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1、10申请公布号CN102017891A43申请公布日20110420CN102017891ACN102017891A21申请号201010500008622申请日20101008A01H1/06200601A01H1/02200601A01C1/0020060171申请人普罗米绿色能源（深圳）有限公司地址518000广东省深圳市南山区高新科技园中区科智西路25栋2段3层西72发明人杨建廖柏勇74专利代理机构深圳市维邦知识产权事务所44269代理人黄莉54发明名称高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法57摘要本发明涉及一种高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，包括以下步骤前处理步骤，收。
2、集麻疯树种子，并对种子进行前处理；诱变处理步骤，利用适当浓度的EMS溶液对麻疯树种子进行化学诱变处理适当长时间，在化学诱变处理过程中，还同时进行搅拌，以保证EMS溶液浓度均匀且所有麻疯树种子能够充分与EMS溶液接触；育苗、移栽步骤，将经过诱变处理的麻疯树M_1种子进行育苗并适时移栽，以培育出麻疯树M_1植株；自交授粉步骤，培育出的麻疯树M_1植株进入开花期后，对其进行自交授粉，所结果实成熟后即获得麻疯树M_2种子。本发明利用甲基磺酸乙酯作为诱变剂对麻疯树种子进行诱变，并配合前处理以及诱变时的搅拌和自交授粉，可快速获得EMS处理的麻疯树M_2种子。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局1。
3、2发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页CN102017903A1/2页21一种高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于，包括以下步骤前处理步骤，收集麻疯树种子，并对种子进行前处理后备用；诱变处理步骤，利用适当浓度的EMS溶液对麻疯树种子进行化学诱变处理适当长时间，在化学诱变处理过程中，还同时进行搅拌，以保证EMS溶液浓度均匀且所有麻疯树种子能够充分与EMS溶液接触；育苗、移栽步骤，将经过诱变处理的麻疯树M_1种子进行育苗并适时移栽，以培育出麻疯树M_1植株；自交授粉步骤，培育出的麻疯树M_1植株进入开花期后，对其进行自交授粉，所结果实成熟后即获得麻疯树M_2种子。2如权利。
4、要求1所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述前处理步骤中，所述前处理是指对收集的麻疯树种子胚根端剪去部分种壳以使种仁中的胚根端裸露且不伤及胚根。3如权利要求1或2所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于前处理步骤中，所收集的麻疯树种子为云南省分布区内的种源选优后的麻疯树种子。4如权利要求1所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述诱变处理步骤具体处理过程如下配制处理麻疯树种子的EMS溶液所述EMS溶液总体积的毫升数为待诱变处理的麻疯树种子总质量的千克数的34倍，且EMS溶液中EMS原液的体积百分含量为0406，余量为水，将水和。
5、EMS原液依次加入带有搅拌机构的处理容器中，启动搅拌机构进行搅拌直至EMS原液在溶液中分布均匀；将经过前处理的的麻疯树种子加入装有EMS溶液的处理容器中，设置搅拌机构，使其进入自动间歇性搅拌模式，以保证EMS溶液浓度均匀且所有麻疯树种子能够充分与EMS溶液接触，自动间歇性搅拌的总时长为812小时；自动间歇性搅拌处理结束后，及时排出EMS溶液，用清水对EMS溶液处理过的麻疯树种子进行多次搅拌清洗以清除残留在麻疯树种仁上的EMS溶液，清洗后的麻疯树种子用网兜吊起，过夜晾干。5如权利要求1或4所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述诱变处理步骤所使用的处理容器为经过改装的洗衣。
