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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611162798.5 (22)申请日 2016.12.15 (71)申请人 湖南利诺生物药业有限公司 地址 424400 湖南省郴州市桂阳县工业园 芙蓉项目区 (72)发明人 陈云桢 柏越群 徐方兵 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 夏艳 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法 (57)摘要 本发明公开了软脚红杆铁皮。
2、石斛选育及系 代繁育方法， 该方法通过精选软脚红杆铁皮石斛 品种性状特征显著的父本和母本植株进行防护 培育直至开花， 然后进行同种异株人工授粉； 铁 皮石斛人工授粉后结出的优良成熟果夹， 采摘后 对其进行组培无菌繁育， 定向系统培养软脚红杆 铁皮石斛种苗植株， 在系代培养纯化品种。 该方 法能够成功选育出成活率高、 抗逆性强、 高产、 多 糖含量高、 胶质好基因遗传稳定的软脚红杆铁皮 石斛品种， 该品种成活率达99， 较其它铁皮石 斛高5个百分点。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106718839 A 2017.05.31 CN 106718839 A 1.软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方。
3、法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤： (1)、 选择软脚红杆铁皮石斛品种性状显著、 遗传基因相对稳定， 且经植物基因测序确 认的植株作为母本和父本种源； (2)、 将作为母本和父本种源的软脚红杆铁皮石斛幼苗置于大棚， 隔离栽培生长， 大棚 内空气相对湿度保持在8090， 温度2025， 日照时数： 10h/天， 2.21043 104lux光强， 且通风条件良好； (3)、 待软脚红杆铁皮石斛生长开花至花期绽放， 选择花蕾绽放24h内的晴天上午10： 00 13： 00时段进行人工异花授粉， 授粉成功的花朵会在7天内子房逐渐开始膨大坐果形成果 荚； (4)、 将培育成熟的果荚通过植物组织培。
4、养扩大繁殖； 所述植物组织培养分为两个阶 段： 种子培养和原球茎悬浮培养； 所述种子培养的具体操作为： (a)对人工授粉的铁皮石斛果荚进行杀菌消毒； (b)在无 菌条件下， 把种子接种到萌芽培养基上， 所述培养基为N6培养基， 蔗糖浓度1.62.2， NAA 浓度0.20.5mg/L； 培养温度2528， 光照度16002000lx， 光照1012h/天； (c)生根瓶 苗： 种子萌发后， 转瓶34次， 当幼苗长出45片真叶， 并具有34条12cm长的根时， 可将 试管苗进行练苗后移栽； 生根瓶苗的培养基为MS+NAA0.2mg/L+土豆汁10； 所述圆球茎悬浮培养的具体操作为： 悬浮培养的培。
5、养基为1/4MS+维生素C40mg/L， pH5.6， 摇床转速为50r/min， 15天继代一次， 黑暗培养， 得到分散性好、 整齐均一的原球茎。 2.根据权利要求1所述软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法， 其特征在于， 所述步骤 (4)种子培养的具体操作(a)杀菌消毒的具体操作为： 用75的酒精对铁皮石斛果实表面消 毒， 30s后再用0.1升汞消毒8min， 无菌水冲洗45次。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106718839 A 2 软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法 技术领域 0001 本发明属于铁皮石斛培育技术领域， 具体涉及软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育 方法。 背景技。
6、术 0002 铁皮石斛是我国传统名贵珍稀中药材， 被列为国家二级保护植物。 近年来在药用 及保健方面的突出作用越来越被广大消费者接受认可， 资源缺乏的瓶颈十分突出。 品种杂， 品质差是现今铁皮石斛种源存在的问题。 而品种变异和遗传基因不稳定， 容易杂交变种， 自 花授粉坐果低抗逆性差是品种选育的难题。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法， 该方法能针对性解决铁皮石斛品种杂、 品质差、 抗逆性差等问题， 对铁皮石斛产业的发展提 供了优质种源保障。 0004 本发明采用的技术方案是： 所述软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法， 包括以 下步骤： 。
