桑树中期染色体的荧光原位杂交方法.pdf

本发明公开了桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，具体步骤为：先采用酶解去壁低渗火焰干燥法制备染色体玻片标本，该方法能够获得高质量的桑树染色体制片；然后制备5S rDNA和25S rDNA探针，该探针为重复序列，荧光信号强，易于检测，重复性高；最后进行染色体荧光原位杂交，获得桑树染色体形态完好，能够用于桑树染色体鉴定和结构研究，为桑树的进化研究等提供了新的途径。

1.  桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)染色体玻片标本的制备：将桑树嫩叶于浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液中、25℃避光预处理3小时，用固定液固定后用水冲洗，然后将桑叶于1/15M的KCl溶液中、25℃低渗30～60分钟，低渗后用水冲洗，再将冲洗后的桑叶于含3-5％(W/V)纤维素酶和3-5％(W/V)果胶酶的混合酶液中、25℃酶解2-5小时，用水冲洗后在水中处理10～120分钟；然后将材料磨成匀浆，加入固定液，静置5min弃沉淀，收集上层细胞悬液，将收集的细胞悬液再静置30min，收集下层细胞悬液，然后将细胞悬液滴在载玻片上，微微加热烤干，再将载玻片置于35-40℃的烘箱中烘片30min-120min，-20℃保存备用；
(2)5S rDNA和25S rDNA探针标记：分别以含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒为模板，分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物，采用PCR法合成地高辛或生物素标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针，分别得5S rDNA探针和25S rDNA探针；
(3)染色体荧光原位杂交：将步骤(1)保存的染色体玻片标本在37℃条件下烘片2h，然后用RNase浓度为100μg/mL的2×SSC溶液在37℃温育1h，再用蛋白酶K浓度为1μg/mL的2×SSC溶液在37℃孵育15min，接着在37℃用2×SSC洗涤5min，在18-25℃用2×SSC洗涤2次，每次5min；然后在72℃条件下用含70％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液变性10min，完毕在18-25℃下依次用-20℃预冷的体积分数为70％、90％和100％的无水乙醇各处理5min，晾干；然后向染色体玻片标本上加封阻液，并在37℃封阻15min，再用含5S rDNA探针或/和25S rDNA探针的变性杂交液加在封阻的染色体玻片标本上，盖片后在80℃共变性10min；然后在37℃孵育过夜，接着在37℃下用含10％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液洗10s，在37℃下用2×SSC溶液洗涤2次，每次3min，再在18-25℃下用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min；然后在37℃下用1×封闭液封闭20min，再在染色体玻片标本上滴加荧光标记的抗地高辛或生物素的抗体，在37℃避光孵育1h，然后在37℃下，用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min，再在18-25℃下用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min，接着在18-25℃下用浓度为1μg/mL的DAPI避光复染5min，用2×SSC溶液清洗2min后在染色体制片上滴加抗荧光淬灭剂，盖片，封片，镜检。

2.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：所述固定为用固定液于4℃条件下固定至少2小时，所述固定液为甲醇与冰乙酸体积比为3:1的溶液。

3.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：所述含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒由如下方法制备：以川桑基因组 DNA为模板，分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物对进行PCR扩增，分别获得如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，然后分别与pMD19-T载体连接，分别得含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒。

4.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：合成所述探针的反应体系为：50pg含有SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒，1μM SEQ ID NO.1与1μM SEQ ID NO.2或1μM SEQ ID NO.3与1μM SEQ ID NO.4所示的引物，200μM dATP，200μM dCTP，200μM dGTP，130μM dTTP，70μM DIG-dUTP或Biotin-dUTP，0.75μL聚合酶，5μL10×PCR Buffer，加ddH₂O至总体积为50μL。

5.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：合成所述探针的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

6.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：所述杂交液各组分的终浓度如下：2×SSC，125ng/μL的鲑鱼精DNA，0.25％(W/V)SDS，10％(W/V)DS，50％(V/V)去离子甲酰胺，6ng/μL探针。

7.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：所述变性杂交液的变性方法如下：将杂交液于95℃变性6min，再置冰上孵育至少10min。

8.  根据权利要求1所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：所述封阻液为2×SSC，125ng/μL的鲑鱼精DNA，0.25％(W/V)SDS，10％(W/V)DS，50％(V/V)去离子甲酰胺。

9.  根据权利要求1-8任一项所述桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：所述荧光标记的抗地高辛抗体是浓度为2ng/μL的荧光素标记的抗地高辛抗体，所述荧光标记的抗生物素抗体是浓度为10ng/μL的Cy3标记的抗生物素抗体。

