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1、(10)申请公布号 CN 102187870 A (43)申请公布日 2011.09.21 CN 102187870 A *CN102187870A* (21)申请号 201010131175.8 (22)申请日 2010.03.19 CCTCC M 2010045 2010.03.01 A01N 43/90(2006.01) C12P 33/20(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/69(2006.01) (71)申请人 中国科学院烟台海岸带研究所 地址 264003 山东省烟台市莱山区春晖路 17 号 (72)发明人 季乃云 乔明锋 (74)专利代理机构 。
2、沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 许宗富 周秀梅 (54) 发明名称 一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱 类化合物的应用 (57) 摘要 本发明涉及杀虫剂领域， 具体地说是一种 海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合 物的应用。所述海藻内生真菌次生代谢产物二 萜生物碱类化合物具有杀虫作用， 海藻内生真 菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物如式 (I) 所示 ； 本发明通过分离于海洋红藻异管藻的真 菌 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)cf-2 发 酵 经 提取、 分离获得的二萜生物碱类天然化合物， 经 杀虫活性实验得出此二萜生物碱类化合物在 100 微克 。
3、/ 毫升时对卤虫的致死率为 74.2。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 102187870 A1/1 页 2 1. 一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用， 其特征在于 ： 所述海 藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物具有杀虫作用， 海藻内生真菌次生代谢产物 二萜生物碱类化合物如式 (I) 所示。 2. 按权利要求 1 所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用， 其特 征在于 ： 所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物可作为杀虫剂。 3. 。
4、按权利要求 1 所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用， 其特 征在于 ： 所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物按如下步骤制备 ： 1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵20-25天， 过滤， 发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩， 收集的菌丝体用有机溶剂提取， 而后再经乙酸乙酯萃取 浓缩， 发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并， 即为粗提物 ； 所述米曲霉(Asp.oryzae)cf-2， 其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心 CCTCC， 保藏编号为 CCTCC M 2010045， 株号为 cf-2 ； 2。
5、) 取步骤 1) 中的粗提物进行硅胶柱层析， 用有机溶剂进行梯度洗脱， 收集洗脱液， 洗 脱液经薄层层析检测 ； 3)收集步骤2)中以洗脱液体积比10-151梯度的洗脱组分， 将收集的洗脱组分进行 凝胶柱层析、 硅胶柱层析和薄层层析分离纯化， 纯化收集Rf值为0.6-0.7组分， 即得海藻内 生真菌二萜生物碱类化合物。 4. 按权利要求 3 所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用， 其特 征在于 ： 步骤 1) 中的有机溶剂提取液为氯仿、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙醇或甲醇中一种或几种。 5. 按权利要求 3 所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用， 其特 征在于 。
