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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711217597.5 (22)申请日 2017.11.28 (71)申请人 四川正大新材料科技有限公司 地址 636000 四川省巴中市巴州区江北大 道中段财富广场A区2幢Z单元14层13 号 (72)发明人 陈加惠 (74)专利代理机构 成都正华专利代理事务所 (普通合伙) 51229 代理人 李蕊 李林合 (51)Int.Cl. A01N 63/02(2006.01) A01P 1/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) A23K 50/80(2。
2、016.01) A23K 10/18(2016.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 交替假单胞菌生态菌剂的制备 (57)摘要 本发明涉及一种微生态制剂， 特别涉及一种 交替假单胞菌生态菌剂的制备及在海水养殖上 的应用。 首先从健康的对虾体表分离纯化出对海 水养殖动物常见病原菌具有拮抗作用的有益菌， 并进行致病菌的拮抗性检验再进行筛选获得菌 株和发酵以规模生产制成菌剂。 该菌剂可直接施 用于水体或拌食投喂， 具有无污染的环保特点， 可改善养殖水环境的微生物群落的结构， 减少或 避免兽药污染和残留， 降低养殖成本， 提高养殖 动物的成活率。 权利要求书1页 说明书3页 。
3、CN 107897212 A 2018.04.13 CN 107897212 A 1.一种交替假单胞菌生态菌剂的制备方法， 其特征是首先分离纯化出交替假单胞菌 落， 即捕获50100g健康的对虾个体， 迅速将其放置于盛有灭菌海水的无菌容器中进行如 下操作， 用无菌海水冲洗其表面3次， 每次不超过30秒， 然后再将其放置在无菌海水中， 剧烈 震荡25分钟， 用无菌器械将养殖动物取出后， 从中吸取50100ml海水无菌操作涂布在以 灭菌海水配置的灭菌的2216E固体培养基上， 在2530进行培养48小时， 选取其中呈桔黄 色的菌落， 通过革兰氏染色和鞭毛染色， 以选其中具有革兰氏阴性和极生单鞭毛的。
4、直杆状 特征的菌落， 然后再进行对常见海水养殖动物致病菌的拮抗性检验， 再将纯化后的具有拮 抗作用的菌株进行筛选， 将获取的交替假单胞菌进行细菌的培养和发酵， 即以2216E溶液进 行0倍6倍稀释后的液体培养液均可作为发酵液， 用1M盐酸和1M的NaOH调节pH在7.28.5 之间， 发酵条件： 接种量以发酵体积的1020， 接种后细菌浓度106107Cfu/ml为宜， 在温度2530以100260rpm频率震动培养2436小时， 将发酵后的菌液通过410下 以3000g10000g的离心力进行离心， 除去培养液， 收集菌体， 用灭菌海水进行稀释成不同 浓度待使用。 2.如权利要求1所述的制备。
5、方法， 其特征是上述发酵步骤中以灭菌海水配置的pH在7.2 8.5之间的蛋白胨浓度0.21， 含有0.01柠檬酸铁的液体培养基进行发酵。 3.交替假单胞菌生态菌剂用作抑制病原微生物生长的制剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107897212 A 2 交替假单胞菌生态菌剂的制备 技术领域 0001 本发明涉及一种交替假单胞菌生态菌剂的制备。 背景技术 0002 长期以来对于水产养殖病害的防治以使用抗生素和其它化学药物为主要措施， 但 化学治疗有许多弊端， 破坏水体的微生态环境， 存在药物残留， 影响水产品品质以及对环境 造成污染等问题。 据不完全统计， 全国每年海洋水产养殖病害发病。
