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1、(10)申请公布号 CN 102578076 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102578076 A *CN102578076A* (21)申请号 201210007383.6 (22)申请日 2012.01.11 A01N 1/02(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院长江水产研究 所 地址 430223 湖北省武汉市武汉东湖高新技 术开发区武大园一路 8 号 (72)发明人 柳凌 邹桂伟 张涛 梁宏伟 张洁明 李忠 郭峰 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (54) 发明名称 一种罗非鱼精子通用稀释液及制备方法 (57)。
2、 摘要 本发明公开了一种罗非鱼精子通用稀释液及 制备方法， 它由氯化钠、 氯化钾、 碳酸氢钠、 氯化钙 按一定比例制成， 其制备步骤为 A、 精子稀释液母 液的配制 ： (1) 每毫升含氯化钠 1mmol 的母液的 制备 ； (2) 每毫升含氯化钾 1mmol 的母液的制备 ； (3) 每毫升含氯化钙 0.5mmol 的母液的制备 ； (4) 每毫升含碳酸氢钠0.5mmol的母液的制备 ； (5)上 述母液均放置 4冰箱保存 ； B、 精子稀释液的配 制 ： (1) 用微量取样器从各组分母液中量取配制 稀释液 ； (2) 将上述各组分混合均匀 ； (3) 配制好 的稀释液放置 4冰箱保存， 备。
3、用。本发明配方合 理， 使用方便， 适合各种罗非鱼品种精子的稀释， 方法易行， 操作简便， 适合配制各种体积的稀释 液， 可确保所配制稀释液中个组分浓度的准确性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 7 页 1/3 页 2 1. 一种罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ： 稀释液渗透压为 265.4 320.6mOsM， pH 为 8-9 ； 一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法， 其步骤是 ： A、 精子稀释液母液的配制 ： (1) 每毫升含氯化钠 1mmol 的母液 。
4、： 根据母液的浓度、 体积和氯化钠分子量计算出配制 母液需要的氯化钠重量， 称取氯化钠， 将氯化钠放入烧杯中， 加入配制母液体积二分之一的 蒸馏水， 使氯化钠充分溶解， 将溶解后的氯化钠溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中， 用 510ml蒸馏水洗涤3次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量 瓶刻度处 ； (2) 每毫升含氯化钾 1mmol 的母液 ： 根据母液的浓度、 体积和氯化钾分子量计算出配制 母液需要的氯化钾重量， 称取氯化钾， 将氯化钾放入烧杯中， 加入母液体积二分之一的蒸馏 水， 使氯化钾充分溶解， 将溶解后的氯化钾溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中， 用 5。
5、 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量瓶 刻度处 ； (3) 每毫升含氯化钙 0.5mmol 的母液 ： 根据母液的浓度、 体积和氯化钙分子量计算出配 制母液需要的氯化钙重量， 称取的氯化钙， 将氯化钙放入烧杯中， 加入配制母液体积二分之 一的蒸馏水， 使氯化钙充分溶解， 将溶解后的氯化钙溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶 中， 用 5 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容 至容量瓶刻度处 ； (4) 每毫升含碳酸氢钠 0.5mmol 的母液 ： 根据母液的浓度、 体积和碳酸氢钠分子量计算 出配。