6、： 步骤 2) 中的有机溶剂为石油醚 - 乙酸乙酯或石油醚 - 丙酮。 6. 按权利要求 3 所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 3) 所述凝胶柱层析洗脱液为体积比 1-2 1 的氯仿 - 甲醇或氯仿 - 乙 醇 ； 硅胶柱层析洗脱液为体积比 5-15 1 比石油醚 - 乙酸乙酯或石油醚 - 丙酮 ； 薄层层析 展开剂为体积比为 5 1 的石油醚 - 乙酸乙酯。 7. 按权利要求 3 所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 3) 所述凝胶柱层析时收集经 TLC 检测为深红色斑点的组分 ； 硅胶柱层析 时。
7、收集以洗脱液体积比 10-15 1 梯度的洗脱液。 权 利 要 求 书 CN 102187870 A1/4 页 3 一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应 用 技术领域 0001 本发明涉及杀虫剂领域， 具体地说是一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱 类化合物的应用。 背景技术 0002 随着化学合成农药使用时间的推移， 其产生的不良影响已越来越突出。化学农药 大规模地生产和无限制地大量使用， 使 70 80的农药直接渗透到环境中， 残留非常严 重， 对土壤、 地表水、 地下水造成污染， 并进一步进入生物链， 对生物和人类健康都造成直接 和潜在的危害。我国加入世界贸易组织后， 因。
8、化学农药残留而导致的 “绿色壁垒” 严重制约 着我国农产品的出口， 传统农业产业面临着更大的风险和挑战。农业部已从 2001 年起在全 国范围内实施 “无公害食品行动计划” ， 而使用无公害农药又是实施这一目标的关键措施， 于是人们把目光投向对环境更友好的生物农药。与传统的化学合成农药相比， 生物农药具 有对人畜和非靶标生物安全， 环境兼容性好， 不易产生抗性等优点。 生物农药的开发应用对 人类健康， 环境保护和农业的可持续发展都具有极其重要的意义。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种天然的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合 物的应用。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技。
9、术方案为 ： 0005 一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用， 所述海藻内生真菌 次生代谢产物二萜生物碱类化合物具有杀虫作用， 海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱 类化合物如式 (I) 所示。 0006 0007 所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物可作为杀虫剂。 所述海藻内 生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物按如下步骤制备 ： 0008 1) 将米曲霉 (Aspergillus oryzae)cf-2 接种于真菌液体培养基中静止发酵 20-25 天， 过滤， 发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩， 收集的菌丝体用有机溶剂提取， 而后再经乙酸 乙酯萃取浓缩， 发酵液所得浓缩物和。
10、菌丝体所得浓缩物合并， 即为粗提物 ； 0009 所述米曲霉(Asp.oryzae)cf-2， 其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏 中心 CCTCC， 保藏编号为 CCTCC M 2010045， 株号为 cf-2 ； 说 明 书 CN 102187870 A2/4 页 4 0010 2) 取步骤 1) 中的粗提物进行硅胶柱层析， 用有机溶剂进行梯度洗脱， 收集洗脱 液， 洗脱液经薄层层析检测 ； 0011 3)收集步骤2)中以洗脱液体积比10-151梯度的洗脱组分， 将收集的洗脱组分 进行凝胶柱层析、 硅胶柱层析和薄层层析分离纯化， 纯化收集Rf值为0.6-0.7组分， 即得海 。