桑树中期染色体的荧光原位杂交方法
技术领域
本发明属于遗传学领域，具体涉及桑树中期染色体的荧光原位杂交方法。
背景技术
桑树(Morus alba L.)是桑科桑属植物，作为重要的经济林木，其叶片是家蚕的主要饲料。桑树已有七千多年的栽培历史，但常见的桑树多为通过扦插和嫁接繁殖的栽培种，遗传背景比较模糊，使得桑树在遗传育种和进化分析的研究中遇到很大的障碍。目前，桑树染色体常规核型分析已有报道，桑树拥有丰富的染色体倍数变化类型，例如川桑(M.notabilis)的染色体为14条，印度桑(M.indica)、白桑(M.alba)为28条，山桑(M.bombycis)是42条，而黑桑(M.nigra)存在308条染色体。但是利用吉姆萨染色形成的G带和C带分辨率有限，不能将所有染色体一一分开，特别是在二倍体的川桑中就有三对点状染色体，它们之间在形态上基本没有差异；在高倍体中，染色体形态更为接近，通常表现为点状，常规的染色体核型分析很难将它们区分。因此，高分辨率的核型分析技术有待开发。
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybrization，FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，能够将与探针互补的DNA序列直观的定位到染色体上，并且寡拷贝的探针还能够锚定在单一的染色体上，为染色体的研究提供了很大的便利。目前，该方法已经广泛应用于遗传作图、转基因定位、染色体畸变检测、基因组结构和物种进化分析等方面。但是，在FISH染色体制片过程中，预处理，探针和抗体的浓度、探针和染色体共变性的温度和时间均影响实验结果，如预处理是否合适是染色体制片技术中最关键的操作步骤，决定着染色体长度是否适中，是否利于杂交；如果低渗和酶解不足或过度都会导致染色体制片的失败；而探针和抗体的浓度过高，容易导致洗脱不完全，导致非特异性杂交，出现假阳性；探针和染色体共变性的温度和时间也十分关键，如果共变性温度低或时间短，双链没有完全打开，不会杂交出特异信号，而共变性温度过高或时间过长都会导致染色体膨胀变形，不利于得到正常的实验结果。FISH技术已在很多植物上运用成功，但是，迄今为止在桑树中还未见荧光原位杂交技术应用的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，该方法简单，观察到桑树中期染色体的形态完好，信号强。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
(1)染色体玻片标本的制备：将桑树嫩叶于浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液中、25℃避光预处理3小时，用固定液固定后用水冲洗，然后将桑叶于1/15M的KCl溶液中、25℃低渗30～60分钟，低渗后用水冲洗，再将冲洗后的桑叶于含3-5％(W/V)纤维素酶和3-5％(W/V)果胶酶的混合酶液中、25℃酶解2-5小时，用水冲洗后在水中处理10～120分钟；然后将材料磨成匀浆，加入固定液，静置5min弃沉淀，收集上层细胞悬液，将收集的细胞悬液再静置30min，收集下层细胞悬液，然后将细胞悬液滴在载玻片上，加热烤干，再将载玻片置于35-40℃的烘箱中烘片30min-120min，-20℃保存备用；
(2)5S rDNA和25S rDNA探针标记：分别以含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒为模板，分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物，采用PCR法合成地高辛或生物素标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针，分别得5S rDNA探针和25S rDNA探针；
(3)染色体荧光原位杂交：将步骤(1)保存的染色体玻片标本在37℃条件下烘片2h，然后用RNase浓度为100μg/mL的2×SSC溶液在37℃温育1h，再用蛋白酶K浓度为1μg/mL的2×SSC溶液在37℃孵育15min，接着在37℃用2×SSC洗涤5min，在18-25℃用2×SSC洗涤2次，每次5min；然后在72℃条件下用含70％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液变性10min，完毕在18-25℃下依次用-20℃预冷的体积分数为70％、90％和100％的无水乙醇各处理5min，晾干；然后向染色体玻片标本上加封阻液，并在37℃封阻15min，再用含5S rDNA探针或/和25S rDNA探针的变性杂交液加在封阻的染色体玻片标本上，盖片后在80℃共变性10min；然后在37℃孵育过夜，接着在37℃下用含10％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液洗10s，在37℃下用2×SSC溶液洗涤2次，每次3min，再在18-25℃下用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min；然后在37℃下用1×封闭液封闭20min，再在染色体玻片标本上滴加荧光标记的抗生物素或地高辛的抗体，在37℃避光孵育1h，然后在37℃下，用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min，再在18-25℃下用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min，接着在18-25℃下用浓度为1μg/mL的DAPI避光复染5min，用2×SSC溶液清 洗2min后在染色体制片上滴加抗荧光淬灭剂，盖片，封片，镜检。
优选的，所述固定为用固定液于4℃条件下固定至少2小时，所述固定液为甲醇与冰乙酸体积比为3:1的溶液。