6、率达60以上， 损失率 20左右， 直接经济损失就达百亿元之巨， 并且还有上升的趋势。 如何通过改善整个养殖水 体生态环境， 抑制病原微生物生长， 减少疾病的发生已成为世界各国水产养殖业所共同关 注的焦点问题。 近年来， 人们开始尝试在养殖水体中施用益生微生物来改善养殖微生态环 境。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种用于改善海水养殖动物水体的微生态环境， 预防养殖病 害， 提高养殖动物成活率的一种有益菌剂交替假单胞菌生态菌剂的制备。 以减少抗生素 和其他化学药物的使用， 降低养殖费用， 减少污染， 维护生态平衡。 0004 本发明的另一个目的是将可规模发酵生产的该有益菌剂合理使用。 。
7、0005 本发明的制备方法是先从健康对虾扇贝等海水养殖动物的体表分离出对常见致 病菌有拮抗作用的菌落。 纯化后进行对海水养殖动物的安全性检验以及对增强海水动物抗 病能力方面的检验， 并对该菌的保存和发酵条件优化， 以发酵罐中按照优化的条件进行大 量的生产， 最后通过离心浓缩后制备成一定浓度的菌剂， 进行合理使用。 0006 本发明是一种微生物控制技术， 是利用微生物普遍存在的拮抗现象， 即利用在同 一生态位中微生物通过营养竞争、 空间竞争或分泌抗生素、 细菌素等毒素抑制其他微生物 的生长这一原理， 将具有拮抗特性的益生菌施入养殖水体， 杀死或抑制病原微生物， 为养殖 动物营造良好的生存环境。 。
8、通过使用该菌剂可改善养殖水体的生态环境， 抑制病原微生物 的生长， 减少病害的发生， 降低养殖成本和提高养殖动物地成活率并且该菌剂具有不污染 环境等环保特点。 这种效益将是潜在的， 长期的， 这将成为未来水产养殖业中的一个重要研 究和发展方向。 具体实施方式 0007 下面通过具体实施例进一步说明本发明。 0008 本发明的菌剂制备方法分为四大步骤， 其中分离纯化及检验和筛选， 即步骤A、 B、 C 在于得到有效菌株， 最后步骤D是培养和发酵， 以利规模化生产该菌剂， 下面详细叙述， 以方 便实施。 0009 A、 首先分离纯化出交替假单胞菌落， 即捕获健康的对虾个体(50100g)等养殖动 。
9、物， 迅速将其放置于盛有灭菌海水的无菌容器中进行如下操作： 用无菌海水冲洗其表面3 说 明 书 1/3 页 3 CN 107897212 A 3 次， 每次不超过30秒， 然后再将其放置在无菌海水中， 剧烈震荡25分钟， 用无菌器械将养 殖动物取出后， 从中吸取50100ml海水无菌操作涂布在以灭菌海水配置的灭菌的固体培 养基(2216E)上， 在2530进行培养48小时， 选取其中呈桔黄色的菌落分别通过革兰氏染 色和鞭毛染色， 以选其中具有革兰氏阴性和极生单鞭毛的直杆状特征的菌落。 0010 B、 然后再进行对常见海水养殖动物致病菌的拮抗性检验： 检验的方法是首先选取 可在海水培养基2216。
10、E上生长的海水养殖常见的细菌性病害病原菌如鳗弧菌、 哈维氏弧菌、 副溶血弧菌、 溶藻胶弧菌、 霍乱弧菌非O1型、 创伤弧菌、 漂浮弧菌， 河弧菌， 最小弧菌， 杀鲑弧 菌， 病海鱼弧菌， 迟钝爱德华氏菌， 海水屈挠杆菌， 变异微球菌， 分支杆菌以及肠杆菌等作为 指示菌， 再采用十字交叉划线法， 将待检测菌和指示菌相互垂直交叉划线接种于2216E平板 上， 2530下培养2436小时。 选取对大多数菌都有拮抗活性的菌株， 即得到交替假单胞 菌。 0011 C、 再将纯化后的具有拮抗作用的菌株按下列方法进行进一步筛选： a、 安全性检测： .以筛选的菌株进行对海水养殖动物的安全性实验： 可选取海水。
11、养殖动 物不同时期的个体分组进行(例如对虾不同时期的幼虾， 稚虾或成虾)施用不同剂量103- 105cfu/ml筛选菌株于养殖水体， 以不加任何菌剂的组为对照， 从中选取在各种剂量组 (103-105cfu/ml)施用后养殖动物存活率较高的菌株。 0012 b、 提高抗病力检测： 各种对养殖动物施用该菌， 以剂量在103-105cfu/ml， 同时在 养殖动物水体中加入已经被证实为病原的细菌(例如哈维氏弧菌， 鳗弧菌等)105cfu/ml， 共 同培养一定的时间后检察对养殖动物的保护作用即成活率的高低。 在生产过程中需要菌种 保存， 通常分中、 长期菌种保存 长期保存： 在2216E固体斜面划。
