发明背景
本发明涉及红细胞长期冷冻储存的方法。
冷藏的红细胞具有依赖于其所储存溶液的有限货架寿命。在美国，至少通过 测定输血后24小时受血者体内循环的细胞的比例来确定货架寿命。FDA非官方 地规定，得到许可的产品货架寿命最少为75％。输入的游离血红蛋白的量也可 限制货架寿命。虽然未规定官方的最大值，一般认可的是溶血不应超过1％。
人红细胞冷藏的两个一般方法是：(1)冷藏在原来的抗凝溶液中；(2)从原抗 凝溶液中分离出红细胞后再冷藏，将细胞再悬浮于为红细胞储存而专门设计的溶 液中。使用这两种方法中的任何一种时，至少有残留量的血浆留在红细胞溶液 中。
为了储存于原来的抗凝剂中，将全血常规地抽到含有柠檬酸盐、磷酸盐、右 旋糖(d-葡萄糖)和腺嘌呤(CPDA-1)的溶液中。将血以约1500×g离心(缓和地旋 转)，除去血浆，留下红细胞悬液，红细胞比容为约75％。通过第2次沉降可从 血浆中除去血小板。无论除去或不除去血浆，收集在CPDA-1中的细胞不作进一 步处理，可储存5周。
为了将红细胞再悬浮和储存于保存液中，将血液常规地抽到仅含有柠檬酸 盐、磷酸盐和葡萄糖的溶液中。将血液以上面所述同样的速度进行离心，但红细 胞再悬浮于约100ml添加剂溶液中，得到红细胞比容为约55％的红细胞悬液。 美国目前得到许可的两种添加剂溶液为如表1所限定的Adsol和Nutricel。另一 种已知的添加剂溶液Sagman在美国尚未被许可。有这种添加剂的储存细胞货架 寿命为6周。
表 1
成分 CPDA-1(mM) ADSOL(mM) NUTRICEL(mM)
柠檬酸钠 89.6 - 20.0
柠檬酸 15.6 - 2.0
右旋糖 161.0 111.0 55.5
NaH2PO4 16.1 - 20.0
腺嘌呤 2.0 2.0 2.2
甘露糖醇 - 41.2 -
NaCl - 154.0 70.1
渗透摩尔浓度 323 342 244
(mOsm)
pH 5.7 5.5 5.8
CPDA-1和ADSOL由Baxter Travenol销售，NUTRICEL由Cutter销售。
渗透摩尔浓度是由非渗透性成分产生的有效渗透摩尔浓度。
储存过程中，人红细胞经历着形态学和生物化学变化，包括三磷酸腺苷(ATP) 和2，3-二磷酸甘油酯(2，3-DPG)细胞水平的降低、细胞形态学改变和进行性溶血。 储存6周后，ATP的浓度在短暂的初始上升后进行性地降低至原来水平的30-40 ％。红细胞膜的流动性与ATP水平略为相关，这种膜的流动性是红细胞通过脾脏 和肝脏中狭窄管道所必须的。
红细胞在循环中的主要功能是将氧气输送到组织中。血红蛋白的独特性能是 能卸下它的大部分氧，即使组织中的氧分压可能相当高。称作2，3-二磷酸甘油酯 (2，3-DPG)的化合物是这个过程所必须的，在其缺乏时氧气则不能有效地输送到组 织中。在目前所采用的冷藏过程中，储存约3-4周后，2，3-DPG的水平迅速下降， 约10天就接近于0。
储存过程中出现形态学改变，最终导致红细胞上产生刺(棘红细胞病)。这些 刺可萌芽成囊泡，从根本上改变细胞的表面/体积比以及它们在通过狭窄的管道时 的变形能力。这样的细胞在输入后会被脾脏和肝脏滤出循环。如上所述，在输血 后24小时输入的红细胞至少75％必须能保留在循环中，这样的输血是可接受 的。ATP浓度和红细胞的形态是储存的红细胞适于输血的指征。
为了延长可输入红细胞的货架寿命，必须以某种可以防止ATP迅速下降的 方式储存或处理细胞，如果可能的话采用2，3-DPG。已知有些溶液延长红细胞的 货架寿命(例如，见Meryman，美国专利No.4,585,735和Meryman，美国专利No. 5,250,303，二者均全文在此引作参考)。这样的溶液典型地含有柠檬酸盐、磷酸 盐、葡萄糖和腺嘌呤，偶尔有在细胞水平上通过保持ATP水平而延长货架寿命的 其它成分。使用有效渗透摩尔浓度低至121mOsm的添加剂溶液已为人们所知。 然而，具有较低有效渗透摩尔浓度的溶液并未被使用。而且，在测得红细胞细胞 内pH(下文称作pHi)为约7.4时，糖酵解活性增强。
