法,该方法包括A在适于产生本发明的蛋白或抗体的条件下,培养含有核酸构建体的宿主细胞,该核酸构建体包含编码所述本发明的蛋白或抗体的核酸序列;和B回收该肽。0051在本发明所述制备方法中,用本领域已知方法在合适本发明的蛋白或抗体产生的营养培养基中培养细胞。例如,可以在合适的培养基中,在允许本发明的蛋白或抗体表达和/或分离的条件下,通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的培养基中,采用本领域已知的步骤进。
31、行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如,美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果本发明的蛋白或抗体被分泌到培养基中,则可以直接从培养基中回收。如果本发明的蛋白或抗体不分泌,可以从细胞裂解物中回收。0052可以用本领域已知方法回收所产生的本发明的蛋白或抗体。例如,可以通过常规操作(包括,但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收。0053可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述本发明的蛋白或抗体,这些操说明书CN104151411A6/20页8作包括,但不限于层析(例如,离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、HP。
32、LC、电泳(例如,制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDSPAGE或抽提(例如参见,蛋白质纯化,JCJANSON和LARSRYDEN编,VCHPUBLISHERS,NEWYORK,1989)。0054在本发明中,术语“结核杆菌”,包括但不限于,例如,结核分枝杆菌;术语“结核分枝杆菌”包括但不限于,结核分枝杆菌H37RV。0055发明的有益效果0056本发明的蛋白可以作为作为结核病(例如肺结核)或结核杆菌细胞免疫诊断分子标识,具有良好的符合率和反应强度。附图说明0057图1目的基因RV0232和RV1031的电泳结果,各泳道的样品从左往右依次是RV1031、DNAMARKER、R。
33、V0232。0058图2表达后RV0232和RV1031的PAGE结果。各泳道的样品从左往右依次是蛋白MARKER、RV1031、RV2032。0059图3RV0232和RV1031蛋白纯化的PAGE结果。各泳道的样品从左往右依次是蛋白MARKER、RV1031、RV2032。0060图4表达蛋白初筛结果示例。0061图5部分蛋白的ELISPOT鉴定部分结果。具体实施方式0062下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J萨姆布鲁。
34、克等著,黄培堂等译的分子克隆实验指南,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。0063实施例1MTBH37RV的相关基因的克隆和表达(GATEWAY法)0064INVITROGEN公司的GATEWAY技术为蛋白的重组和表达提供了一种可能,它是从PCR产物开始创建GATEWAYTM入门克隆。这种方法是通过合并ATTB位点到上游和下游引物上,然后共同孵育PCR扩增产物和PDONRTM包含ATTP位点以及GATEWAYTMBPCLONASETM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中,将会获得包含目的基因的入门克隆,同时目的基因两侧具有ATT。
35、L重组位点。这个入门克隆可以与GATEWAYTM目的载体PDEST17进行重组表达,快速高效得到目的蛋白WALHOUTAJ,TEMPLEGF,BRASCHMAETALGATEWAYRECOMBINATIONALCLONINGAPPLICATIONTOTHECLONINGOFLARGENUMBERSOFOPENREADINGFRAMESORORFEOMESMETHODSENZYMOL,2000,328575592;RACHAELMGOLDSTONE,NICOLEJMORELAND,GHADERBASHIRI,ETALANEWGATEWAY_VECTORANDEXPRESSIONPROTOCOLF。
36、ORFASTANDEFFICIENTRECOMBINANTPROTEINEXPRESSIONINMYCOBACTERIUMSMEGMATISPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION5720088187;AHIGHTHROUGHPUTSCREENTOIDENTIFYSECRETEDANDTRANSMEMBRANEPROTEINSINVOLVEDINDROSOPHILA说明书CN104151411A7/20页9EMBRYOGENESISPNAS19989599739978。0065本实验以于MTBH37RV的基因组为模板,利用INVITROGEN公司提供的GATEWAY技术。