6、机，该改装过的洗衣机具有自动间歇搅拌模式，并可设置自动间歇搅拌的总运转时间、单次搅拌的持续时长、两次搅拌之间的间隔时间。6如权利要求1或4所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于诱变处理步骤中，在利用EMS溶液对麻疯树种子进行浸渍处理的过程中，环境温度保持在253。7如权利要求4所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述诱变处理步骤中排出的废液用NAOH颗粒中和降解。8如权利要求1所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述育苗、移栽步骤的具体操作如下育苗对经过化学诱变处理的麻疯树种子在苗床上进行点播育苗；权利要求书CN102017。
7、891ACN102017903A2/2页3移栽当苗木生长达到2030CM高度时，再移栽苗木，株行距1515M，培育形成麻疯树M_1植株。9如权利要求1所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述自交授粉步骤的具体操作如下套袋在移栽后M_1植株进入花期之后，选择雌蕊饱满但花瓣尚未并未张开的花序利用无纺布袋进行套袋；人工自交授粉大约23天后，待雌花花瓣反卷开放，柱头分离、二裂露出花冠，且柱头绿色的时机下，解开套袋，采用本枝条或本植株的花药刚开裂散粉的雄花，将花粉涂抹在雌花柱头上进行人工自交授粉，授粉完毕后，继续对雌花套袋以防止外源花粉污染柱头，经过适当长时间后再解开套袋，标记已。
8、经人工授粉的花序；收获人工自交授权的花序雌蕊发育生长3045天后，即形成成熟果实，人工收集有标记的成熟麻疯树果实，剥去果皮，晒干，即获得EMS处理的麻疯树M_2种子。10如权利要求9所述的高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，其特征在于所述套袋是由带网眼的无纺布裁取制作而成。权利要求书CN102017891ACN102017903A1/6页4高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法技术领域0001本发明涉及植物诱变及繁殖生物学领域，具体涉及一种利用烷化剂甲基磺酸乙脂（缩写简称为“EMS”，其分子式为CH3SO2OC2H5）对麻疯树种子处理诱发突变以及高效生产麻疯树M_2种子的方法。背景。
9、技术0002麻疯树为大戟科（EUPHORBIACEAE）麻疯树属（JATROPHA）植物，为一种抗旱、耐瘠薄多用途速生树种，在我国主要分布于云南、四川、广西、广东、海南等地质结构复杂、水土流失严重、山地灾害严重、生态环境较脆弱的区域。麻疯树是生产生物能源、生物农药、生物医药、生物饲料的主要原料。国内外研究表明，麻疯树种子含油率高，除榨取能源油外，其油渣、油饼可做农药、饲料或肥料等；全株有毒，茎、叶、树皮均有丰富的白色乳汁，内含大量的毒蛋白、麻疯酮等抗病毒、抗AIDS、抗肿瘤成份，可开发作医药、生物农药和生物杀虫剂等。目前世界上对麻疯树虽有所重视，但研究深度仍不够，由于缺乏优良品种，尚未形成麻疯。
10、树规模化产业。0003麻疯树在我国各布区内地理环境条件相似，种源间差异小，种内杂交获得优良品种的几率较小。麻疯树属在国内分布包括麻疯树、珊瑚花、棉叶珊瑚花、琴叶珊瑚花、佛肚五个种，五个种因分布在不同区域，收集资源较困难，且种间杂交障碍较高，因此利用常规杂交育种必须先进行种子资源的收集工作。在收集种子资源的同时，通常会采用诱变手段，期望通过诱变加速麻疯树的基因变异速率，拓宽遗传基础，在此基础上再进行一系列定向培育。0004目前使用较多的诱变手段主要有两类辐射诱变和化学诱变。化学诱变剂利用其活性基团直接与生物分子进行各种特定的化学反应，从而引起生物分子化学性质的改变，对生物分子的影响是个别的、局部。
