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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511032841.1 (22)申请日 2015.12.31 A23B 7/152(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 殷学仁 祝庆刚 刘晓芬 王苗苗 陈昆松 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 赵杭丽 (54) 发明名称 一种柿果实脱涩保鲜方法 (57) 摘要 本发明提供一种柿果实脱涩保鲜的方法。以 涩柿品种 “镜面柿” 和 “金瓶柿” 的脱涩保鲜过程 为例， 对该发明方法进行具体阐述。该方法包含 以下步骤 。
2、： (1) 将柿果实按照圆柱中空形状放置 于塑料桶中， 并在桶底、 果实中空处放置用信封包 裹的 0.2kg 高锰酸钾 ； (2) 将塑料桶密封， 并使桶 内维持含有 1l/L 1-MCP 且低氧 ( 1 ) 的环 境 24h ； (3) 采用氯化亚铁印迹技术检测柿果实脱 涩效果， 然后转货架至 20冷库中贮藏 ； (4) 通过 监测柿果实贮藏期间的硬度变化， 检测其保鲜效 果 ； (5) 分析柿果实贮藏期间的基因表达变化， 解 析该方法可使柿果实脱涩保鲜的分子机制。本方 法同样适用于其他涩柿品种的果实脱涩保鲜。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申。
3、请 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图2页 CN 105660834 A 2016.06.15 CN 105660834 A 1.一种柿果实脱涩保鲜的方法， 其特征包含以下几个步骤： (1)柿果实的放置： 将柿果实按照圆柱中空形状的摆放方式放置于带有排气管的塑料 桶中， 在桶底中空位置放置用信封包裹的0.2kg用水拌好的高锰酸钾的稠剂， 避免接触到柿 果实； (2)柿果实的处理： 将所需的1-MCP粉末置入粘贴于桶壁、 干燥的离心管中， 然后用带有 通气管的盖子密封塑料桶， 经桶盖的通气管将高纯CO2气体通入桶内， 并打开桶壁的排气管 以及桶盖内侧自带的小风扇， 进行气体的混匀， 直。
4、至桶内O2浓度 1时结束通气并密封通 气孔和排气孔； 通过排气管往桶壁的离心管中注入温水， 让1-MCP通过吸收水分缓慢释放， 此时桶内气体成分为95CO2， 4N2， 1O2和1 l/L的1-MCP； 应用这种低氧结合1-MCP环境 处理柿果实24h； (3)柿果实的脱涩效果检测： 将滤纸浸泡于5FeCl2溶液中10min， 然后置于60烘箱中 烘干； 将经过低氧结合1-MCP处理的柿果实沿纵切面切开后， 盖章到滤纸上， 滤纸置于果实 下5s， 依据滤纸上的印迹面积检测柿果实的脱涩效果； (4)柿果实的保鲜效果检测： 选用质构仪， Stable Micro System， UK， 分析柿果实。
5、的硬 度变化， 设定参数为探头7.5mm、 穿透深度5mm、 穿透速度1mm/s， 每个果实检测削去果皮的两 个垂直面的赤道部位； (5)分子机制分析： 应用实时定量PCR技术， 分析柿果实软化相关的基因表达变化， 结果 显示， 低氧结合1-MCP处理能减弱软化相关基因的表达， 进而延迟柿果实贮藏期间的软化， 达到保鲜的效果。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中所需的塑料桶， 要求是塑料 桶的桶壁上方和盖子上分别有人为安装的排气管和通气管， 均用软橡胶管连接， 其中盖子 内侧还有安装的小风扇， 接通电源后可起到混匀桶内气体的功能。 3.根据权利要求1所述的方法， 其。