7、0005 (1)、 选择软脚红杆铁皮石斛品种性状显著、 遗传基因相对稳定， 且经植物基因测 序确认的植株作为母本和父本种源； 0006 (2)、 将作为母本和父本种源的软脚红杆铁皮石斛幼苗置于大棚， 隔离栽培生长， 大棚内空气相对湿度保持在8090， 温度2025， 日照时数： 10h/天， 2.21043 104lux光强， 且通风条件良好； 0007 (3)、 待软脚红杆铁皮石斛生长开花至花期绽放， 选择花蕾绽放24h内的晴天上午 10： 0013： 00时段进行人工异花授粉， 授粉成功的花朵会在7天内子房逐渐开始膨大坐果 形成果荚； 0008 (4)、 将培育成熟的果荚通过植物组织培养扩。
8、大繁殖； 所述植物组织培养分为两个 阶段： 种子培养和原球茎悬浮培养； 0009 所述种子培养的具体操作为： (a)对人工授粉的铁皮石斛果荚进行杀菌消毒； (b) 在无菌条件下， 把种子接种到萌芽培养基上， 所述培养基为N6培养基， 蔗糖浓度1 .6 2.2， NAA浓度0.20.5mg/L； 培养温度2528， 光照度16002000lx， 光照1012h/天； (c)生根瓶苗： 种子萌发后， 转瓶34次， 当幼苗长出45片真叶， 并具有34条12cm长的 根时， 可将试管苗进行练苗后移栽； 生根瓶苗的培养基为MS+NAA 0.2mg/L+土豆汁10； 0010 所述圆球茎悬浮培养的具体操作。
9、为： 悬浮培养的培养基为1/4MS+维生素C40mg/L， pH5.6， 摇床转速为50r/min， 15天继代一次， 黑暗培养， 得到分散性好、 整齐均一的原球茎。 0011 其中， 上述软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法中， 所述步骤(4)种子培养的具 体操作(a)杀菌消毒的具体操作为： 用75的酒精对铁皮石斛果实表面消毒， 30s后再用 0.1升汞消毒8min， 无菌水冲洗45次。 说 明 书 1/4 页 3 CN 106718839 A 3 0012 本发明的有益效果是： 该方法能够成功选育出成活率高、 抗逆性强、 高产、 多糖含 量高、 胶质好基因遗传稳定的软脚红杆铁皮石斛品种， 该。
10、品种成活率达99， 较其它铁皮石 斛高5个百分点； 极少病害， 在铁皮石斛普遍较易发生的根腐病及黄叶病方面有明显抗性。 在自然气温-3的低温时不冻死， 40高温条件下仍能正常生长， 耐温性方面具有明显优 势； 年亩产高达700公斤， 多糖含量达48， 较其它品种铁皮石斛的产量和多糖含量分别高 37和50。 具体实施方式 0013 本发明提供了软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法， 该方法通过精选软脚红杆 铁皮石斛品种性状特征显著的父本和母本植株进行防护培育直至开花， 然后进行同种异株 人工授粉； 铁皮石斛人工授粉后结出的优良成熟果夹， 采摘后对其进行组培无菌繁育， 定向 系统培养软脚红杆铁皮石斛。
11、种苗植株， 在系代培养纯化品种。 0014 所述软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法， 包括以下步骤： 0015 (1)、 选择软脚红杆铁皮石斛品种性状显著、 遗传基因相对稳定， 且经植物基因测 序确认的植株作为母本和父本种源； 0016 (2)、 将作为母本和父本种源的软脚红杆铁皮石斛幼苗置于大棚， 隔离栽培生长， 大棚内空气相对湿度保持在8090， 温度2025， 日照时数： 10h/天， 2.21043 104lux光强， 且通风条件良好； 0017 (3)、 待软脚红杆铁皮石斛生长开花至花期绽放， 选择花蕾绽放24h内的晴天上午 10： 0013： 00时段进行人工异花授粉， 授粉成功的。
12、花朵会在7天内子房逐渐开始膨大坐果 形成果荚； 0018 (4)、 将培育成熟的果荚通过植物组织培养扩大繁殖； 所述植物组织培养分为两个 阶段： 种子培养和原球茎悬浮培养； 0019 所述种子培养的具体操作为： (a)对人工授粉的铁皮石斛果荚进行杀菌消毒： 用 75的酒精对铁皮石斛果实表面消毒， 30s后再用0.1升汞消毒8min， 无菌水冲洗45次； (b)在无菌条件下， 把种子接种到萌芽培养基上， 所述培养基为N6培养基， 蔗糖浓度1.6 2.2， NAA浓度0.20.5mg/L； 培养温度2528， 光照度16002000lx， 光照1012h/天； (c)生根瓶苗： 种子萌发后， 转瓶。
13、34次， 当幼苗长出45片真叶， 并具有34条12cm长的 根时， 可将试管苗进行练苗后移栽； 生根瓶苗的培养基为MS+NAA 0.2mg/L+土豆汁10； 0020 所述圆球茎悬浮培养的具体操作为： 悬浮培养的培养基为1/4MS+维生素C40mg/L， pH5.6， 摇床转速为50r/min， 15天继代一次， 黑暗培养， 得到分散性好、 整齐均一的原球茎。 0021 下面结合具体的实施例， 进一步阐述本发明， 实施例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围， 实施例中未注明具体条件的实施方法， 通常按常规条件。 0022 实施例 0023 软脚红杆铁皮石斛选育及系代繁育方法： 0024 。