11、的，不利作用小。且烷化剂引起的突变频率高，尤其是产生非常高的叶绿素突变频率，NILAN用NAN3处理大麦种子，其叶绿素突变频率达46，非致死形态突变率高达585；毛炎麟等（1981）用103M的NAN3获得的叶绿素突变频率亦高达48。在大部分情况下，就数量突变而言，化学诱变作用比辐射诱变要高得多。其中，采用甲基磺酸乙酯进行化学诱变的突变率相对较高。0005但是，总体来看，现有的化学诱变手段虽然操作较简单，但其诱变效率和品质仍显不足，难以满足大批量生产的需求，无法快速有效地获得高产、优质、抗逆性强的麻疯树品种。发明内容0006本发明所要解决的技术问题是，提供一种高效生产EMS处理的麻疯树M_2种。
12、子的方法，以提高采用EMS诱变的效率及品质，快速有效地得到麻疯树M_2种子。0007为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种高效生产EMS处理的麻疯树M_2种子的方法，包括以下步骤说明书CN102017891ACN102017903A2/6页5前处理步骤，收集麻疯树种子，并对种子进行前处理后备用；诱变处理步骤，利用适当浓度的EMS溶液对麻疯树种子进行化学诱变处理适当长时间，在化学诱变处理过程中，还同时进行搅拌，以保证EMS溶液浓度均匀且所有麻疯树种子能够充分与EMS溶液接触；育苗、移栽步骤，将经过诱变处理的麻疯树M_1种子进行育苗并适时移栽，以培育出麻疯树M_1植株；自交授粉步骤，培育出。
13、的麻疯树M_1植株进入开花期后，对其进行自交授粉，所结果实成熟后即获得麻疯树M_2种子。0008进一步地，所述前处理步骤中，所述前处理是指对收集的麻疯树种子胚根端剪去部分种壳以使种仁中的胚根端裸露且不伤及胚根。0009进一步地，前处理步骤中，所收集的麻疯树种子为云南省分布区内的种源选优后的麻疯树种子。0010进一步地，所述诱变处理步骤具体处理过程如下配制处理麻疯树种子的EMS溶液所述EMS溶液总体积的毫升数为待诱变处理的麻疯树种子总质量的千克数的34倍，且EMS溶液中EMS原液的体积百分含量为0406，余量为水，将水和EMS原液依次加入带有搅拌机构的处理容器中，启动搅拌机构进行搅拌直至EMS原。
14、液在溶液中分布均匀；将经过前处理的的麻疯树种子加入装有EMS溶液的处理容器中，设置搅拌机构，使其进入自动间歇性搅拌模式，以保证EMS溶液浓度均匀且所有麻疯树种子能够充分与EMS溶液接触，自动间歇性搅拌的总时长为812小时；自动间歇性搅拌处理结束后，及时排出EMS溶液，用足量的清水对EMS溶液处理过的麻疯树种子进行多次搅拌清洗以清除残留在麻疯树种仁上的EMS溶液，清洗后的麻疯树种子用网兜吊起，过夜晾干。0011进一步地，所述诱变处理步骤所使用的处理容器为经过改装的洗衣机，该改装过的洗衣机具有自动间歇搅拌模式，并可设置自动间歇搅拌的总运转时间、单次搅拌的持续时长、两次搅拌之间的间隔时间。0012进。
15、一步地，诱变处理步骤中，在利用EMS溶液对麻疯树种子进行浸渍处理的过程中，环境温度保持在253。0013进一步地，所述诱变处理步骤中排出的废液用NAOH颗粒中和降解。0014进一步地，所述育苗、移栽步骤的具体操作如下育苗对经过化学诱变处理的麻疯树种子在苗床上进行点播育苗；移栽当苗木生长达到2030CM高度时，再移栽苗木，株行距1515M，培育形成麻疯树M_1植株。0015进一步地，所述自交授粉步骤的具体操作如下套袋在移栽后M_1植株进入花期之后，选择雌蕊饱满但花瓣尚未并未张开的花序利用无纺布袋进行套袋；人工自交授粉大约23天后，待雌花花瓣反卷开放，柱头分离、二裂露出花冠，且柱头绿色的时机下，解。
16、开套袋，采用本枝条或本植株的花药刚开裂散粉的雄花，将花粉涂抹在雌花柱头上进行人工自交授粉，授粉完毕后，继续对雌花套袋以防止外源花粉说明书CN102017891ACN102017903A3/6页6污染柱头，经过适当长时间后再解开套袋，标记已经人工授粉的花序；收获人工自交授权的花序雌蕊发育生长3045天后，即形成成熟果实，人工收集有标记的成熟麻疯树果实，剥去果皮，晒干，即获得EMS处理的麻疯树M_2种子。0016进一步地，所述套袋是裁取带网眼的无纺布制作而成。0017本发明的有益效果如下本发明在使用甲基磺酸乙酯（EMS）作为诱变剂的基础上，通过对麻疯树种子进行化学诱变前处理，以及在化学诱变处理的同。