6、制母液的碳酸氢钠重量， 称取碳酸氢钠， 将碳酸氢钠放入烧杯中， 加入配制母液体积二 分之一的蒸馏水， 使碳酸氢钠充分溶解， 将溶解后的碳酸氢钠溶液倒入配制母液同样体积 的容量瓶中， 用 5 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸 馏水定容至容量瓶刻度处 ； (5) 上述母液均放置 4冰箱保存 ； B、 精子稀释液的配制 ： (1) 用微量取样器从各组分母液中量取配制稀释液， 量取各组分的体积根据稀释液配 方中各组分的浓度、 各组分母液的浓度、 以及配制的稀释液体积， 按如下公式计算 ： 量取体积配方浓度 稀释液体积 母液浓度 ； (2) 将上述各组分混合均。
7、匀， 配制的稀释液体积 100ml， 在体积的容量瓶中混匀， 然后 用蒸馏水定容至容量瓶刻度 ； (3) 配制好的稀释液放置 4冰箱保存， 备用。 权 利 要 求 书 CN 102578076 A 2 2/3 页 3 2. 根据权利要求 1 所述的一种罗非鱼精子通用稀释液， 其特征在于 ： 稀释液渗透压为 273.0 314.2mOsM， pH 为 8.1-8.8。 3. 根据权利要求 1 所述的一种罗非鱼精子通用稀释液， 其特征在于 ： 稀释液渗透压为 280.0 307.0mOsM， pH 为 8.3-8.6。 4. 根据权利要求 1 所述的一种罗非鱼精子通用稀释液， 其特征在于 ： 稀释。
8、液渗透压为 285.8 300.6mOsM， pH 为 8.4-8.5。 5. 根据权利要求 1 所述的一种罗非鱼精子通用稀释液， 其特征在于 ： 稀释液渗透压为 293.0mOsM， pH 为 8.5。 6. 根据权利要求 1 所述的一种罗非鱼精子通用稀释液， 其特征在于 ： 权 利 要 求 书 CN 102578076 A 3 3/3 页 4 本配方的稀释液渗透压为 293.0mOsM， pH 为 8.7。 权 利 要 求 书 CN 102578076 A 4 1/7 页 5 一种罗非鱼精子通用稀释液及制备方法 技术领域 0001 本发明涉及罗非鱼品种的精子技术领域， 更具体涉及一种罗非鱼。
9、精子通用稀释 液， 同时还涉及一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法， 适合所有罗非鱼品种的精子。 背景技术 0002 罗非鱼 (Tilapia) 为一种中小型鱼， 被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。 原产于非洲， 上世纪 70 年代被引进到我国， 目前已成为我国一个重要的水产养殖品种。随 着我国对罗非鱼品种的选育和改良， 除最初引进的尼罗罗非鱼 (O.niloticus) 和奥尼亚罗 非鱼 (O.aureus) 外， 又培育了许多新的品种。如 ： 尼罗罗非鱼和奥尼亚罗非鱼的杂交后代 奥尼罗非鱼 ； 通过 3 系杂交选育的后代尼罗超雄鱼 ； 以及由 8 个品系的尼罗罗非鱼经杂交 混合选育的吉富。
10、罗非鱼等。 0003 为了能进一步开展罗非鱼的新品种选育， 以及罗非鱼的人工繁殖， 为市场提供更 优质的罗非鱼新品种和苗种， 需要进行罗非鱼精子超低温保存和人工繁殖。 然而， 无论是精 子的超低温保存， 还是进行人工繁殖， 都需要一种稀释液对罗非鱼精子进行稀释。 这是因为 罗非鱼精液中所含精子的密度很高， 一般可以达到 1.4 1.8109个 /ml。当对罗非鱼精 子进行超低温保存时， 含高密度精子的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的。这是因 为在冷冻过程中， 当温度降到 0 -20区间时， 被保存的精液中会形成冰晶， 冰晶像锋 利的刀一样刺向四周的精子， 将精子刺破。 精液中的精子密度越高。
11、， 精子被刺破的概率也越 高。这种在冷冻过程中冰晶对精子的物理损伤将直接导致精子超低温冷冻保存的失败。因 此， 冷冻前必须要对精子进行稀释， 这就需要有一种适合罗非鱼精子的精子稀释液。 而在进 行罗非鱼人工繁殖时， 由于精液中含精子的密度很高， 如果直接用来进行人工授精， 不仅对 非常宝贵的精液是一种浪费， 而且， 因为精子密度过高， 精液的黏稠度增加， 使精子不易与 卵子混合均匀， 从而导致授精效果也不好。如果对精液进行稀释后， 再用来进行人工授精， 可大大降低人工授精的成本， 同时还能起到很好的授精效果， 获得较高的受精率。因此， 罗 非鱼精子稀释液的作用就是在不激活精子的前提下， 对精子。
