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1、(10)申请公布号 CN 103250782 A (43)申请公布日 2013.08.21 CN 103250782 A *CN103250782A* (21)申请号 201310117962.0 (22)申请日 2013.04.07 A23B 9/16(2006.01) A01C 1/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院昆明植物研究所 地址 650201 云南省昆明市蓝黑路 132 号 (72)发明人 李唯奇 陈虹颖 禹晓梅 (74)专利代理机构 昆明协立知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 53108 代理人 马晓青 (54) 发明名称 正丁醇和 N- 酰基乙醇在增强脱水敏。
2、感型种 子脱水耐受力中的应用 (57) 摘要 正丁醇和 N- 酰基乙醇胺 （N-acylethanolamines， NAE） 在提高脱水敏感型 种子 （即顽拗型种子和中间型种子） 脱水耐受性和 储藏方面的应用， 以及正丁醇和 NAE 通过抑制磷 脂酶 D（phospholipase D， PLD） 的活性减少磷脂 酸 （phosphatidic acid， PA） 的产生来提高种子耐 脱水性和储藏方面的应用。由于脱水敏感型种子 中磷脂酸显著上升， 种子脱水过程中所产生的 PA 通过 PLD 水解途径产生， 故在脱水敏感型种子中 分别外源施加PLD的抑制剂正丁醇和NAE后， 可以 显著提高脱水。
3、敏感型种子的脱水耐受性。本发明 通过外源施加正丁醇或NAE以调控PLD产生PA的 代谢途径， 从而改变种子的脱水耐受性， 在种质资 源保存中具有很好的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103250782 A CN 103250782 A *CN103250782A* 1/1 页 2 1. 正丁醇在提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力中的应用。 2.N- 酰基乙醇胺在提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力中的应用。 3. 正。
4、丁醇在提高顽拗型种子和中间型种子储藏力中的应用。 4.N- 酰基乙醇胺在提高顽拗型种子和中间型种子储藏力中的应用。 5. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于正丁醇通过抑制 PLD， 减少 PA 产生来提高顽 拗型种子和中间型种子脱水耐受力。 6. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于 N- 酰基乙醇胺通过抑制 PLD， 减少 PA 产生 来提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力。 7. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于正丁醇通过抑制 PLD， 减少 PA 产生来提高顽 拗型种子和中间型种子储藏力。 8. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 N- 酰基乙醇胺通过抑制 PLD。
5、， 减少 PA 产生 来提高顽拗型种子和中间型种子储藏力。 9. 拟南芥 PLD 基因缺失型突变株在提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力中的 应用。 10. 拟南芥 PLD 基因缺失型突变株在提高顽拗型种子和中间型种子萌发力中的应 用。 11. 如权利要求 1 或 2 或 3 或 4 所述的应用， 其特征在于将植物胚轴剥出， 加入 PLD 抑 制剂 N- 酰基乙醇或正丁醇处理 3 个小时， 无菌操作， 使用高温消毒过的硅胶进行干燥处理 4 个小时， 置于 WPM 和 6-BA 的培养皿中暗萌发 7 天， 之后再转移至直光下进行萌发。 权 利 要 求 书 CN 103250782 A 2 1/4。