6、特征在于， 所述步骤(2)中1-MCP粉末的处理方式为： 根据柿果实重量和桶的体积算出1 l/L处理所需的1-MCP粉末的质量， 称好后放入离心管的 底部， 离心管口正对塑料桶壁上的排气管口； 密封通气孔和排气孔后， 通过桶壁的排气管口 往桶壁上的离心管内注入6ml 40-50的温水， 让1-MCP通过吸收水分缓慢释放。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中在用低氧结合1-MCP环境处 理柿果实的第30min、 8h和16h时各打开桶盖内侧小风扇进行一次气体的混匀， 每次持续时 间为10min。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中柿果实脱涩。
7、效果的检测方 式为： 将直径12.5cm的滤纸浸泡于5FeCl2溶液中10min， 至其呈现均匀的淡黄色后， 置于 60烘箱烘干； 随机选取经过处理的柿果实， 沿纵切面切开后盖章到滤纸上， 滤纸置于果实 下5s， 依据滤纸上的印迹面积来检测柿果实的脱涩效果。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(5)中柿果实软化相关基因的表 达选用实时定量PCR技术， 选用： SsoFast EvaGreen Supermix 10 l， 10 M上下游引物各1 l， 5ng/ l cDNA模板2 l， DEPC水6 l， 终体积为20 l。 反应条件为： 50 2min； 95 2min；。
8、 95 15sec， 55 30sec， 72 30sec， 40个热循环； 熔解曲线分析65到95， 每5sec升高1 ； 结束。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105660834 A 2 一种柿果实脱涩保鲜方法 技术领域 0001 本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域， 涉及一种柿果实脱涩保鲜的方法 及其应用。 背景技术 0002 柿， 原产中国， 味道鲜美， 营养价值高， 是东亚地区(日本， 中国， 韩国等)最受欢迎 的水果之一。 柿的独特之处在于其果实在发育期间累积大量高分子的单宁， 呈现不同程度 的涩味， 即可溶性单宁含量越高， 柿果实涩味越严重， 而当可溶性单宁含量。
9、低于0.2时， 果 实涩味则不可被感知。 0003 柿根据其脱涩类型以及种子是否影响果实的涩味及颜色可以分为四类： 完全甜 柿、 完全涩柿、 非完全甜柿和不完全涩柿。 完全甜柿果实发育早期丧失合成单宁的能力， 故 其在树上能自然脱涩， 成熟采收的果实不呈涩味， 可直接食用。 然而涩柿果实由于积累了大 量的单宁， 涩味严重， 采后需经脱涩处理后方可食用。 0004 涩柿品种抗性强、 易丰产， 而且果实晚熟、 耐贮运， 是世界范围内栽培数量最大的 类型。 中国是柿的原产国， 也是世界上柿树栽培面积最大和柿果产量最多的国家， 据统计， 2011年我国柿树种植面积为72万公顷， 产量为305万吨。 栽。
10、培品种多为涩柿， 因此柿果实采 后脱涩是限制柿果实产业发展的最大问题。 0005 柿果实采后脱涩的方法多有报道， 例如树上乙醇蒸汽包裹果实， 高浓度的二氧化 碳或氮气处理， 温水浸泡或者交替冻融等。 然而这些脱涩处理方法， 或者操作手续繁杂， 或 者处理的柿果实快速软化、 不耐储运。 因此， 针对采后柿果实脱涩的产业问题， 急需一套既 能使果实脱涩又能有效保持果实硬度的脱涩保鲜方法。 0006 1-MCP是一种高效、 无残留的乙烯效应抑制剂， 可与细胞膜上的乙烯受体结合， 抑 制乙烯受体复合物的形成， 阻断乙烯所诱导的信号传递， 进而可与延长园艺产品采后的保 鲜贮藏期。 因此通过低氧结合1-M。