12、进行稀释， 使精子尽可能的保 持其原有的生物学特性。 0004 然而， 精子稀释液是有一定要求的。 每种鱼类的精子都有自己一定的渗透压， 不同 种鱼类的渗透压是不同的。鱼类的精子在未遇见水或其它溶液前始终处在休眠状态， 淡水 鱼类只有在遇见低于自己渗透压的溶液或淡水时才能被激活， 而海水鱼类则要遇见高于自 己渗透压的溶液或海水时才能被激活。精子一旦被激活， 很快会衰减死亡。精子的寿命一 般很短， 短的只有几十秒， 长的也就几十分钟。要想对精子进行稀释， 首先要保证精子在稀 释液中不会被激活。 这就要求每种鱼的精子稀释液必须与这种鱼的精液渗透压尽可能的相 等。稀释液的渗透压是由稀释液中的离子浓度。
13、总和决定的， 不同浓度的稀释液就有不同的 渗透压， 调节稀释液中的离子浓度就能调节这种稀释液的渗透压， 从而达到与精液等渗的 效果。除此之外， 稀释液中不同的离子成分对精子又有不同的作用。如 ： 稀释液中的 Na 离 子主要是起调节稀释液渗透压的作用 ； K 离子起着改变精子膜表面通透性的作用 ； Ca、 Mg 离 说 明 书 CN 102578076 A 5 2/7 页 6 子则起着增加或降低精子运动速度的作用 ； 而 CO3离子则起着调节稀释液 pH 的作用等。除 此之外， 有报道显示葡萄糖等大分子类溶质除了起到调节渗透压的作用外， 还具有提供精 子能量的作用。 因此， 不同的鱼不仅稀释液。
14、浓度完全不同， 而且， 根据精子的生物学特性， 其 离子成分也会有很大差异。 发明内容 0005 本发明的目的是在于提供了一种罗非鱼精子通用稀释液， 配方合理， 使用方便， 适 合各种罗非鱼品种精子的稀释， 是罗非鱼精子超低温保存和进行人工授精所必须的一种溶 液。 在罗非鱼精子超低温保存过程中， 可确保精子不会被激活， 并最大限度降低冰晶对精子 的损伤。 在进行罗非鱼人工授精过程中， 可有效稀释精子， 降低人工授精成本， 提高受精率。 0006 本发明的另一个目的是在于提供了一种罗非鱼精子通用稀释液制备方法， 方法易 行， 操作简便， 适合配制各种体积的稀释液， 可确保所配制稀释液中个组分浓度。
15、的准确性。 0007 为了实现上述的目的， 本发明采用以下技术措施 ： 0008 一种罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ： 0009 0010 稀释液渗透压为 265.4 320.6mOsM， pH 为 8-9。 0011 一种罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ( 较好范围 ) ： 0012 0013 稀释液渗透压为 273.0 314.2mOsM， pH 为 8.1-8.8。 0014 一种罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ( 优选范围 ) ： 0015 说 明 书 CN 102578076 A 6 3/7 页 7 0016 稀释液渗透压为 2。
16、80.0 307.0mOsM， pH 为 8.3-8.6。 0017 罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ( 最佳范围 ) ： 0018 0019 0020 稀释液渗透压为 285.8 300.6mOsM， pH 为 8.4-8.5。 0021 一种罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ( 最佳值 ) ： 0022 0023 本配方的稀释液渗透压为 293.0mOsM， pH 为 8.5。 0024 一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法， 其步骤是 ： 0025 1. 精子稀释液母液的配制 ： 0026 (1) 每毫升含氯化钠 1mmol 的母液 ： 根据母液的浓度、 。
17、体积和氯化钠分子量计算 出配制母液需要的氯化钠重量， 计算精确度为 0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化 钠 (NaCl)， 将氯化钠 (NaCl) 放入烧杯中， 加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏 水， 使NaCl充分溶解， 将溶解后的氯化钠(NaCl)溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶 中， 用 5 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容 至容量瓶刻度处。NaCl 重量计算公式如下 ： 0027 溶质重量 ( 母液浓度 溶质分子量 ) 母液体积 0028 以下溶质重量均按此公式计算。 0029 (2) 每毫升含氯化钾 1mmol。