11、藻内生真菌二萜生物碱类化合物。 0012 步骤 1) 中的有机溶剂提取液为氯仿、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙醇或甲醇中一种或几种。 步骤 2) 中的有机溶剂为石油醚 - 乙酸乙酯或石油醚 - 丙酮。步骤 3) 所述凝胶柱层析洗脱 液为体积比 1-2 1 的氯仿 - 甲醇或氯仿 - 乙醇 ； 硅胶柱层析洗脱液为体积比 5-15 1 比 石油醚 - 乙酸乙酯或石油醚 - 丙酮 ； 薄层层析展开剂为体积比为 5 1 的石油醚 - 乙酸乙 酯。步骤 3) 所述凝胶柱层析时收集经 TLC 检测为深红色斑点的组分 ； 硅胶柱层析时收集以 洗脱液体积比 10-15 1 梯度的洗脱液。 0013 本发明具有以下优。
12、点 ： 0014 本发明通过分离于海洋红藻异管藻的真菌米曲霉 (Asp.oryzae)cf-2 发酵经提 取、 分离获得的二萜生物碱类天然化合物， 经杀虫活性实验得出二萜生物碱类化合物在 100 微克 / 毫升时对卤虫的致死率为 74.2。 具体实施方式 ： 0015 下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。 0016 实施例 1 0017 如式 (I) 所示的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物具有杀虫作用， 可作为杀虫剂。 0018 0019 杀虫活性实验 ： 0020 卤虫 (Brine Shrimp) 也称盐水丰年虫， 分类上属于节肢动物门， 甲壳纲， 无甲目， 盐水丰年虫科， 卤。
13、虫属， 卤虫作为一种重要的和良好的实验动物材料， 一直受到人们的广泛 重视。采用控制条件下实验室培育的该昆虫， 借其来评价化合物杀虫活性的强弱 . 0021 卤虫卵的孵化 ： 取卤虫卵 100 毫克置于 500 毫升烧杯中， 加入人工海水 400 毫升， 用一小充气泵缓缓充气， 室温孵化 24 小时， 除去卵壳及未孵化的卵， 卤虫幼虫继续培养 24 小时， 备用。 0022 卤虫生物致死法 ： 依照Solis的改良法， 取96孔细胞培养板， 每孔加190微升含10 个左右卤虫幼虫的人工海水液， 制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设三 个平行孔， 空白对照组加 10 微升溶剂二甲基亚。
14、砜 (DMSO)， 样品组加 10 微升、 浓度为 2.0 毫 克 / 毫升式 (I) 所示的二萜生物碱类化合物的 DMSO 溶液， 其中式 (I) 所示的二萜生物碱类 化合物的 DMSO 溶液是以 DMSO 为溶剂， 式 (I) 所示化合物为溶质。室温培养 24 小时后， 在 说 明 书 CN 102187870 A3/4 页 5 双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。 0023 卤虫生物致死活性以校正死亡率表示， 计算公式如下 ： 0024 校正死亡率 ( 对照组存活率 - 处理组存活率 )/ 对照组存活率 100 0025 实验结果 ： 式 (I) 所示的二萜生物碱类化合物在 100 微。
15、克 / 毫升时对卤虫的致死 率为 74.2。 0026 实施例 2 0027 式 (I) 所示的二萜生物碱类化合物的制备方法 ： 0028 取平板上生长良好的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2菌种， 其于2010年3月1日保 存于中国典型培养物保藏中心 CCTCC， 保藏编号为 CCTCC M2010045， 株号为 cf-2 ； 切成小块 接种于 PDB 液体培养基中， 每 1L 三角瓶中放 300mL 培养基， 共 30 瓶， 室温静止发酵 23 天， 加入发酵液二分之一体积乙酸乙酯杀灭真菌， 过滤， 分别收集菌丝体和发酵液。所述 PDB 液 体培养基组成为每升含土豆汁200毫升，。
16、 葡萄糖20克， 蛋白胨5克， 酵母膏3克， 陈海水500 毫升， 蒸馏水 300 毫升。 0029 收集发酵液约 9L， 用乙酸乙酯萃取三次， 减压浓缩 ； 菌丝体粉碎后用体积比 1 1 的氯仿 - 甲醇提取三次， 再用乙酸乙酯萃取， 减压浓缩 ； 浓缩物经薄层层析检测其结果相 似， 合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物 8g。将粗提物进行 200-300 目的硅胶柱 层析， 用石油醚 - 乙酸乙酯以 100 0， 50 1， 20 1， 10 1， 5 1， 1 1 到 0 100 的 梯度进行洗脱， 分别收集洗脱液， 再用薄层层析 (TLC) 检测 ( 薄层层析检测时用茴香醛 - 硫。