11、CP来进行柿果实的脱涩保鲜研究， 具有一定的可行性。 发明内容 0007 本发明的目的是公布一种柿果实采后快速脱涩并能保持其硬度的方法， 使柿果实 采后的快速脱涩和保鲜成为可能。 以涩柿品种 “镜面柿” 和 “金瓶柿” 脱涩保鲜为实例， 对该 发明方法进行具体阐述。 本发明方法同样适用于其他涩柿品种的采后脱涩保鲜。 0008 本发明的具体实施步骤如下： 0009 1、 柿果实的放置： 首先准备所需的塑料桶， 要求是塑料桶的桶壁上方和盖子上分 别有人为安装的排气管和通气管， 均用软橡胶管连接， 其中盖子内侧还有安装的小风扇， 接 通电源后可起到混匀桶内气体的功能。 然后将从树上采下的柿果实24h。
12、内进行田间热去除 和挑选处理， 剔除坏果、 病果等， 尽量保证处理的柿果实无病虫害， 大小一致。 挑选完毕， 将 柿果实按照圆柱中空形状的摆放方式放置于带有排气管的塑料桶中， 每个桶中放置40个柿 果实， 在桶底中空位置放置用信封包裹的0.2kg用水拌好的高锰酸钾的稠剂， 避免接触到柿 说 明 书 1/4 页 3 CN 105660834 A 3 果实。 其中柿果实的放置方法按照圆柱形中空排列， 以利于气体的混匀和保证果实和气体 的充分接触。 高锰酸钾水稠剂是为了吸收乙烯， 去除果实释放的乙烯对其保鲜的影响。 0010 2、 柿果实的处理： 根据柿果实重量和桶的体积(20L)算出1 l/L处理。
13、所需的1-MCP 粉末的质量， 称好后放入干燥的50ml离心管的底部， 离心管粘贴于桶壁， 且离心管口正对塑 料桶壁上的排气管口； 然后用带有通气管的盖子密封塑料桶后， 0011 经桶盖的通气管通入高纯CO2气体， 同时打开桶壁的排气管以及桶盖内侧自带的 小风扇， 进行气体的混匀， 直至检测到O2浓度 1时结束并密封通气管和排气管， 此时桶 内气体成分约为95CO2， 4N2和1O2； 最后通过桶壁的排气管口往桶壁上的离心管内注 入6ml 40-50的温水， 让1-MCP通过吸收水分缓慢释放， 此时桶内气体成分约为95 CO2， 4N2， 1O2和1 l/L的1-MCP； 应用这种低氧结合1-。
14、MCP环境处理柿果实24h， 期间在处 理柿果实的第30min、 8h和16h时各打开桶盖内侧小风扇进行一次气体的混匀， 每次持续时 间为10min。 0012 低氧环境的维持方式为： 塑料桶密封后， 经桶盖的通气管通入高纯CO2气体， 同时 打开桶壁的排气管以及桶盖内侧自带的小风扇， 进行气体的混匀， 直至检测到O2浓度 1 时结束并密封通气管和排气管， 此时桶内气体成分约为95CO2， 4N2和1O2。 0013 3、 柿果实的脱涩效果检测： 将直径12.5cm的滤纸浸泡于5FeCl2溶液中10min， 至 其呈现均匀的淡黄色后， 置于60烘箱中烘干； 随机选取经过处理的柿果实， 沿纵切面。
15、切开 后盖章到滤纸上(滤纸置于果实下5s)， 依据滤纸上的印迹面积来检测柿果实的脱涩效果。 0014 4、 柿果实的保鲜效果检测： 选用质构仪(Stable Micro System， UK)分析柿果实的 硬度变化， 各个参数设定为探头7.5mm、 穿透深度5mm、 穿透速度1mm/s， 每个果实检测削去果 皮的两个垂直面的赤道部位。 0015 5、 分子机制分析： 应用实时定量PCR技术， 分析柿果实软化相关的基因表达变化， 其中参数为： SsoFast EvaGreen Supermix 10 l， 10 M上下游引物各1 l， 5ng/ l cDNA模板 2 l， DEPC水6 l， 终。
16、体积为20 l。 反应条件为： 502min； 952min； 9515sec， 5530sec， 7230sec， 40个热循环； 熔解曲线分析65到95， 每5sec升高1； 结束。 结果显示， 低氧 结合1-MCP处理可减弱软化相关基因的表达， 进而延迟柿果实贮藏期间的软化， 达到保鲜的 效果。 0016 本发明应用低氧结合1-MCP的处理来进行涩柿品种 “镜面柿” 和 “金瓶柿” 柿果实的 脱涩保鲜， 通过处理后柿果实的单宁印迹和柿果实硬度的变化来检测脱涩保鲜效果， 并应 用实时定量PCR技术分析了该方法使柿果实脱涩保鲜的分子机制。 本发明公布的柿果实采 后快速脱涩保鲜的方法， 适用范。