18、 的母液 ： 根据母液的浓度、 体积和氯化钾分子量计算出 配制母液需要的氯化钾重量， 计算精确度为 0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化钾 (KCl)， 将氯化钾 (KCl) 放入烧杯中， 加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水， 使氯化钾 (KCl) 充分溶解， 将溶解后的氯化钾 (KCl) 溶液倒入需要配制母液同样体积的容 量瓶中， 用 5 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水 定容至容量瓶刻度处。 0030 (3) 每毫升含氯化钙 0.5mmol 的母液 ： 根据母液的浓度、 体积和氯化钙分子量计算 出配制母液需要的氯化钙重量， 计。
19、算精确度为 0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化 说 明 书 CN 102578076 A 7 4/7 页 8 钙 (CaCl2)， 将氯化钙 (CaCl2) 放入烧杯中， 加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸 馏水， 使氯化钙 (CaCl2) 充分溶解， 将溶解后的 CaCl2溶液倒入需要配制母液同样体积的容 量瓶中， 用 5 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水 定容至容量瓶刻度处。 0031 (4) 每毫升含碳酸氢钠 0.5mmol 的母液 ： 根据母液的浓度、 体积和碳酸氢钠分子量 计算出配制母液需要的碳酸氢钠重量， 计算精确度为 。
20、0.0g。用天平精确称取该重量分析纯 的碳酸氢钠 (NaHCO3)， 将碳酸氢钠 (NaHCO3) 放入烧杯中， 加入体积约为需要配制母液体积 二分之一的蒸馏水， 使碳酸氢钠 (NaHCO3) 充分溶解， 将溶解后的 NaHCO3溶液倒入需要配制 母液同样体积的容量瓶中， 用 5 10ml 蒸馏水洗涤 3 次烧杯， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容 量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。 0032 (5) 上述母液均放置 4冰箱保存， 备用。 0033 2. 精子稀释液的配制 ： 0034 (1)用微量取样器(规格 ： 5l5ml)从各组分母液中精确量取配制稀释液所需 体积的各组分。量取各组分所需的。
21、体积根据稀释液配方中各组分的浓度、 各组分母液的浓 度、 以及所需配制的稀释液体积， 按如下公式计算 ： 0035 量取体积 ( 配方浓度 稀释液体积 ) 母液浓度 0036 (2) 将上述各组分混合均匀。如果需要配制的稀释液体积大于 100ml， 则在相应 体积的容量瓶中混匀， 然后用蒸馏水定容至容量瓶刻度。如果需要配制的稀释液体积小于 100ml， 则在玻璃瓶中混匀， 然后根据需要配制的稀释液体积减去已经量取的各组分体积总 和， 就是需要加入的蒸馏水体积 ( 因为容量瓶最小为 100ml)。 0037 (3) 配制好的稀释液放置 4冰箱保存， 备用。 0038 与其他鱼类精子稀释液的比较 。
22、： 0039 下表为罗非鱼精子与其他几种鱼类精子稀释液成分的比较 0040 说 明 书 CN 102578076 A 8 5/7 页 9 0041 罗非鱼精子通用精子稀释液与其他鱼类精子稀释液的比较， 具有以下优点和效 果 ： 0042 1.罗非鱼精子稀释液的成分和浓度与其它鱼类精子稀释液存在较大差异。 罗非鱼 精子稀释液属于无机盐组成的离子型稀释液， 同属这一类的稀释液有鲤鱼精子稀释液和鳗 鲡精子稀释液。但与鲤鱼精子稀释液比， 罗非鱼精子稀释液中多了 CaCl2成分。而与鳗鲡 精子稀释液比， 罗非鱼精子稀释液又少了 MgCl2成分。 0043 2. 罗非鱼精子稀释液的渗透压也与其它鱼类精子的。