37、,表达全部ORF编码的蛋白质,经过WESTERNBLOT方法检测临床血浆获得具有较高敏感性特异性抗原,为临床诊断、疾病治疗、预防控制提供坚实的物质基础。0066一、实验方法00671基因序列的获取0068根据已经公开的MTBH37RV的ORFS基因序列,用PRIMERDESIGNER设计引物序列,按照GATEWAY系统的引物设计方案,为引物序列添加ATTB臂,由北京新擎科公司完成引物的合成。0069其为正向引物臂为0070GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC(SEQIDNO5);0071反向引物臂为0072GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCC。
38、TA(SEQIDNO6)。0073共完成引物设计3535对,因篇幅所限,部分引物如下面的表1所示。0074表1部分合成引物(不含ATT臂的部分)0075说明书CN104151411A8/20页100076以H37RV基因组为模板(来源于北京结核病预防控制所),用添加了ATTB臂的正反向引物来扩增不同ORFS,PCR体系如下说明书CN104151411A109/20页1100770078PCR反应条件为98热启动(初试温度为94),97变性1MIN,60(5865)退火1MIN,72延伸3MIN,30个循环。最后72温育,30MIN。0079取5LPCR扩增产物在08琼脂糖凝胶进行电泳,用DNA。
39、MARKERDL2,000作标准分子量,在紫外灯下观察电泳结果,并进行拍照。0080琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下切出含有目的大小DNA片断的胶块,每切一次,用超纯水冲洗刀片,并擦干净,将切下的胶片尽可能的切成小片,放入EPPDORF管;短暂离心,观看体积,加3倍体积的QG,50水浴,10MIN,直到胶完全溶解(溶液呈黄色),水浴过程中,反转EPPENDORF管23次每隔3MIN,如果片断大小在400BP以下或4000BP以上,则在EP管中加1倍体积的异丙醇,混匀;将溶解的胶液加入到QIAQUICKSPINCOLUMN中,12000R/MIN,离心1MIN弃去收集管中液体;在QIAQUICKSP。
40、INCOLUMN中再加入500L的溶胶液QG,12000R/MIN,离心1MIN,以除去多余的琼脂,弃去收集管中液体,在QIAQUICKSPINCOLUMN中加入750L洗液PE,静止35MIN,12000R/MIN,离心1MIN;弃去废液,12000R/MIN,再次离心1MIN;将QIAQUICKSPINCOLUMN放入新的写好编号15MLEPPENDORF管,在QIAQUICKSPINCOLUMN中心加50L温热的DNA溶解液(EB溶液),静止5MIN,然后12000R/MIN离心1MIN,把EPPENDORF管中液体重复离心一次,以增加DNA洗脱量。0081琼脂糖凝胶电泳检测,定量,20。
41、保存,备用。00822GATEWAY系统的BP反应0083重组是从PCR产物创建GATEWAYTM入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并ATTB位点到上游和下游引物上,然后共同孵育PCR扩增产物和PDONRTM载体包含ATTP位点以及GATEWAYTMBPCLONASETM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中,将会获得包含目的基因的入门克隆,同时目的基因两侧具有ATTL重组位点。这个入门克隆可以与任何GATEWAYTM目的载体进行重组。0084反应体系同时设阳性对照,PEXP7TET50NG/L,取1L,其余用水补齐;0085ATTBPCRPRODUCT10NG/LFINALAMOUNT15150。
42、NG,7L;0086PDONRTM211,1L;说明书CN104151411A1110/20页120087TEBUFFER,PH80,8L。0088从低温冰箱取出BPCLONASETMIIENZYMEMIX冰上融解,漩涡震荡二次,每次2S,每孔样品加入2LBPCLONASETMII,震荡二次,轻微离心;将BPCLONASETMIIENZYMEMIXTO迅速放回低温冰箱;25C孵育过夜;每孔2G/L蛋白激酶K加入1L,37C,1H,终止反应。将连接好的反应产物,转化感受态细胞。00893重组质粒的转化0090按照参考文献(J萨姆布鲁克,DW拉塞尔主编分子克隆实验指南M第三版,912171265)。
43、执行,从低温冰箱取出已经制备好的感受态菌并向其中加入35L连接产物,混匀后冰浴30MIN。将96孔板移入42水浴中,恰好停留90S(切忌振荡);立即将96孔板置于冰浴中,5MIN;向96孔板中加入450LLB液体培养基,在37恒温振荡(2000R/MIN)培养60MIN。收集培养的细菌,涂布到带卡那霉素抗性的LA平板上,37孵育过夜;挑取单克隆菌落接种,散布在50L灭菌超纯水中,99变性,做菌落PCR,验证是否为阳性克隆,同时分出25L接种在含有卡那霉素抗性96孔板中(LB培养基);37孵育过夜,准备提取质粒。0091菌落PCR引物的选择根据PDONR221质粒而来,此菌落扩增是从M13噬菌体。