6、 页 3 正丁醇和 N- 酰基乙醇在增强脱水敏感型种子脱水耐受力 中的应用 技术领域 ： 0001 本发明属于种子生理及种子储藏领域， 具体地， 涉及正丁醇和 NAE 在提高脱水敏 感型 （即顽拗型种子和中间型种子） 种子脱水耐受性方面的应用 ； 同时， 还涉及正丁醇和NAE 通过抑制磷脂酶 D， 从而减少磷脂酸的产生， 这条调控途径来提高种子耐脱水性和储藏方面 的应用。 背景技术 ： 0002 植物资源是维持人类生存、 维护国家生态安全的物质基础， 是实现可持续发展战 略的重要资源。保存种子是植物种质资源长期保存的重要手段。对于以产生种子作为主要 繁殖手段 （有性繁殖） 的种子植物来说， 运。
7、用国际通用的干燥和低温的方法对种子进行长期 保藏， 可以在有限的空间里最大限度地保存物种的遗传多样性。然而， 有 7-25% 的植物 （在 热带雨林中有高达 47% 的植物） 产生的种子由于不耐脱水， 无法通过常规的种子库保存技 术进行保存。根据种子的脱水耐性， 可以将种子储藏行为分为三种 ： 正常型种子 （Orthodox seed） ， 中间型种子 （Intermediate seed） 和顽拗型种子 （Recalcitrant seed） 。正常型种 子可以干燥至低含水量 （2-5%） 而种子活力不受影响， 且种子寿命随种子含水量和储存温度 的降低而增加。顽拗型种子不耐受过度脱水， 通常。
8、当种子含水量低于 12-31% 时就会死亡。 中间型种子的脱水耐受性介于以上两种类型之间， 但种子在低温时将受到生理上的损失。 产生 “顽拗型” 种子和 “中间型” 种子的物种大多数属于热带、 亚热带森林中的主要建群种 或重要经济植物， 如龙脑香科 （Dipterocarpaceae） 、 壳斗科 （Fagaceae） 、 樟科 （Lauraceae） 等。 因此， 探明种子脱水耐性的生理生化和分子机理， 提供有利于不耐脱水种子长期保藏的 方法， 对于扩大种质资源的保藏范围具有重要意义。 0003 种子脱水会使细胞体积急剧减小并导致细胞膜发生剧烈变化。细胞膜是由磷脂 双层和相关蛋白以及胆固醇和。
9、糖脂组成的围绕细胞或细胞器的通透屏障。细胞膜是最容 易受到环境因子胁迫伤害的器官， 其损伤可以直接导致细胞死亡。不同类型的膜脂分子结 构不同， 其生物物理和生物化学性质不同。植物通过调整膜脂组成以适应环境， 包括水分 和温度的变化。植物在干旱或细胞脱水时最显著的变化是导致了磷脂酸 （phosphatidic acid,PA） 的升高。在正常情况下， PA 在生物膜中的含量很低， 叶片中占总脂含量的比例 低于 1%（Welti,et al.,2002） ； 而当植物受到非生物胁迫 （如冷驯、 冰冻、 脱水、 干旱、 盐 害、 机械伤害等） 或生物胁迫 （如病原菌的攻击、 根瘤菌的诱导等） 时， 。
10、PA 的含量会急剧上 升， 增加几倍甚至几十倍。在受到胁迫的情况下， PA 的升高不但可以作为第二信使参与信 号的转导， 而且其独特的锥形分子结构， 也被认为有利于膜损伤的形成 （即膜相变中的 “非 层状相” ， Hexagonal II phase） ， 并最终导致膜渗漏， 从而细胞死亡。抑制 PA 的形成可以 减少胁迫下的膜损伤， 从而提高植物的抗性。特别值得关注的是， 抑制 PA 的产生显著提 高种子抗老化的能力， 说明 PA 在种子生理过程中扮演着重要的角色。PA 可以由多条代谢 途径产生， 其中一条重要途径是由磷脂酶 D（phospholipase D,PLD） 水解磷脂产生。近 说。
11、 明 书 CN 103250782 A 3 2/4 页 4 年来有越来越多的证据表明， 如果外源施加 PLD 的特异性抑制剂正丁醇和 N- 酰基乙醇胺 （N-acylethanolamines,NAE） , 可以抑制 PLD 的活性， 从而影响 PLD 介导的生理过程。 0004 种子在干燥过程中膜脂的变化研究仅有零星报道。 例如 ： 正常型种子 （南瓜、 玉米、 水稻等五种植物种子） 与顽拗型种子 （荔枝、 芒果、 枇杷、 等六种植物种子） 的磷脂组成本身 就具有很大差异。而对于脱水过程中的磷脂变化研究发现， 银槭 （Acer sacharinum） 产生 的顽拗型种子在脱水过程中， PLD。