在细胞储存时间上的另一个重要因素是溶液的有效渗透摩尔浓度。人们发 现，在储存中，有效的低渗性实质上降低溶血和改善红细胞形态。虽然机制未明， 但可能是渗透性肿胀增加细胞表面张力，从而促进储存的红细胞通常所伴有的形 状改变。
洗涤红细胞时，可能获得正好没有细胞肿胀所致的溶血的最大程度低渗性。 然而，洗涤红细胞装置价格昂贵，而且目前还未被所获得的货架寿命延长证明是 正确的。目前所用的标准方法包括在起初的沉降后除去血浆，将100ml添加剂溶 液加到约200ml红细胞和50ml残余血浆中。
添加剂溶液的低渗性受添加溶液过程中溶血危险性的限制。虽然从理论上 说，添加剂不必包含足够的溶质以在渗透上支持红细胞，因为血浆提供额外的过 于低渗，但是，在加入溶液时，出现混合前，一些红细胞与添加剂溶液接触。如 果添加剂过于低渗，这些红细胞会胀破(溶血)。结果，太低渗的溶液不能使用。 因此，与细胞和残余血浆混合后溶液的最终渗透摩尔浓度不是特别低，低渗性的 优越性不足。
红细胞正常的是双凹碟形，在外部渗透摩尔浓度约170mOsm时可肿胀成 正常体积的近两倍才引起溶血。然而，已知当所谓大分子稳定剂即来自Hofmeister 系列左端的溶质存在于细胞的内部或外部时，发生膜膨胀，红细胞可肿胀至超出 其正常溶血体积，且直至细胞外渗透摩尔浓度约为70mOsm时才开始溶血。 Meryman，H.T.，″Influence of certain neutral solutes on red cell membrane area and permeability during hypotonic stress，″Am.Journ.Of Physiol.，225：365-371，1973.
因为迫切需要可输入的红细胞，因此非常重要的是不仅开发保持ATP和 2，3-DPG细胞内高水平且洗涤后形态好、溶血少的方法和溶液，而且开发具有比 目前的方法所获得的储存性能好的未洗涤红细胞的常规收集和再悬浮方法。
发明概述
本发明提供储存红细胞的方法，它导致储存过程中较大程度的低渗而不引起 储存溶液加到红细胞中时的细胞溶血。
本发明提供一种延长红细胞在冷藏条件下储存货架寿命的方法，包括：从红 细胞分离血浆而保留残余血浆；向所述红细胞中加入生物学上相容性溶液，其中 所述生物学上相容性溶液的有效渗透摩尔浓度低于70mOsm。
本发明还提供一种延长红细胞在冷藏条件下储存货架寿命的方法，其中加到 红细胞中的生物学上相容性溶液包括至少一种渗透性溶质，它渗透红细胞比水 慢，基本上没有非渗透性阴离子和非渗透性非电解质。
附图的简要说明
图1描绘本发明的一个实施例和一个比较实施例储存8周过程中的红细胞形 态学指数。
较佳实施例的详细描述
除非另有所指，此处所用的技术和科学术语和本领域技术人员普通理解的具 有同样的意义。此处提到的所有出版物均引作参考。
此处所用的“延长储存货架寿命”指长期保存活的红细胞，溶血少，细胞形 态学指数及ATP和2，3-DPG的水平大于用本领域技术人员所知的常规方法储存 的细胞的形态学指数、ATP和2，3-DPG的水平。
此处所用的“生物学上相容性溶液”是一种可输入的溶液，其中与其接触的 细胞保持成活力。接触包括细胞以任何方式暴露于溶液的过程，包括(但不限于) 细胞悬浮于溶液中。生物学上相容性溶液的pH和盐浓度适合于保持细胞膜的完 整性，并且不抑制或损害与其接触的细胞的生物学和生理学反应。典型的生物学 上相容性溶液其pH在6和9.5之间，是等渗的或仅轻度低渗或高渗。