23、渗透压存在较大差异。罗非 鱼精子稀释液属于中渗稀释液。其渗透压远高于中华鲟的低渗稀释液， 同时又远低于大 口鲶的高渗稀释液。与它较接近的有鲤鱼和白鲢精子稀释液， 但它比鲤鱼精子稀释液高 14.1mOsM， 而比白鲢精子稀释液低 29.2mOsM。 0044 3. 罗非鱼精子稀释液的 pH 虽然与有些鱼类基本相同， 如 ： 大口鲶、 鲤鱼。但与其 它鱼类的 pH 仍存在一定的差异。 具体实施方式 0045 实施例 1 ： 0046 以下以超低温保存 10ml 尼罗罗非鱼精液为例， 说明罗非鱼精子稀释液的配制和 使用方法。 0047 一种罗非鱼精子通用稀释液， 它由以下重量份的原料制成 ： 004。
24、8 0049 本配方的稀释液渗透压为 293.0mOsM， pH 为 8.7。 0050 一种罗非鱼精子通用稀释液的制备方法， 其步骤是 ： 0051 1. 精子稀释液母液的配制 ： 0052 (1) 配制 1000ml 浓度为 1M 的 NaCl 母液 ： 根据方法中描述的计算公式， 计算出需 要称取的氯化钠重量。用天平精确称取 58.4g 分析纯的 NaCl， 放置于 1000ml 烧杯中， 加入 约 500ml 蒸馏水， 待 NaCl 充分溶解后， 将其倒入 1000ml 容量瓶中， 每次用 5 10ml 蒸馏水 洗涤烧杯 3 次， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量。
25、瓶刻度处。 0053 (2)配制500ml浓度为1M的KCl母液 ： 根据方法中描述的计算公式， 计算出需要称 取的氯化钾重量。 用天平精确称取37.3g分析纯的KCl， 放置于500ml烧杯中， 加入约250ml 蒸馏水， 待 KCl 充分溶解后， 将其倒入 500ml 容量瓶中， 每次用 5 10ml 蒸馏水洗涤烧杯 3 次， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。 0054 (3)配制500ml浓度为0.5M的CaCl2母液 ： 根据方法中描述的计算公式， 计算出需 要称取的氯化钙重量。用天平精确称取 55.5g 分析纯的 CaCl2， 放置于 500ml 烧杯。
26、中， 加入 约 250ml 蒸馏水， 待 CaCl2充分溶解后， 将其倒入 500ml 容量瓶中， 每次用 5 10ml 蒸馏水 说 明 书 CN 102578076 A 9 6/7 页 10 洗涤烧杯 3 次， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。 0055 (4) 配制 500ml 浓度为 0.5M 的 NaHCO3母液 ： 根据方法中描述的计算公式， 计算出 需要称取的碳酸氢钠重量。用天平精确称取 42.0g 分析纯的 NaHCO3， 放置于 500ml 烧杯中， 加入约250ml蒸馏水， 待NaHCO3充分溶解后， 将其倒入500ml容量瓶中， 每次用510。
27、ml蒸 馏水洗涤烧杯 3 次， 将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶， 最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。 0056 (5) 上述母液均放置 4冰箱保存， 备用。 0057 2.100ml 精子稀释液的配制 ： 0058 (1) 根据公式 ： 量取体积 ( 配方浓度 稀释液体积 ) 母液浓度， 计算出需要 从母液中量取的各组分体积。具体体积见 (2) 中数据。 0059 (2) 分别精确量取 12.7ml 1M 的 NaCl 母液 ； 700l 1M 的 KCl 母液 ； 340l 0.5M 的 CaCl2母液 ； 400l NaHCO3 0.5M 的母液于 100ml 容量瓶中。 0060 (3) 将。
28、上述溶液混匀后， 加蒸馏水定容至 100ml。 0061 (4) 将上述配制好的 100ml 罗非鱼精子稀释液放置 4冰箱保存， 备用。 0062 3. 尼罗罗非鱼精子的超低温保存 ： 0063 (1) 罗非鱼精子的采集 ： 选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼 2 3 尾， 用干毛巾 擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部， 待挤出精液后， 前面几滴精液不要， 然后将精液挤入干燥的容器中。将挤出的精液混匀后， 准备镜检。 0064 (2) 精子活力检测 ： 在 1020 倍的显微镜下进行镜检， 计算机辅助检测鲜精平均 活率达到 85以上， 平均曲线运动速度 (VCL) 达到 35 微米 。
