技术领域
本发明涉及的是一种在离体培养条件下诱导植物多倍体的方法，具体的是一种离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法。
背景技术
亚麻（Linum usitatissimum L.，属于亚麻科亚麻属，为一年生草本植物）是人类最早使用的天然植物纤维，距今已有1万年以上的历史。亚麻是纯天然纤维，由于其具有吸汗、透气性良好和对人体无害等显著特点，越来越被人类所重视。目前，全球种植纤维用亚麻的国家主要集中在北半球北纬45～65°内，处于温带和寒温带的欧亚两大洲，我国亚麻主要产区是黑龙江，其地理位置和土壤条件适宜亚麻生长，居全国之首，并具有80余年的亚麻栽培史。但是我国所产的亚麻原茎、种子、长麻平均每公顷产量远远不如比利时、法国、荷兰等西欧国家，其原因是多方面的，而主要原因之一还是亚麻品种相对比较落后。因此必须进行品种改良，常规育种为亚麻品种的改良做出了巨大的贡献，但近年基因工程和细胞工程的兴起，又为品种改良增加了新的可行的方法。
自然界大约有1/2的被子植物，2/3的禾本科植物属于多倍体。在被子植物中，约70%的种类在进化史中曾发生过一次或多次多倍化过程。染色体组的多倍化是推动植物进化的一个重要因素，是物种形成的重要途径之一。多倍体和二倍体比较，不论形态上或生理上都有很多不同之处。一般而言，植物多倍体在形态上有较大的株形或体型，有较大的叶片，较粗壮的茎和根。在生理特性上，多倍体对病虫害和不良环境条件的抵抗力较强，分布地区较广。有些同化物质，如糖分含量、蛋白质含量、氨基酸及维生素含量都有增高趋势，其营养价值往往更高。因此，早在20世纪20年代，生物学家就对植物多倍体进行了大量的研究。目前在生产中应用的农作物、蔬菜、果树、中草药、园艺作物、牧草等各个方面都有人工诱导的多倍体，因此多倍体的应用相当广泛。
化学诱变与组织培养的结合，使得多倍体诱导中融入了组织培养的优点。首先试验条件易于控制，由于组培是在室内进行的，这就在很大程度上降低了外界环境因素对于试验的干扰和影响。其次，可以缩短育种时间，由于组培能实现快速繁殖，多倍体诱导时可一次处理大量的植物材料，大大的加快了育种进程。第三，利用组织培养技术可对诱导成功的材料进行快速繁殖，获得更多的多倍体材料。另外由于所选材料大多幼嫩，且处在分生状态的组织细胞，容易受秋水仙碱的影响，诱导成功率较高。同时方便鉴定，在短期内可快速鉴定大批量株系，筛选出多倍体，且多倍体纯度高。
纤维亚麻主要的利用部位为营养器官，而多倍体的最主要特征就是巨大性，因此通过多倍体育种得到的多倍体植株较二倍体植株产量要高，另一方面多倍体大多数对外界环境条件都具有较强的适应性，抗病力，耐寒性及耐湿性等均比二倍体强。因此通过多倍体育种可能选育出高产优质的亚麻新品种，这对中国的亚麻种植业来说，意义相当重大。但是目前现有技术中，诱导纤维亚麻产生多倍体使用的方法多为用秋水仙素处理纤维亚麻的种子，诱导率较低，并且在短时期内很难得到大量的四倍体植株，现有技术中用秋水仙素处理纤维亚麻的茎尖以进一步提高诱导率的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供一种离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，用秋水仙素处理纤维亚麻的茎尖，可获得较高的诱导率，并能在短时间内得到大量的四倍体组培苗。
本发明通过以下技术方案来实现：离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行：
a、选取健康饱满的纤维亚麻种子，将纤维亚麻种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养6～8天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.3～1.5cm切下，放于含有质量百分比为0.05%～0.2%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃的温度条件下，摇动速度为100rmp，摇动12～24h，之后用无菌水冲洗3～5次，将茎尖下胚轴切下0.3～0.5cm，然后将茎尖部分转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.1～1.0mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖，取茎尖幼嫩的分生组织通过压片法进行倍性鉴定；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.1～0.5mg/L吲哚乙酸、0.5～2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.05～0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到4～5cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有0.2～2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至1.5～2cm时，打开封口膜进行炼苗2～3天，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5～6天盖好封口膜，保持湿度为80%～90%，23～27℃条件下生长15～18天，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长；
h、取幼嫩根尖通过压片法进行染色体倍性鉴定。
作为本方法的进一步优选，离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行：
a、选取健康饱满的纤维亚麻种子，将纤维亚麻种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养6～8天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.3～1.5cm切下，放于含有质量百分比为0.1%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃的温度条件下，摇动速度为100rmp，摇动18h，之后用无菌水冲洗3～5次，将茎尖下胚轴切下0.3～0.5cm，然后将茎尖部分转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.5mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织通过压片法进行倍性鉴定；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗；愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.2mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.25mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长；伸长生长培养基是指添加有0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到4～5cm时将其转移到生根培养基中进行生根；生根培养基是指添加有0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至1.5～2cm时，打开封口膜进行炼苗2～3天，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5～6天盖好封口膜，保持湿度为80%～90%，23～27℃条件下生长15～18天，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长；
h、取幼嫩根尖通过压片法进行染色体倍性鉴定。
上述的压片法进行染色体倍性鉴定包括以下步骤：取幼嫩的茎尖或根尖；将茎尖或根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理2～4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定30～50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2～3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离10～20min，然后用蒸馏水漂洗2～3次；将茎尖或根尖放在载玻片上，切下顶端分生区1～2mm，滴加卡宝品红染液染色5～10min；压片，在显微镜下观察即可。
上述纤维亚麻为纤维亚麻双亚7号。
上述MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
上述B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
采用上述技术方案的积极效果：本方法采用秋水仙素处理纤维亚麻的茎尖部位，可获得比处理纤维亚麻的种子更高的诱导率，诱导率高达25.5%；纯合四倍体比率高，多倍体植株形态正常，移栽成活率高；可以在离体条件下进行快速繁殖，短时间内得到大量的四倍体组培苗。
四、具体实施方式：
实施例一
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行：