此处所用的“渗透性溶质”是能自由穿越红细胞膜的溶质。这样的溶质既可 以是诸如葡萄糖的小分子电解质，也可是小的阴离子，如氯离子、乙酸根或磷酸 根。“非渗透性溶质”包括大分子非电解质，如甘露糖醇和蔗糖，或大阴离子， 如柠檬酸根、乙醇酸根和甘油磷酸根。阳离子因其电荷而不能渗透细胞膜。有一 个例外是铵离子以中性分子氨进入细胞，在细胞内重建离子状态。
此处所用的“缓慢渗透性溶质”是能自由穿透红细胞的细胞膜的渗透性溶 质，但其渗透速度低于水。缓慢渗透性溶质必须渗透得足够慢，以便在由缓慢渗 透性溶质提供的渗透支持因其扩散到细胞内而失去之前使添加剂溶液与血浆充 分混合。因此，如果细胞外溶液混合得快，缓慢渗透性溶质的扩散速度可增加。 一般说来，缓慢渗透性溶质在少于1秒内不应达到跨细胞膜平衡。缓慢渗透性溶 质以在少于10秒内不达到跨细胞膜平衡为佳，更佳的是在少于30秒内，甚至更 佳的是在少于1分钟内。这样的溶质可包括(但不限于)诸如葡萄糖、甘油和D-木 糖之类溶质。
此处所用的“残余血浆”指按本领域技术人员常规所用的将血浆与红细胞通 过离心和血浆压榨分离后红细胞悬液中保留的血浆量。一般说来，约50ml残余 血浆保留在260ml红细胞悬液中。
此处所用的“有效渗透摩尔浓度”指不渗透红细胞膜从而起决定红细胞体积 作用的溶质的合并渗透摩尔浓度。
此处所用的“冷藏条件”指在冷藏下储存红细胞的条件。冷藏条件包括(但 不限于)4±2℃。
本发明揭示了通过使用包含渗透红细胞比水慢的渗透性溶质的添加剂溶液 可增加添加剂溶液的低渗性。特别是可使用有效渗透摩尔浓度低于70mOsm的生 物学上相容性溶液。例如，通过控制溶液中非渗透性溶质的量以使溶液的渗透摩 尔浓度低于70mOsm，可形成具有这些性能的水溶液。然后使用缓慢渗透性溶质 增加溶液的渗透摩尔浓度，可使溶液与红细胞悬液等渗或接近等渗。所得到的溶 液提供必需的渗透支持，以避免向细胞悬液中加入溶液时的大量溶血。
缓慢渗透性溶质进入红细胞相当慢，但最终达到跨细胞膜浓度平衡。这意味 着，例如，红细胞可与葡萄糖等渗水溶液混合而不溶血。细胞外葡萄糖的渗透支 持会等于细胞内血红蛋白和盐的渗透支持。因此，红细胞体积不会改变。
然而，葡萄糖很快进入细胞，葡萄糖提供的渗透支持很快消失，细胞将会肿 胀。通过其渗透效应，最后结果就象纯水加到细胞悬液中，随着细胞外渗透摩尔 浓度的减小细胞就会肿胀。如果细胞外液中无非渗透性溶质，水会持续进入细胞 直至它们溶血。但是，本发明中，即使添加剂溶液不包含非渗透性溶质，残余血 浆仍提供足够的细胞外渗透支持以避免一旦出现平衡即溶血。
当溶液添加完成后，红细胞不需要同样多的渗透支持。水进入红细胞，稀释 其中的非渗透性溶质。这降低了红细胞的细胞内渗透摩尔浓度，从而降低所需的 细胞外渗透摩尔浓度。同时，水向红细胞内的渗透运动会导致稀的细胞外血浆某 些程度的浓缩。因此，当水进入细胞时，血浆的非渗透性溶质特别是钠使渗透支 持增加。储存溶液稀释残余血浆的程度将决定溶血容量，结果，实际上不引起溶 血的最终储存溶液的最小有效渗透摩尔浓度将会降低在300-70mOsm左右，可用 常规试验加以测定。
因为添加剂溶液包括至少一种渗透细胞比水慢的溶质，因此在不渗透支持红 细胞的溶液与红细胞接触前就可出现平衡。最后，在那些不自由扩散出细胞的细 胞内溶质(以血红蛋白和钾为主)和不渗透细胞的细胞外溶质(以血浆中的钠为主) 之间存在渗透平衡。净结果将是细胞体积增加。这种细胞肿胀在储存中提供了低 渗的好处。