17、围广泛， 并能保持贮藏期间柿果实的硬度， 具有重要的应用 价值。 0017 本发明以涩柿品种 “镜面柿” 和 “金瓶柿” 果实为试材， 以低氧结合1-MCP的方法进 行果实的脱涩保鲜处理， 结果显示该方法可使果实有效脱涩又能延缓果实贮藏期间软化速 度， 是一种适用范围广泛的涩柿果实采后脱涩保鲜的方法。 附图说明 0018 图1 “镜面柿” (A)和 “金瓶柿” (B)可溶性单宁印迹分析。 0019 图2 “镜面柿” (A)和 “金瓶柿” (B)果实贮藏期间硬度分析。 说 明 书 2/4 页 4 CN 105660834 A 4 0020 图3 “镜面柿” 软化相关基因的定量表达分析。 0021。
18、 图4 “金瓶柿” 软化相关基因的定量表达分析。 具体实施方式 0022 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述， 但实施例不限制本发明的保 护范围。 在下述实施例中常规的基因操作方法参照 分子克隆实验指南 (第三版)。 0023 实施例1：“镜面柿” 果实的脱涩保鲜处理 0024 (一)实验方法 0025 1.塑料桶的准备 0026 塑料桶的桶壁上方和盖子上分别有人为安装的排气管和通气管， 均用软橡胶管连 接， 其中盖子内侧还有安装的小风扇， 接通电源后可起到混匀桶内气体的功能。 塑料桶用前 需进行清洗、 消毒和晾干。 0027 2.柿果实的挑选 0028 将从树上采下的 “镜面柿” 。
19、果实于24h内进行田间热去除和挑选处理， 剔除坏果、 病 果等， 尽量保证处理的柿果实无病虫害， 大小一致。 0029 3.柿果实的放置 0030 挑选完毕， 将柿果实按照圆柱中空形状的摆放方式放置于带有排气管的塑料桶 中， 每个桶中放置40个柿果实， 在中空位置放置用信封包裹的0.2kg用水拌好的高锰酸钾的 稠剂， 避免接触到柿果实。 0031 4.低氧环境的创建 0032 塑料桶用带有通气管的盖子密封后， 经桶盖的通气管通入高纯CO2气体， 同时打开 桶壁的排气管以及桶盖内侧自带的小风扇， 进行气体的混匀， 直至检测到O2浓度 1时结 束并密封通气管和排气管， 此时桶内气体成分约为95CO。
20、2， 4N2和1O2。 0033 5.1-MCP的准备 0034 根据柿果实重量和桶的体积(20L)算出1 l/L处理所需的1-MCP粉末的质量， 称好 后放入50ml离心管的底部， 离心管粘贴于桶壁， 且离心管口正对塑料桶壁上的排气管口； 通 过桶壁的排气管口往桶壁上的离心管内注入6ml 40-50的温水， 让1-MCP通过吸收水分 缓慢释放。 0035 6.柿果实处理组和对照组的设置 0036 处理组的柿果实： 应用低氧(95CO2， 4N2和1O2)结合1-MCP(1 l/L)环境处理 “镜面柿” 果实24h。 0037 对照组的柿果实： 包括两组， 一组为应用低氧(95CO2， 4N2。
21、和1O2)环境处理 “镜面柿” 果实24h； 另一组为直接将塑料桶密封， 不设置低氧和/或1-MCP环境。 0038 所有处理在第30min、 8h和16h时各打开桶盖内侧小风扇进行一次气体的混匀， 每 次持续时间为10min。 0039 7.柿果实的脱涩效果检测： 将直径12.5cm的滤纸浸泡于5FeCl2溶液中10min， 至 其呈现均匀的淡黄色后， 置于60烘箱烘干； 随机选取经过处理的柿果实， 沿纵切面切开后 盖章到滤纸上(滤纸置于果实下5s)， 依据滤纸上的印迹面积来检测柿果实的脱涩效果。 0040 8.柿果实的保鲜效果检测： 选用质构仪(Stable Micro System， U。
22、K)分析柿果实的 说 明 书 3/4 页 5 CN 105660834 A 5 硬度变化， 各个参数设定为探头7.5mm、 穿透深度5mm、 穿透速度1mm/s， 每个果实检测削去果 皮的两个垂直面的赤道部位。 0041 9.应用实时定量PCR技术， 分析柿果实软化相关的基因表达变化， 包括DkPE1(上下 游引物分别为SEQ NO.1和SEQ NO.2)、 DkPE2(上下游引物分别为SEQ NO.3和SEQ NO.4)、 DkPG1(上下游引物分别为SEQ NO.5和SEQ NO.6)、 DkEGase1(上下游引物分别为SEQ NO.7和 SEQ NO.8)、 Dk -gal1(上下游引。