44、开始的,选用0092M13FORWARDPRIMERGTAAAACGACGGCCAGT(SEQIDNO39);REVERSEPRIMERCAGGAAACAGCTATGAC(SEQIDNO40);0093阳性对照H37RV基因组DNA05L,25L体系,用水补齐;阴性对照不加菌。009425LPCR体系00950096PCR反应条件为98热启动97变性1MIN,60退火1MIN,72延伸3MIN,30个循环。最后72温育30MIN。009708琼脂糖凝胶电泳,鉴定阳性克隆菌落(大小正确的即为阳性)以待下步提质粒建立EETRYCLONE。00984质粒提取说明书CN104151411A1211/2。
45、0页13009996孔板质粒的提取方法,在96V型底板中得到纯化后的DNA。0100QIAGEN试剂盒提取高拷贝质粒PDONR221和低拷贝质粒PDEST17(HTTP/WWWQIAGENCOM)0101提取质粒用缓冲液BUFFERI(重悬液)室温保存,BUFFERII(裂解液)室温保存,BUFFERIII(中和液)室温保存,BUFFERIV(杂质清除液A),4保存。BUFFERV(杂质清除液B)室温保存,BUFFERVI(杂质清除液C),4保存,RNASEA(20MG/ML)20保存。0102所需其它试剂TE(TRISHCL10MM,EDTA1MM,PH80,超纯水配制,高压或过滤灭菌),异。
46、丙醇和70乙醇(超纯水与无水乙醇配制)。0103试剂盒可作20次(150ML菌液/次)质粒提取纯化。常温运输。RNASEA于20保存,首次使用时加入BUFFERI中混匀,置4保存。BUFFERIV与BUFFERVI置4保存,其余溶液保存于室温。有效期6个月。BUFFERII和BUFFERV可能会有沉淀产生。请各在37水浴和50水浴加热溶解,然后混匀使用。BUFFERIV如有分层,混匀即可使用。0104质粒提取前准备将RNASEA加入BUFFERP1终浓度为100G/ML;如果BUFFERP2有沉淀可以加热到37溶解;预冷BUFFERP3至40105质粒的提取步骤01061)向QIAGENTIP。
47、500加入10ML的QBT,使溶液随重力流线,预平衡之;01072)挑取单克隆菌落接种到4MLLB培养基中,300R/MIN培养过夜;第二天按1500放大,加入氨苄青霉素终浓度为50G/ML,培养1216H,收集500ML菌液,装入合适的离心瓶中,6,000G,于4离心15MIN沉淀菌体,完全弃除上清。01083加入125MLBUFFERI,充分混悬震荡菌体沉淀,使其完全分散开,至无絮块存在。加入125MLBUFFERII,轻轻颠倒离心管68次,室温放置5MIN,使细菌完全裂解,溶液透明。01094加入125ML预冷BUFFERIII,立即颠倒离心管68次,充分混匀,至白色絮状物产生。冰上放置。
48、30MIN。01105上述裂解液于420000G离心30MIN,小心吸出上清,移入新的离心管中。01116420000G再次离心15MIN,小心吸出上清,提前平衡好的GIAGENTIP中。靠重力流出液体,质粒进入树脂;01127加入600ML的BUFFERQC洗涤;01138加入100MLBUFFERQF,洗脱;01149)加入70ML的室温放置的异丙醇,混合,立即15,000G,4离心30MIN;011510)用室温放置的70的乙醇洗涤,15,000G,4离心10MIN;011611)干燥1020MIN,加入1MLTEE(PH80);011712)反复溶解一次。011813)琼脂糖电泳鉴定提。
49、取得质粒DNA。01195LR反应,BP反应产生入门克隆0120LR反应是含ATTL位点的入门克隆(ENTRYCLONE)和包含ATTR位点的目的载体之间的重组反应。LR反应产生一表达克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异的启动子或者一些元件。说明书CN104151411A1312/20页140121反应体系,同时设阳性对照PENTRTMGUS(卡那霉素抗性)0122入门克隆50150NG7L0123DESTIONATIONVECTOR150NG/L,PDEST171L0124TEBUFFER,PH80总计8L0125从低温冰箱取出LRCLONASETMIIENZYMEMIX冰上融解,漩涡震荡二次,每次2S,0126每孔样品加入2LLRCLONASETMIIENZYMEMIX,震荡二次,轻微离心;0127将LRCLONASETMIIENZYMEMIX迅速放回低温冰箱;012825C孵育过夜;0129每孔加入2G/L蛋白激酶K1L,终止反应。0130将连接好的反应产物,转化感受态细胞。0131质粒提取同上,以表达质粒PCR来验证阳性结果,25L体系,引物引物的选择ATTB位点已经恢复,0132FORWARDPR。