29、/ 秒以上， 平均直线运动速度达 到 20 微米 / 秒以上， 该精子便可用于超低温冷冻保存。放入 4冰箱保存， 备用。 0065 (3) 精液的稀释与平衡 ： 取 10ml 镜检后符合冷冻标准的精液， 加入 30ml 预先配制 好的罗非鱼精子稀释液， 稀释比为13。 精液与稀释液混匀后， 放置4冰箱， 冻前平衡20 分钟 2 小时。 0066 (4) 添加抗冻剂与分装 ： 将上述稀释平衡 20 分钟后的精液加入 3.2ml 二甲亚砜 (DMSO)， 使其终浓度达到 8左右， 混匀后立即分装。用 2ml 微量进样器将上述混合液吸入 2.0ml 冷冻管中。共分装 20 支冷冻管， 然后将冷冻管放。
30、在冷冻架上， 每 5 支冷冻管放 1 个冷 冻架， 共 4 个冷冻架。分装前应准备 1 个约 30cm30cm20cm 的泡沫箱， 箱内放入碎冰， 上 述操作全部在冰面完成， 且时间不能超过 1 小时 40 分钟。分装完成后， 立即将冷冻架放入 程序降温仪的冷冻仓中， 准备降温。 0067 (5) 程序降温 ： 降温程序从 0开始， 以 5 / 分钟的速度降至 -15， 在 -15停 留 5 分钟， 然后再以 25 / 分钟速度从 -15降至 -85， 最后在 -85处平衡 10 分钟。降 温完成后， 直接将装有麦管的冷冻架从程序降温仪中取出， 立即放入液氮罐中， 在 -196温 度中保存。 。
31、0068 实施例 2-6 说 明 书 CN 102578076 A 10 7/7 页 11 0069 0070 其制备方法实施例 1 相同。 0071 实施例 7 ： 0072 以下以人工授精 20 尾尼罗罗非鱼雌鱼的卵为例， 说明罗非鱼通用稀释液在人工 授精过程中的使用方法。 0073 1. 精子稀释液母液的配制 ： 0074 精子稀释液母液配制方法与案例一完全相同。 0075 2.20ml 精子稀释液的配制 ： 0076 (1) 根据公式 ： 量取体积 ( 配方浓度 稀释液体积 ) 母液浓度， 计算出需要 从母液中量取的各组分体积。具体体积见 (2) 中数据。 0077 (2) 分别精确量。
32、取 2.55ml 1M 的 NaCl 母液 ； 150l 1M 的 KCl 母液 ； 80l 0.5M 的 CaCl2母液 ； 100l 0.5M 的 NaHCO3母液于 30ml 指管瓶中。 0078 (3) 将上述溶液混匀后， 加 17.12ml 蒸馏水。 0079 (4) 将上述配制好的 20ml 罗非鱼精子稀释液放置 4冰箱保存， 备用。 0080 3. 尼罗罗非鱼的人工授精 0081 (1) 尼罗罗非鱼精子的采集 ： 选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼 1 2 尾， 用干 毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。 用手轻轻挤压雄鱼腹部， 待能挤出精液后， 前面几滴精液 不要， 然后将精液挤入干燥。
33、的容器中。将挤出的精液混匀后， 放入 4冰箱保存， 备用。 0082 (2) 精液的稀释与平衡 ： 用干燥的取样器取 5ml 精液， 加入 10ml 预先配制好的罗 非鱼精子稀释液， 稀释比为 1 2。精液与稀释液混匀后， 放置 4冰箱， 平衡 1 小时以上。 0083 注 ： 研究证明尼罗罗非鱼精液被稀释后， 在 4冰箱里存放 1 小时以上的授精效果 比不存放的效果要好很多。 0084 (3) 尼罗罗非鱼人工采卵 ： 待稀释后的精液在冰箱平衡 1 小时左右后， 选择 20 尾 性腺发育成熟的雌性尼罗罗非鱼， 分别用干毛巾揩干雌鱼生殖孔周围以及腹部， 按照自头 向尾方向轻轻挤压腹部， 将这 20 尾雌鱼的卵全部挤入干燥的容器中， 常温备用。 0085 (4) 尼罗罗非鱼人工授精 ： 将平衡好的 15ml 精液倒入卵中， 用羽毛轻轻搅匀。1 2 分钟后加入 250 300ml 预先配制好的罗非鱼精子激活液 ( 其配方另外发布 )， 轻轻搅拌 3 5 分钟， 静置 2 分钟后， 再加入 1000ml 以上清水。再轻轻搅拌 2 3 分钟后， 倒掉面上 的污水， 然后用此清水洗卵 2 3 次， 即可将卵移入孵化器中孵化。 说 明 书 CN 102578076 A 11 。