优选的，所述含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒由如下方法制备：以川桑基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物对进行PCR扩增，分别获得如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，然后分别与pMD19-T载体连接，分别得含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒。
优选的，合成所述探针的反应体系为：50pg含有SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒，1μM SEQ ID NO.1与1μM SEQ ID NO.2或1μM SEQ ID NO.3与1μM SEQ ID NO.4所示的引物，200μM dATP，200μM dCTP，200μM dGTP，130μM dTTP，70μM DIG-dUTP或Biotin-dUTP，0.75μL聚合酶，5μL10×PCR Buffer，加ddH₂O至总体积为50μL。
优选的，合成所述探针的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
优选的，所述杂交液各组分的终浓度如下：2×SSC，125ng/μL的鲑鱼精DNA，0.25％(W/V)SDS，10％(W/V)DS，50％(V/V)去离子甲酰胺，6ng/μL探针。
更优选的，所述变性杂交液的变性方法如下：将杂交液于95℃变性6min，再置冰上孵育至少10min。
更优选的，所述封阻液为2×SSC，125ng/μL的鲑鱼精DNA，0.25％(W/V)SDS，10％(W/V)DS，50％(V/V)去离子甲酰胺。
最优选的，所述荧光标记的抗地高辛抗体是浓度为2ng/μL的荧光素标记的抗地高辛抗体，所述荧光标记的抗生物素抗体是浓度为10ng/μL的Cy3标记的抗生物素抗体。
本发明的有益效果在于：本发明在制片过程中通过采用合适的预处理条件得到的桑树染色体长度适中，有利于后续探针和染色体的杂交；同时优化低渗和酶解条件，使其获得的桑树染色体形态良好，且分散良好；在制片时采用火焰干燥染色体制片方法，该方法可获取高质量的桑树染色体制片；在探针选择时设计重复序列，因此探针的荧光信号强，易于检测，且重复性高；在探针和染色体共变性时选择合适的温度和时间得到的桑树染色体形态完好，变性完全，且信号点清晰，数目稳定；同时探针和抗体的浓度适中、洗脱条件合适，得到的 信号点明亮度适中，没有杂质信号；此外重复序列的探针还能有效的区分桑树中形态相似的非同源染色体，因此本发明的方法用于观察桑树有丝分裂中期染色体，可有效用于各桑树品种染色体遗传关系的分辨，为桑树染色体鉴定和结构研究、桑树的进化研究等提供了新的技术和途径。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为5S rDNA在川桑中期染色体上信号位点分布图像(A为合成图，箭头处代表5S rDNA信号位点，B为DAPI图)。
图2为25S rDNA在川桑中期染色体上信号位点分布图像(A为合成图，星号处代表25S rDNA信号位点，B为DAPI图)。
图3为5S rDNA和25S rDNA同时在川桑中期染色体上信号位点分布图像(A为合成图，箭头处代表5S rDNA信号位点，星号处代表25S rDNA信号位点，B为DAPI图)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例野生品种川桑嫩叶取自四川雅安荥经县原始森林。
实施例1
桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
(1)染色体玻片标本的制备：以川桑嫩叶为材料，采用去壁低渗火焰干燥法制备染色体玻片标本，具体步骤如下：
将川桑嫩叶于浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液中25℃避光预处理3小时，然后用甲醇：冰乙酸体积比为3:1的固定液于4℃固定2小时以上，再用蒸馏水冲洗3次；接着将固定后的桑叶于1/15M的KCl水溶液中25℃低渗30分钟，用蒸馏水冲洗2次后于含5％(W/V)纤维素酶和5％(W/V)果胶酶的混合溶液中在25℃酶解2小时，然后用蒸馏水冲洗3次并在蒸馏水中停留10分钟；冲洗后用枪头将材料磨成匀浆，向匀浆液中加入1mL甲醇：冰乙酸体积比为3:1的固定液，静置5min，弃去沉淀，将上层细胞悬液再静置30min，除去上层 清液，收集350μL左右细胞悬液，最后将制得的细胞悬液用枪吸取2-3滴滴在载玻片上，并在酒精灯上微微加热烤干，再将载玻片置于37℃的烘箱中烘片30min，-20℃保存备用；
(2)5S rDNA探针制备：根据5S rDNA genes的保守区域序列，在保守区内设计扩增5S rDNA的引物，具体如下：
5S rDNA正向引物：5’-cataccagcactaatgcaccg-3’(SEQ ID NO.1)；
5S rDNA反向引物：5’-ggaggtcacccatcctagta-3’(SEQ ID NO.2)；
然后以川桑基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2为引物对进行PCR扩增，获得如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，然后与pMD19-T simple vector连接，得pMD19-5S rDNA；