23、物分别为SEQ NO.9和SEQ NO.10)、 Dk -gal4(上下游引物分 别为SEQ NO.11和SEQ NO.12)、 DkXTH9(上下游引物分别为SEQ NO.31和SEQ NO.14)、 DkXTH10(上下游引物分别为SEQ NO.15和SEQ NO.16)和DkXTH11(上下游引物分别为SEQ NO.17和SEQ NO.18)等9个基因。 其中实时定量PCR参数为： SsoFast EvaGreen Supermix 10 l， 10 M上下游引物各1 l， 5ng/ l cDNA模板2 l， DEPC水6 l， 终体积为20 l。 反应条件为： 502min； 952m。
24、in； 9515sec， 5530sec， 7230sec， 40个热循环； 熔解曲线分析65到 95， 每5sec升高1； 结束。 0042 (二)实验结果 0043 1.单宁印迹结果显示低氧以及低氧结合1-MCP混合处理可显著降低 “镜面柿” (附 图1A)果实可溶性单宁含量， 表现为印迹较浅(黑色色泽较浅)； 而对照组果实单宁印迹明显 深于处理果实(附图1)。 0044 2.硬度结果显示， 低氧处理可导致 “镜面柿” (附图2A)果实软化加速， 迅速降低商 品性； 而低氧结合1-MCP处理可以很好的保持柿果实的硬度， 保持其商品性(附图2)。 0045 3.实时荧光定量PCR结果显示， 。
25、低氧处理相对于对照， 柿果实软化相关基因的表达 均显著上调， 进而导致了柿果实的快速软化； 而低氧结合1-MCP混合处理中， 软化相关基因 的表达量虽然高于对照， 但显著低于低氧处理的果实的表达量， 因此保持了柿果实的硬度 (附图3)。 0046 实施例2：“金瓶柿” 果实的脱涩保鲜处理 0047 (一)实验方法 0048 同实施例1。 0049 (二)实验结果 0050 1.单宁印迹结果显示低氧以及低氧结合1-MCP混合处理可显著降低 “金瓶柿” (附 图1B)果实可溶性单宁含量， 表现为印迹较浅(黑色色泽较浅)； 而对照组果实单宁印迹明显 深于处理果实(附图1)。 0051 2.硬度结果显。
26、示， 低氧处理可导致 “金瓶柿” (附图2B)果实软化加速， 迅速降低商 品性； 而低氧结合1-MCP处理可以很好的保持柿果实的硬度， 保持其商品性(附图2)。 0052 3.实时荧光定量PCR结果显示， 低氧处理相对于对照， 柿果实软化相关基因的表达 均显著上调， 进而导致了 “金瓶柿” 柿果实的快速软化； 而低氧结合1-MCP混合处理中， 软化 相关基因的表达量虽然高于对照， 但显著低于低氧处理的果实的表达量， 因此保持了 “金瓶 柿” 柿果实贮藏期间的硬度(附图4)。 0053 应用本方法进行柿果实的采后脱涩， 可以在保证柿果实快速脱涩的同时， 保持其 硬度的缓慢下降， 进而延长了柿果实。
27、的货架期， 说明本方法具有巨大的市场应用价值。 对于 本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都 应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105660834 A 6 0001 序 列 表 1/3 页 7 CN 105660834 A 7 0002 序 列 表 2/3 页 8 CN 105660834 A 8 0003 序 列 表 3/3 页 9 CN 105660834 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 10 CN 105660834 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 11 CN 105660834 A 11 。