17、时配合搅拌，从而能够获得80以上致死率的麻疯树M_1植株，且形态突变频率较高；而在后期再配合自交授粉处理，能高效生产出EMS处理的麻疯树M_2种子，为进一步进行定向育种提供了丰富的变异材料，进而可以从M_1植株、M_2种子中筛选出优良突变个体，进行推广或作为进一步育种的中间材料。具体实施方式0018图1是本发明的试验例在不同处理方式下的出芽率折线图。0019图2是本发明的试验例在不同处理方式下的苗高折线图。具体实施方式0020本发明提供一种生产麻疯树M_2种子的方法，包括以下步骤前处理步骤，收集麻疯树种子，并对种子进行化学诱变前处理；诱变处理步骤，利用适当浓度的EMS溶液对麻疯树种子进行化学诱。
18、变处理适当长时间，在化学诱变处理过程中，还同时进行搅拌，以保证EMS溶液浓度均匀且所有麻疯树种子能够充分与EMS溶液接触；育苗、移栽步骤，将经过诱变处理的麻疯树M_1种子进行育苗并适时移栽培育出麻疯树M_1植株，此步骤与现有的麻疯树育种方法中的相应步骤没有实质性的差异，在此不多赘述；自交授粉步骤，培育出的麻疯树M_1植株进入开花期后，对其进行自交授粉，所结果实成熟后即获得麻疯树M_2种子。0021其中，所述的化学诱变前处理步骤中，所收集的种子主要是从云南省各地收集7个地区不同种源麻疯树种子，晾晒至种子含水量在10左右后，再将每粒麻疯树种子的胚根端剪去适当长度的种壳后备用，种壳通常剪去的长度为2。
19、3MM，以不伤及种皮与胚根并使种仁中胚根端裸露为限。0022而进行诱变处理步骤时，通常需采用诸如洗衣机等较大型的带有旋转搅拌机构的容器。若采用的是洗衣机，则需要对现有的洗衣机进行改进，相应增加定时装置从而使洗衣机具备完善的自动间歇搅拌模式，并可对自动间歇搅拌模式的总运转时间、单次搅拌的持续时长、两次搅拌之间的间隔时间等参数进行有效设置。0023具体实施诱变处理时，先往该容器内加入清水以及EMS原液（在本发明的实施例中，使用的是SIGMA公司生产的EMS原液），启动旋转搅拌机构58分钟使EMS原液被搅拌分散均匀后获得EMS溶液；再将经过前处理的麻疯树种子倒进EMS溶液中，再次启动旋转搅拌机构进行。
20、搅拌25分钟后使种子初步均匀分散；然后，将旋转搅拌机构设置为自动间歇搅拌模式，并设置该模式总运转时间为915小时，每隔30分钟即运说明书CN102017891ACN102017903A4/6页7转20分钟，从而对种子进行间歇搅拌，使种子得到EMS溶液的充分浸渍；自动间歇搅拌模式结束后，即及时排出EMS溶液，并注入清水对种子进行搅拌清洗，搅拌510分钟后排出废水，再重复注入清水搅拌清洗排出废水的流程510次；最后，将清洗好的麻疯树种子转入网兜内，过夜晾干备用。在整个诱变处理过程中，应当保持环境温度为253，以减少影响EMS处理影响因素。0024而在育苗、移栽步骤中，首先需准备苗床，在诱变处理后的。
21、麻疯树种子晾干的第二天下午5点之后在苗床上点播处理后种子；当苗木生长达2030CM高度时，即可移栽至大田继续培养，株行距1515M。0025在自交授粉步骤中，当移栽后M_1植株进入花期后，选择雌蕊饱满但花瓣尚未张开的花序利用无纺布袋进行人工套袋，可使用3245CM带网眼50G无纺布截剪制作成3020CM的无纺布袋供套袋使用；套袋后大约23天，待雌花花瓣反卷开放，柱头分离、二裂露出花冠，且柱头绿色的时机下，解开套袋，采用本枝条或本植株的花药刚开裂散粉的雄花，将花粉涂抹在雌花柱头上进行人工自交授粉，选取的花粉要由花药刚散粉，且尽量多的涂抹在柱头上，降低因花粉活力导致授粉失败，且授粉完毕后，柱头在短。
22、时间内仍有接受外源花粉的可能，为以防外源花粉污染，应继续套袋8小时后再解开套袋，并标记已经人工授粉的花序；授粉3045天之后，待所标记花序雌蕊发育成果实且果皮由绿色转为黄色，人工收集有标记的成熟麻疯树果实，剥去果皮，晒干，即可获得EMS处理的麻疯树M_2种子。0026下面通过一个试验例、两个实施例以及两个相应的对比例来具体说明本发明实施过程及效果。0027试验例1本试验例具体包括以下步骤1、选取收集的云南野生种种子42份、每份100粒，按照前述要求在每粒种子的胚根端剪去3MM种壳。00282、按照02、04、06、08、1、26种EMS溶液浓度（体积百分比），分别配制溶液，具体配制如下总体积2。