12、线培养24小时后。 用无菌的生理盐水冲洗到无菌的安瓿 瓶， 无菌冷冻干燥， 密封长期保存510年。 0013 中长期保存： 在2216E斜面划线培养24小时后。 用无菌的生理盐水冲洗到无菌的无 菌容器中， 加入1320的无菌甘油和一定量的生理盐水稀释为大约106107cfu/ml浓 度。 在-70以下的低温冰箱或液氮中保纯。 可保存12年左右。 上述菌种保存都应严格无 菌操作， 以免污染。 0014 在以上分离纯化和筛选的基础上得到该菌株， 再将该菌株通过规模发酵制备成菌 剂， 其菌剂的制备方法是 D、 将获取的交替假单胞菌进行细菌的培养和发酵。 细菌的发酵液配方可任选下列之 一： 发酵液配方。
13、一： 以灭菌后海水， 按2216E配方为基础配制的， 对2216E溶液进行0倍6倍 稀释后的液体培养液均可作为发酵液， 用1M盐酸和1M的NaOH调节pH在7.28.5之间。 0015 发酵液配方二： 以灭菌海水配置的pH在7.28.5之间的蛋白胨浓度0.21， 含有0.01柠檬酸铁的液体培养基进行发酵。 0016 发酵条件： 接种量以发酵体积的1020， 接种后细菌浓度106107cfu/ml为 宜， 在温度2530以100260rpm频率震动培养2436小时。 发酵结束后立即进行细菌活 菌计数， 培养液活菌浓度都可达到108109cfu/ml。 将发酵后的菌液通过410下以 3000g10。
14、000g的离心力进行离心， 除去培养液， 收集菌体， 用灭菌海水进行稀释成不同浓 度待使用。 说 明 书 2/3 页 4 CN 107897212 A 4 0017 为改善水体中微生态环境， 抑制病原菌细菌生长， 提高养殖动物的成活率和抗病 能力。 作为应用， 可将制备的菌剂以103105cfu/ml， 直接施于养殖水体， 或以107-108cfu/ kg的比例拌食投喂两种方法。 下面给出详细使用方法和具体实施例。 0018 方法1： 直接施用于养殖水体， 例如对虾、 扇贝、 蟹和鱼的育苗期或养成期的水体。 将发酵后离心洗涤浓缩后的菌液， 按养殖水体积折算为103-105cfu/ml剂量， 用。
15、养殖海水稀 释后泼洒全池或进行搅拌保证均匀使用。 一般预防病害的使用频率为714天一次， 剂量为 103-104cfu/ml。 施用该生态菌剂前后严禁与抗生素同时使用。 在高密度养殖， 或有疫情时 可增加使用频率45天施用一次。 0019 实施例1 在海湾扇贝育苗中的应用 在扇贝育苗中将103105cfu/ml交替假单胞生态菌剂加入到养殖实验水体， 经正常育 苗管理后， 可降低水体中细菌总数， 和弧菌数并且明显提高了扇贝幼苗的变态率成活率。 、 实施例2 在日本对虾育苗期的应用 在日本对虾无节幼体养殖水体中施加交替假单胞生态菌剂104cfu/ml， 五天后， 施用交 替假单胞生态菌剂可明显提高。
16、日本对虾无节幼体的成活率， 并且具有明显的抑制病原菌生 长的作用。 0020 实施例3 在斑节对虾籽虾期(PL-15期； 500尾/组， 每个处理三组平行组)。 在养殖的水体中施加 104cfu/ml剂量交替假单胞生态菌剂5天后计算成活率。 结果交替假单胞生态菌剂处理的籽 虾成活率41.2比未使用菌剂的对照组30.47有明显提高。 说明施用了有益菌后改善了 养殖水体的微生态环境， 提高养殖成活率。 0021 方法2： 拌食投喂： 以107-108cfu/kg的比例， 将交替假单胞生态菌剂与商品饵料 (例如山东牟平鱼虾饲料厂的大乐牌商品饵料)均匀混拌， 阴干后投喂。 一日三次， 连续投喂 或间隔。
17、一天投喂， 在整个生长期都可投喂， 注意不可与抗生素以及其他化学药品同时投喂。 0022 实施例4 以108cfu/kg拌菌饵料投喂日本对虾稚虾连续投喂50天后。 平均体长/体重为8.16cm/ 5.26g高于对照组7.86cm/4.67g。 另外的实验表明拌有该菌剂的饵料投喂对虾的免疫力增 强， 对虾血清的抗菌(副溶血弧菌)活力明显高于未拌该菌的对照组。 对拌菌饵料组对虾用 致病菌细菌人工感染实验结果表明对虾的成活率92.5高于对照组成活率77.2 以上方法制备的交替假单胞细菌菌剂在海水养殖上的应用具有使用简单和无污染的 环保特点， 还具有杀菌、 抑菌的广谱性， 并且可通过发酵规模化生产， 使用费用低， 节省育苗 成本。 说 明 书 3/3 页 5 CN 107897212 A 5 。