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养6天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.3cm切下，放于含有质量百分比为0.05%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动12h，之后用无菌水冲洗3次，将茎尖下胚轴切下0.3cm，然后将茎尖部分转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.1mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理2h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定30min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离10min，然后用蒸馏水漂洗2次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区1mm，滴加卡宝品红染液染色5min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.1mg/L吲哚乙酸、1.25mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.05mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到4cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有0.2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至1.5cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5天盖好封口膜，保持湿度为80%，23℃条件下生长15天，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理2h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定30min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离10min，然后用蒸馏水漂洗2次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区1mm，滴加卡宝品红染液染色5min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
实施例二
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行：
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养7天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.4cm切下，放于含有质量百分比为0.05%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动12h，之后用无菌水冲洗4次，将茎尖下胚轴切下0.4cm，然后转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.1mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理2h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定30min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离10min，然后用蒸馏水漂洗3次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区1mm，滴加卡宝品红染液染色5min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.5mg/L吲哚乙酸、1.25mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.05mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到4cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有0.2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至1.5cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5天盖好封口膜，保持湿度为80%，23℃条件下生长16天，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理2h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定30min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离10min，然后用蒸馏水漂洗3次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区1mm，滴加卡宝品红染液染色5min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
实施例三
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行:
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养8天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.5cm切下，放于含有质量百分比为0.2%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动24h，之后用无菌水冲洗5次，将茎尖下胚轴切下0.5cm，然后转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有1.0mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理3h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定40min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离15min，然后用蒸馏水漂洗2次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区1.5mm，滴加卡宝品红染液染色8min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.3mg/L吲哚乙酸、0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到4.5cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至1.75cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前6天盖好封口膜，保持湿度为85%，25℃条件下生长17天，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理3h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定40min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离15min，然后用蒸馏水漂洗2次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区1.5mm，滴加卡宝品红染液染色8min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
实施例四
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行:
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养6天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.3cm切下，放于含有质量百分比为0.2%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动24h，之后用无菌水冲洗3次，将茎尖下胚轴切下0.3cm，然后转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有1.0mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理3h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定40min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离15min，然后用蒸馏水漂洗3次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区1.5mm，滴加卡宝品红染液染色8min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.3mg/L吲哚乙酸、2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到4.5cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至1.75cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前6天盖好封口膜，保持湿度为85%，25℃条件下生长18天，，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理3h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定40min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离15min，然后用蒸馏水漂洗3次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区1.5mm，滴加卡宝品红染液染色8min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