12、 活性升高， 其产物 PA 水平上升。然而， 是否可以通过调控 PLD 介导产生的 PA， 进而影响种子脱水耐受性， 却未见报道。 发明内容 ： 0005 本发明目的在于提供一种正丁醇和NAE通过抑制磷脂酶D， 减少PA的产生， 从而增 强顽拗型种子和中间型种子脱水耐受性和储存性方面的应用。 0006 为了实现本发明的上述目的， 采用如下技术方案 ： 0007 正丁醇在提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力中的应用。 0008 N- 酰基乙醇胺在提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力中的应用。 0009 正丁醇在提高顽拗型种子和中间型种子储藏力中的应用。 0010 N- 酰基乙醇胺在提高顽拗型种子。
13、和中间型种子储藏力中的应用。 0011 如所述的应用， 正丁醇通过抑制 PLD， 减少 PA 产生来提高顽拗型种子和中间型种 子脱水耐受力。 0012 如所述的应用， N- 酰基乙醇胺通过抑制 PLD， 减少 PA 产生来提高顽拗型种子和 中间型种子脱水耐受力。 0013 如所述的应用， 正丁醇通过抑制 PLD， 减少 PA 产生来提高顽拗型种子和中间型种 子储藏力。 0014 N-酰基乙醇胺通过抑制PLD， 减少PA产生来提高顽拗型种子和中间型种子储藏 力。 0015 拟南芥 PLD 基因缺失型突变株在提高顽拗型种子和中间型种子脱水耐受力中 的应用。 0016 拟南芥 PLD 基因缺失型突变。
14、株在提高顽拗型种子和中间型种子萌发力中的应 用。 0017 如上述的应用， 是将植物胚轴剥出， 加入 PLD 抑制剂 N- 酰基乙醇或正丁醇处理 3 个小时， 无菌操作， 使用高温消毒过的硅胶进行干燥处理 4 个小时， 置于 WPM 和 6-BA 的培养 皿中暗萌发 7 天， 之后再转移至直光下进行萌发， 经过处理后的种子， 脱水耐受能力显著提 高。 0018 本发明在顽拗型种子板栗、 枇杷、 荔枝和中间型种子茶脱水过程中发现， PA 水平显 著升高， 提示 PA 的产生与种子的耐脱水能力密切相关。在模式植物拟南芥中证实， 种子脱 水过程中 PA 的产生， 来源于 PLD 的水解， 即该基因的。
15、缺失可使得拟南芥种子具有显著高于 对照的萌发率。 通过外源施加PLD的抑制剂正丁醇和NAE， 从而抑制PA的产生， 发现板栗的 耐脱水性显著高于对照。因此， 本发明发现通过调控 PLD 产生 PA 的代谢途径能够提高脱水 敏感型种子耐脱水性增强， 不仅对揭示种子脱水过程中膜伤害的机理具有实质性价值， 而 且在种质资源保存中有重要的现实意义和较好的应用前景。 说 明 书 CN 103250782 A 4 3/4 页 5 附图说明 ： 0019 图1板栗、 枇杷、 荔枝、 茶脱水过程中， 种子萌发情况及对应的PA变化情况 ； 图2拟 南芥野生型种子和 PLD 基因缺失突变株， 脱水过程中萌发率情况。
16、 ； 0020 图 3 拟南芥野生型种子和 PLD 基因缺失突变株， 脱水过程中 PA 变化情况 ； 0021 图 4 外源施加 PLD 抑制剂 NAE、 正丁醇对板栗种子胚轴的影响。 具体实施方式 ： 0022 下面结合附图， 用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以 此来限定本发明。 0023 实施例 1 ： 0024 脱水敏感型种子在脱水过程中， 随着种子活力下降， PA 持续升高。 0025 ( 一 ) 脱水敏感型种子在脱水过程中， 种子活力降低 ： 0026 脱水敏感型种子板栗 (C.mollissima)、 茶 （C.sinensis） 、 枇杷 （E.japon。
17、ica） 和荔 枝 （L.chinensis） 种子在种质库干燥条件下 （15， 15% 相对湿度） 干燥不同时间， 种子活力 会逐渐丧失。本实验分别取 2008 年 11 月采集或购买的板栗、 茶种子以及 2010 年 6 月购买 的枇杷和荔枝种子进行干燥实验， 并进行萌发实验检测活力。置于含 1% 的培养皿中 25， 循环光 （白天 / 黑夜， 8/16 小时） 照射发芽。按标准发芽试验方法进行， 15 天统计萌发率。 如图 1a 所示， 经过不同的干燥时间后， 种子萌发率下降， 最后完全丧失活力。因此所选择的 种子均为脱水敏感型种子， 在脱水过程中， 均死亡。 0027 （二） 脱水敏感。