再以获得的重组质粒pMD19-5S rDNA为模板，采用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)试剂盒制备5S rDNA探针，标记探针的扩增体系为：50pg重组质粒pMD19-5S rDNA，1μM SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示的引物，200μM dATP，200μM dCTP，200μM dGTP，130μM dTTP，70μM DIG-dUTP，0.75μL Enzyme Mix，5μL PCR Buffer with Mg²⁺(10×conc.)，加ddH₂O至总体积为50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(3)染色体荧光原位杂交(FISH)，具体步骤为：
将步骤(1)保存的染色体玻片标本在37℃条件下烘片2h，然后用RNase浓度为100μg/mL的2×SSC溶液在37℃温育1h；再用蛋白酶K浓度为1μg/mL的2×SSC溶液在37℃孵育15min，接着在37℃用2×SSC洗涤5min，在18-25℃用2×SSC洗涤2次，每次5min；然后在72℃条件下，用含70％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液变性10min，完毕立即在18-25℃下，分别用-20℃预冷的体积分数为70％、90％和100％无水乙醇各处理5min，晾干；
将杂交液于95℃变性6min，立即置冰上孵育10min以上；将封阻液加在染色体玻片标本上，在37℃封阻15min；然后将变性后的杂交液加在染色体制片的靶基因组区域，盖片后在80℃共变性10min，共变性后在37℃孵育过夜，接着在37℃下用含10％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液洗10s，在37℃下用2×SSC溶液洗涤2次，每次3min，再在18-25℃下用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min；然后在37℃下用1×封闭液封闭20分钟，再在染色体玻片标本上滴加含浓度为2ng/μL的来源于羊的荧光素标记的抗地高辛抗体(Anti-digoxigenin-fluorescein,Fab fragments(from sheep))的1×封闭液，37℃避光孵育1h，然后在37℃下，用含0.2％(V/V)吐温-20的4×SSC溶液洗3min，再在18-25℃下用0.2％(V/V) 吐温-20的4×SSC溶液洗3min，接着在18-25℃下用浓度为1μg/mL的DAPI避光复染5min，再用2×SSC溶液清洗2min，最后在染色体制片上滴加一滴抗荧光猝灭剂，盖片，封片，镜检，-20℃保存。镜检结果如图1所示。
上述实施例所使用杂交液的终浓度如下：2×SSC，125ng/μL的鲑鱼精DNA，0.25％(W/V)SDS，10％(W/V)DS，50％(V/V)去离子甲酰胺，6ng/μL地高辛标记的5S rDNA探针；封阻液与杂交液的区别在于不含有探针DNA。
实施例2
桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
(1)染色体玻片标本的制备，制备方法与实施例1相同；
(2)25S rDNA探针制备：根据25S rDNA genes的保守区域序列，在保守区内设计扩增25S rDNA的引物，具体如下：
25S rDNA正向引物：5’-ccaaatgcctcgtcatctaa-3’(SEQ ID NO.3)；
25S rDNA反向引物：5’-gcgaatcaacggttcctct-3’(SEQ ID NO.4)；
然后以川桑基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物对进行PCR扩增，获得如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，然后与pMD19-T simple vector连接，得pMD19-25S rDNA；
再以获得的重组质粒pMD19-25S rDNA为模板，采用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)试剂盒制备25S rDNA探针，标记探针的扩增体系为：50pg重组质粒pMD19-25S rDNA，1μM SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4所示的引物，200μM dATP，200μM dCTP，200μM dGTP，130μM dTTP，70μM DIG-dUTP，0.75μL Enzyme Mix，5μL PCR Buffer with Mg²⁺(10×conc.)，加ddH₂O至总体积为50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(3)染色体荧光原位杂交，其染色体荧光原位杂交与实施例1相同，区别在于杂交液中所加的探针为地高辛标记的25S rDNA探针。镜检结果如图2所示。
实施例3
实施例3对桑树中期染色体荧光原位杂交的方法与实施例1相同，区别在于杂交液中所加的探针为生物素标记的5S rDNA探针和地高辛标记的25S rDNA探针的混合探针；生物素标记的5S rDNA探针制备方法与实施例1中5S rDNA探针的制备方法相同，区别在于使用 PCR Biotin Probe Synthesis Kit(Roche)制备探针，该试剂盒中含有Biotin-dUTP。抗体孵育时先用浓度为2ng/μL的来源于羊的荧光素标记的抗地高辛抗体(Anti-digoxigenin-fluorescein,Fab fragments(from sheep))孵育1h后，再用浓度为10ng/μL的Cy3标记的抗生物素抗体(Cy^TM3-Streptavidin Conjugate(ZyMAX^TM Grade))孵育1h，镜检结果如图3所示。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。