实施例五
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行:
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养7天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.4cm切下，放于含有质量百分比为0.1%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动18h，之后用无菌水冲洗4次，将茎尖下胚轴切下0.4cm，然后转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.5mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离20min，然后用蒸馏水漂洗2次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区2mm，滴加卡宝品红染液染色10min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.3mg/L吲哚乙酸、1.25mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到5cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至2cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5天盖好封口膜，保持湿度为90%，27℃条件下生长15天，，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离20min，然后用蒸馏水漂洗2次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区2mm，滴加卡宝品红染液染色10min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
实施例六
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行:
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养8天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.5cm切下，放于含有质量百分比为0.1%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动18h，之后用无菌水冲洗5次，将茎尖下胚轴切下0.5cm，然后转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.5mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离20min，然后用蒸馏水漂洗3次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区2mm，滴加卡宝品红染液染色10min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.3mg/L吲哚乙酸、1.25mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到5cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至2cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5天盖好封口膜，保持湿度为90%，27℃条件下生长16天，，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离20min，然后用蒸馏水漂洗3次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区2mm，滴加卡宝品红染液染色10min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
实施例七
离体培养条件下纤维亚麻多倍体诱导方法，该方法按照下列步骤进行:
a、选取健康饱满的纤维亚麻双亚7号种子，将纤维亚麻双亚7号种子用体积百分比为75%的乙醇消毒处理5min，将乙醇倒出，然后质量百分比为0.1%的氯化汞处理12min后，接种于B5培养基中，培养8天，得到健壮无菌苗；
b、取健壮无菌苗，将茎尖带下胚轴1.5cm切下，放于含有质量百分比为0.1%的经0.22μm滤膜过滤除菌的秋水仙素溶液中，在25±2℃条件下，摇动速度为100rmp，摇动18h，之后用无菌水冲洗5次，将茎尖下胚轴切下0.5cm，然后转入茎尖伸长培养基中培养，茎尖伸长培养基是指添加有0.5mg/L的赤霉素的MSB固体培养基；
c、将肉眼看上去形态变化明显的茎尖取茎尖幼嫩的分生组织，将茎尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗2次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离20min，然后用蒸馏水漂洗2次；将茎尖放在载玻片上，切下顶端分生区2mm，滴加卡宝品红染液染色10min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻茎尖染色体数为2n=4x=64；
d、将确定为四倍体植株的茎段放入愈伤组织及芽诱导培养基中进行培养获得大量的四倍体无菌苗，愈伤组织及芽诱导培养基是指添加有0.2mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.25mg/L激动素的MSB固体培养基；
e、将愈伤组织分化的组培苗分成单株转移到伸长生长培养基中进行伸长生长，伸长生长培养基是指添加有0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.2mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
f、当组培苗长高到5cm时将其转移到生根培养基中进行生根，生根培养基是指添加有0.5mg/L吲哚丁酸的B5固体培养基；
g、当植株根长长至2cm时，移入砂:蛭石的重量比为1:1、经过温度为121℃以及压强为100kPa灭菌的基质中，前5天盖好封口膜，保持湿度为90%，27℃条件下生长17天，，期间每3天浇一次B5培养基无机盐溶液，之后移至室外土壤中生长，精心管理即可；四倍体植株较二倍体植株茎粗壮，叶片变大变厚，节间较短，叶色变深，生长缓慢；
h、当移栽成活的植株长到25cm左右时取幼嫩根尖；将根尖用0.002mol/L 8-羟基喹啉浸泡处理4h；用甲醇:冰醋酸=3:1的卡诺氏固定液固定50min；倒去卡诺氏固定液，用蒸馏水漂洗3次，再放入1mol/L盐酸中，60℃水浴中解离20min，然后用蒸馏水漂洗3次；将根尖放在载玻片上，切下顶端分生区2mm，滴加卡宝品红染液染色10min；盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用拇指用力压盖玻片，然后用铅笔的橡皮头敲打，使细胞和染色体分散；在显微镜下观察，二倍体的亚麻根尖染色体数为2n=2x=32，四倍体的亚麻根尖染色体数为2n=4x=64。
其中，MSB培养基的配方是NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0 mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。
B5培养基的配方是NH4SO4 134mg/L，KNO3 251900mg/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，MgSO4·7H2O 250mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·4H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，维生素B1 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。