18、型种子在脱水过程中， PA 持续升高 ： 0028 种子中 PA 含量的检测。 0029 本实验根据以上的萌发时间点为取材时间点， 用研磨机将种子在液氮中磨碎成粉 末， 分别称取 0.2-0.5 克粉末加入 3ml 预热的异丙醇中， 在 75水浴锅中固定 15min。室温 冷却后， 加入氯仿和甲醇的提取液中提取 2 天， 之后离心， 合并上清， 用氮气吹干。粉末在 105烘箱内烘干， 并称量得到干重。所提出的脂寄送到美国脂类检测中心进行检测分析。 结果显示， 随着种子萌发率下降， PA 显著性升高 （图 1） 。 0030 实施例 2 ： 0031 拟南芥 PLD 基因缺失突变株较野生型更耐脱。
19、水 ： 0032 将野生型Col和突变体PLD种子放在水中4处理2天， 之后放在硅胶中室温处理 5 天， 以此为一个循环。处理时间为 1， 2， 3， 4， 5 个循环。在每个湿处理和干处理完毕后取 出种子， 置于用滤纸保湿的培养皿中 25光照发芽。按标准发芽试验方法进行， 15 天统计 萌发率。如图 2 所示， 随着干湿循环处理次数的增加， 野生型 Col 和突变体 PLD 种子均呈下 降趋势 ； 野生型种子更加敏感， 活力下降得更快， 在第 2 个循环结束后， 活力已经下降到 60% 左右， 而突变体 PLD 种子仍保持在 80% 左右的活力。第 5 个循环结束后， 野生型种子活力已 完全。
20、丧失， 而突变体 PLD 种子仍然保持在 30% 左右的活力。以上结果说明， PLD 基因突变株 较野生型更耐脱水。 0033 实施例 3 ： 0034 拟南芥 PLD 基因缺失突变株较野生型在脱水过程中 PA 显著降低 ： 说 明 书 CN 103250782 A 5 4/4 页 6 0035 将野生型 Col 和突变体 PLD 种子根据实例 2 中的实验时间点， 分别在对照， 第 3 个 湿循环， 第 3 个干循环， 第 4 个湿循环和第 5 个干循环的时间点取样， 进行脂类提取检测分 析。 别称取20-30毫克种子加入3ml预热的异丙醇中， 在75水浴锅中固定15min。 室温冷 却后，。
21、 加入氯仿和甲醇的提取液中提取 3 周， 每周更换一次提取液， 合并上清， 用氮气吹干。 在105烘箱内烘干种子， 并称量得到干重。 所提出的脂寄送到美国脂类检测中心进行检测 分析。结果显示， 在野生型拟南芥种子中， PA 分子均持续升高 ； 而突变体 PLD 中， PA 分子则 显著下降 （图 3） 。说明由于 PLD 的缺失， PA 含量下降， 因此在种子脱水过程中， PA 的产生确 实来自于 PLD 的水解。 0036 实施例 4: 0037 外源施加 PLD 抑制剂 NAE 或正丁醇显著提高了板栗胚轴的耐脱水能力 ： 0038 无菌操作将板栗胚轴剥出， 加入 PLD 抑制剂 NAE 或。
22、正丁醇处理 3 个小时， 之后在 无菌操作台上， 使用高温消毒过的硅胶进行干燥处理 4 个小时。置于 WPM（woody plant medium） 和 6-BA 的培养皿中暗萌发 7 天， 之后再转移直光下进行萌发。按标准发芽试验方 法进行， 15 天统计萌发率。如图 4 所示， 直接干燥没有经过任何预处理的种子， 萌发率下降 到25%左右， 而经过水处理和叔丁醇处理3小时的种子， 萌发率较对照有显著性提高， 至60% 左右， 而经过 PLD 抑制剂处理 3 小时后的种子， 萌发率较水处理有显著性提高， 提高至 85% 左右。以上结果说明外源施加 PLD 抑制剂， 可以提高板栗胚轴的脱水耐受。
23、能力。 0039 正丁醇和NAE通过抑制PLD， 减少PA的产生， 从而提高了种子脱水耐受性的相关生 理生化实验证明， 这条调控途径在种子响应干燥胁迫过程中， 起到重要作用， 本发明对深入 理解该途径在种子响应干燥胁迫中的膜伤害具有实质性的价值 ； 此外本发明还为以后保藏 脱水敏感型种子提供了新的思路和技术， 具有重要的经济意义和运用前景。 最后， 还需要注 意的是， 以上列举的仅是本发明的其中几个具体实施例。显然， 本发明不限于以上实施例， 还可以有许多改进。 本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的改 进， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103250782 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103250782 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103250782 A 8 。