因为残余血浆提供足够的细胞外渗透支持，因此添加剂溶液的有效渗透摩尔 浓度可低于70mOsm。较佳的是生物学上相容性溶液的有效渗透摩尔浓度低于 60mOsm，更佳的是溶液的有效渗透摩尔浓度低于50mOsm，甚至更佳的是有效 渗透摩尔浓度低于25mOsm，甚至还要佳的是有效渗透摩尔浓度低于15mOsm， 甚至还要更佳的是有效渗透摩尔浓度低于5mOsm。事实上，在本发明的最佳实 施例中，生物学上相容性溶液的有效渗透摩尔浓度为0。在此实施例中，全部细 胞外支持是由缓慢渗透性溶质渗透细胞后残余血浆的非渗透性溶质提供的。
生物学上相容性溶液以缓冲液为佳。此外，溶液的pH以高于红细胞悬液的 pH为佳。还有，添加剂溶液以比红细胞低渗为佳，但也可与红细胞等渗或高渗。 一旦缓慢渗透性溶质渗透红细胞，添加剂溶液本身对红细胞是低渗。
生物学上相容性溶液还可包含腺嘌呤，较佳为仅仅少量，例如2mmol。此外， 添加剂溶液可包含磷酸盐，例如以磷酸钠的形式，但也以少量为佳。还有，溶液 基本上不包含非渗透性阴离子和非渗透性非电解质。
鉴于几种理由，葡萄糖是较佳的缓慢渗透性溶质。第一，葡萄糖是支持红细 胞糖酵解所必需的。第二，它是熟悉的输液剂。最后，它是大分子稳定剂。
本发明的一个主要目的是使储存中红细胞的体积最大，以便获得体积增加的 全部好处，即改善储存中细胞形态和减少溶血。因为本发明的一个较佳实施例的 构成成分，即包含葡萄糖、磷酸盐和腺嘌呤的溶液全是大分子稳定剂，此溶液可 通过膜膨胀来降低红细胞会达到溶血体积的渗透摩尔浓度。
例如，可将100ml等渗葡萄糖与含约200ml红细胞和50ml残余血浆的细胞 悬液合并。葡萄糖提供短暂的渗透支持以防止混合时的溶血，但然后使细胞膜两 侧平衡，从而其“有效”渗透摩尔浓度为0。由于葡萄糖使细胞膜两侧平衡，它 不再对细胞提供渗透支持，就象100ml水加到细胞悬液中。因细胞外溶液的渗透 摩尔浓度减小，红细胞肿胀。净结果将是细胞体积增加约30％。在这个实施例 中，与血浆混合和葡萄糖平衡后，细胞悬液的有效渗透摩尔浓度为约200mOsm。 这实质上超过甚至在无膜膨胀时防止溶血所需的值。
如果使用较大容量添加剂溶液，可获得细胞更大的膨胀。较大程度的稀释会 降低最终的有效渗透摩尔浓度并增加稳定剂溶质的比例，因而促进膜膨胀，使终 溶液的有效渗透摩尔浓度降低至170mOsm以下而不溶血。
本领域技术人员会认识到上面讨论的方法可根据需要调节到获得具有特殊 性能的储存溶液。现根据具体实施例对本发明更进一步描述，需要理解的是，实 施例仅仅为了阐述，并不表示本发明受其中所引用的材料、条件、工艺参数等的 限制。
实施例1
将血液抽到含柠檬酸盐、磷酸盐和葡萄糖的溶液中得到红细胞悬液。将血液 于1500×g离心，除去血浆。将如表2所限定的添加剂溶液A 100ml加到红细 胞悬液中，所得溶液于4℃储存8周。冷藏中的红细胞的形态学指数表示于图1。
比较实施例1
如上所述得到红细胞悬液。将如表2所限定的添加剂溶液B 100ml加到红细 胞悬液中，所得溶液于4℃储存8周。冷藏中的红细胞的形态学指数表示于图1。
表2
成分 A(mM) B(mM)
葡萄糖 139 69
柠檬酸钠 - 18.4
Na2HPO4 12 12
NaH2PO4 2.9 2.9
腺嘌呤 2 2
甘露糖醇 - 22
渗透摩尔浓度(mOsm)
总值 176 176
有效值 34 109
pH 7.5 7.5
按实施例1储存的红细胞的形态学指数长时间保持于可接受的水平而无统计 学意义的红细胞溶血数的改变。特别是按实施例1储存的红细胞的形态学比按比 较实施例1储存的红细胞的形态学平均改善5％。而且，按比较实施例1储存的 红细胞的形态学指数在6周后降低至约75％；而在实施例1中，直至冷藏8周， 形态学指数也不降低至75％。因此，用本发明所述的添加剂溶液，红细胞可储 存较长的时间。