23、00ML，02EMS溶液包括400ULEMS原液、1996ML清水；04包括800ULEMS原液、1992ML清水；08包括16MLEMS原液、1984ML清水；1包括2MLEMS原液、198ML清水；2包括4MLEMS原液、196ML清水。以上6种溶液分别配制7份，分装于42个密封瓶中。00293、将上述不同浓度的7份溶液分开摆放，置入第一步中准备的种子，按照上述7份6种不同EMS浓度浸泡种子，总时间分别设置为6H、8H、9H、10H、12H、24H、48H7个梯度，每隔30MIN搅拌20SEC，使种子得到EMS溶液的充分浸渍。00304、浸泡完毕之后，置入200ML清水溶液清洗，过夜晾干，。
24、在第二天下午5点后将晾干了的EMS处理过的种子点播到准备好的苗床中，统计出芽率、统计苗高，相关数据如下表1所示。而不同处理方式下的出芽率以及苗高分别如图1及图2所示。0031表1试验例中相对发芽率说明书CN102017891ACN102017903A5/6页8实施例1本实施例具体包括以下步骤1、选取云南楚雄州永仁县种源麻疯树当年收集的野生种种子8000粒，按前述的要求在每粒种子的胚根端剪去3MM种壳。00322、清洗按照上述要求进行了改进的洗衣机，置入14940ML清水、60MLEMS原液，旋转搅拌5MIN之后，将第1步中准备的种子倒进搅拌后的EMS溶液中，旋转搅拌2MIN之后设置进入自动间歇。
25、搅拌模式，设置其总运转时间为9小时、每隔30MIN即运转搅拌20SEC，使种子得到EMS溶液的充分浸渍。00333、自动间歇搅拌模式运行完毕后，及时排出EMS溶液，置入15000ML清水，搅拌5MIN之后排出，重复8次后，排干洗衣机中液体，排出的EMS溶液以及清洗废液使用NAOH进行中和降解处理，将处理后种子置入网兜中，过夜晾干。00344、在第二天下午5点后将第3步中晾干了的EMS处理过的种子点播到准备好的苗床中，统计出芽率；当M_1苗株高达2030CM后移栽到大田中，株行距为1515M。00355、麻疯树M_1植株进入花期后，用无纺布袋对雌蕊饱满但花瓣未展开没有进行授粉的花序进行套袋，3天。
26、后解袋进行人工自交授粉，授粉后继续套袋8小时后再解袋培养，并标记人工授粉的花序。00366、继续生长3045天，待所标记花序雌蕊发育成果实且果皮由绿色转为黄色，即可人工收集有标记的成熟麻疯树果实，剥去果皮，晒干，即获得EMS处理的麻疯树M_2种子。0037实施例2本实施例采用的处理步骤与实施例1基本相同，其不同之处即在于本实施例前处理步骤中所收集的麻疯树种子是云南楚丽江市金安镇种源麻疯树当年收集的野生种种子。0038对比例1本对比例1采用的处理步骤与实施例1基本相同，其不同之处即在于本对比例的诱变处理步骤中是使用清水来浸渍种子，而非使用EMS溶液，清水用量与EMS溶液体积相同，相应地，后续的诱。
27、变处理后的清洗操作可以适当简化。0039对比例2本对比例2采用的处理步骤与实施例1基本相同，其不同之处即在于本对比例的诱变处理步骤中是使用清水来浸渍种子，而非使用EMS溶液，清水用量与EMS溶液体积相同，相应地，后续的诱变处理后的清洗操作可以适当简化。在上述各实施例及对比例说明书CN102017891ACN102017903A6/6页9中，如下表24分别示出了实施例1、2中的各类种子的相对发芽率以及结实率表2实施例1的相对发芽率对比例1发芽数实施例1发芽数相对发芽率67031254187表3实施例2的相对发芽率对比例2发芽数实施例2发芽数相对发芽率61961074173表4实施例1、2的结实率。
28、人工授粉雌蕊数结实数结实率实施例11006363实施例21005757从上表中的数据以及图1、图2可以发现，本发明所采取的EMS诱变处理方式能够对不同种源的麻疯树种子产生影响，并通过相对发芽率表现出来，且针对不同种源当年生野生种均可获得低于20的相对发芽率；本发明采用的人工自交授粉方式也能够在不同群体中获得50以上的自交结实率。可见，通过采用本发明的方法，同时可以对麻疯树其他种源、品种进行EMS诱变育种，且可以快速有效的获得诱变后的麻疯树M_2种子，从而能够实现通过诱变手段改良麻疯树品种的目的。说明书CN102017891ACN102017903A1/1页10图1图2说明书附图CN102017891A。