14、(1)、 选择软脚红杆铁皮石斛品种性状显著、 遗传基因相对稳定， 且经植物基因测 序确认的植株作为母本和父本种源； 0025 (2)、 将作为母本和父本种源的软脚红杆铁皮石斛幼苗置于大棚， 隔离栽培生长， 大棚为标准选育大棚并配置智能调控光温水肥气热设备及专用防护网阻止外媒授粉； 成长 说 明 书 2/4 页 4 CN 106718839 A 4 条件如下： 0026 光照： 铁皮石斛的光饱和点、 光补偿点和净光合速率都低， 呼吸速率相对较高， 气 孔开张和净光合速率受相对湿度影响较大， 叶绿素b含量较高， 光合色素吸收短波光多， 阴 生植物的特性； 红杆软脚铁皮石斛石斛的人工留种栽培或进时，。
15、 应选择500 mol/m2s左右 光量子通量密度； 0027 湿度： 空气相对湿度保持8090； 0028 温度： 在2025， 通风条件良好的生态条件较为适宜； 0029 日照实数： 在10h/天2.21043104lux光强下， 石斛有较好的响应能力， 因此， 石斛栽培时不能完全用树林下的光强， 可适当补光或改用单层遮阳网提高其光合速率和产 量。 在生产中， 采用遮阳网大棚种植， 可随着季节的变化， 调节其光照强度。 0030 花期： 总状花序36月开花； 0031 果期： 铁皮石斛果荚为蒴果， 一个果荚内大约有50006000粒种子， 每年1012月 为果实成熟期。 0032 (3)、。
16、 人工授粉： 待软脚红杆铁皮石斛生长开花至花期绽放， 在花期选择花蕾张开 后24h内的晴天上午10： 003： 00时段进行人工异花授粉， 注意在授粉后24h内不能淋水； 授 粉成功的花朵会在7天内子房逐渐开始膨大坐果形成果荚。 0033 (4)、 组培扩繁： 将培育成熟的果荚通过植物组培扩大繁殖； 所述植物组织培养分 为两个阶段： 种子培养和原球茎悬浮培养； 0034 所述种子培养(胚培养)的具体操作为： 0035 (a)取人工授粉的铁皮石斛果实， 用75的酒精表面消毒， 30s后再用0.1升汞消 毒8分钟， 无菌水冲洗45次； (b)在无菌操作下， 把种子接种到萌芽培养基上， N6培养基对。
17、 种子萌发和生长最好， 蔗糖浓度2最佳， NAA浓度0.20.5mg/L最适合胚的萌发和生长； 种 子培养中加入椰乳对胚萌发和萌发后的初期生长起促进作用： 而香蕉汁对继代培养中石斛 的生根和壮苗起促进作用， 生根和壮苗培养中不加入NAA， 只用N6+10香蕉汁， 苗长得更粗 壮； 培养温度2528C， 光照度16002000lx， 每日1012小时。 0036 实验发现， 不同胚龄培养， 其萌发率不同： 胚龄45天以下， 萌发率极低， 萌发时间 长； 60天胚龄的胚具34个细胞， 萌发率为6； 90天胚龄的胚细胞为74个， 萌发率为87： 120 天胚龄的细胞数为90个， 萌发率95以上。 将。
18、萌芽石斛继代培养于N6+10香蕉汁生根壮苗 培养基中， 苗长得更粗壮。 0037 (c)生根瓶苗： 种子萌发后， 转瓶34次， 当幼苗长出45片真叶并具有34条1 2cm长的根时， 可将试管苗进行练苗后移栽。 生根瓶苗的适宜培养基为MS+NAA 0.2mg/L+土 豆汁10。 在此条件下建立的铁皮石斛快速繁殖体系， 原球茎在增殖与分化培养基上培养3 个月左右， 可分化出大量高约12cm的瓶苗， 转入生根培养基中培养3个月左右后诱导出大 量根系。 0038 所述原球茎悬浮培养的具体操作为： 铁皮石斛原球茎悬浮系， 用以制作人工种子 繁殖体。 悬浮培养的最适培养基为1/4MS+维生素C 40mg/。
19、L， pH5.6， 摇床转速为50r/min， 15 天继代一次， 黑暗培养。 培养基中添加ABA 0.5mg/L预培养30天， 原球茎的质量提高、 同步性 更好。 可以得到分散性好、 整齐均一的原球茎。 0039 本发明方法能够成功选育出成活率高、 抗逆性强、 高产、 多糖含量高、 胶质好基因 说 明 书 3/4 页 5 CN 106718839 A 5 遗传稳定的软脚红杆铁皮石斛品种， 该品种成活率达99， 较其它铁皮石斛高5个百分点； 极少病害， 在铁皮石斛普遍较易发生的根腐病及黄叶病方面有明显抗性。 在自然气温-3 的低温时不冻死， 40高温条件下仍能正常生长， 耐温性方面具有明显优势； 年亩产高达 700公斤， 多糖含量达48， 较其它品种铁皮石斛的产量和多糖含量分别高37和50。 0040 以上所述仅为本发明的实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本发 明说明书所作等效流程变换， 或直接或间接运用在其他相关的技术领域， 均同理包括在本 发明的专利保护范围内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106718839 A 6 。