17、 酸作为显色剂 )， 根据 Rf 值来判断、 合并相同或类似部分， 获得 22 个组分 (1-22)。将组分 15即以石油醚-乙酸乙酯体积比为101梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、 硅胶柱和薄层 层析分离， 凝胶柱层析时洗脱液为体积比 1 1 的氯仿 - 甲醇， 洗脱下的组分经 TLC 检测采 用石油醚 - 乙酸乙酯为展开剂， 收集深红色斑点的组分， 硅胶柱层析时用梯度在 10 1 到 5 1 的石油醚 - 乙酸乙酯进行洗脱， 收集 10 1 的石油醚 - 乙酸乙酯洗脱下的组分， 经 薄层层析分离用 5 1 的石油醚 - 乙酸乙酯为展开剂， 收集 Rf 值为 0.6-0.7 的组分， 得式 (I。
18、) 所示的二萜生物碱类化合物 (109.7 毫克 )， 经 TLC 检测， 呈单个、 均匀深红色斑点， 确定 为纯化合物。经波谱分析， 其结构鉴定为 JBIR-03， 结构式如 (I) 所示。 0030 0031 该化合物具有以下理化和波谱特性 ： 0032 无色晶体， 核磁共振氢谱 (1H NMR， CDCl3， 500MHz)0.91(s)， 1.03(s)， 1.10(s)， 1.69(s)， 1.73(s)， 3.24(dd， J 12.4， 3.2Hz)， 4.83(m)， 5.34(d， J 9.0Hz)， 7.06(t， J 8.0Hz)， 7.07(t， J 8.0Hz)， 7。
19、.29(d， J 8.0Hz)， 7.42(d， J 8.0Hz) ； 核磁共振碳谱 (13C NMR， CDCl3， 125MHz)14.7(q)， 15.1(q)， 18.1(q)， 20.8(q)， 22.8(t)， 25.4(t)， 25.4(t)， 26.0(q)， 27.7(t)， 34.3(t)， 40.5(s)， 45.2(s)， 46.5(d)， 48.7(t)， 48.9(d)， 52.9(s)， 73.7(d)， 86.1(d)， 111.6(d)， 118.0(s)， 118.4(d)， 119.5(d)， 120.4(d)， 125.2(s)， 说 明 书 CN 10。
20、2187870 A4/4 页 6 127.0(d)， 135.0(s)， 140.1(s)， 150.8(s)。 0033 上述化合物与 JBIR-03( 参考文献 Ogata， M. ； Ueda， J.Y. ； Hoshi， M. ； Hashimoto， J. ； Nakashima， T. ； Anzai， K. ； Takagi， M. ； Shin-ya， K.Anovel indole-diterpenoid， JBIR-03 with anti-MRSA activity fromDichotomomyces cejpii var.cejpii NBRC 103559.J.An。
21、tibiot.2007， 60(10)， 645-648.) 具有相同的理化和波谱特性。 0034 实施例 3 0035 与实施例 2 不同之处在于 0036 取平板上生长良好的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2菌种， 切成小块接种于PDB液 体培养基中， 每 1L 三角瓶中放 300mL 培养基， 共 30 瓶， 室温静止发酵 23 天， 加入二分之一 体积乙酸乙酯杀灭真菌， 过滤， 分别收集菌丝体和发酵液。所述 PDB 液体培养基组成为每升 含土豆汁 200 毫升， 葡萄糖 20 克， 蛋白胨 5 克， 酵母膏 3 克， 陈海水 500 毫升， 蒸馏水 300 毫 升。 0037 。
22、收集发酵液约 9L， 用乙酸乙酯萃取三次， 减压浓缩 ； 菌丝体粉碎后用丙酮提取三 次， 再用乙酸乙酯萃取， 减压浓缩 ； 浓缩物经薄层层析检测其结果相似， 合并发酵液和菌丝 体两部分的浓缩物为粗提物 8g。将粗提物进行 200-300 目的硅胶柱层析， 用石油醚 - 丙酮 以 100 0， 50 1， 20 1， 15 1， 10 1， 5 1， 1 1 到 0 100 的梯度进行洗脱， 分别 收集洗脱液， 再用薄层层析 (TLC) 检测 ( 薄层层析检测时用茴香醛 - 硫酸作为显色剂 )， 根 据 Rf 值来判断、 合并相同或类似部分， 获得 22 个组分 (1-22)。将组分 15 即以石油醚 - 丙 酮体积比为 15 1 梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、 硅胶柱和薄层层析分离， 凝胶柱层析 时洗脱液为体积比 2 1 的氯仿 - 乙醇， 洗脱下的组分经 TLC 检测采用石油醚 - 乙酸乙酯 为展开剂， 收集深红色斑点的组分， 硅胶柱层析时用梯度在 15 1 到 10 1 的石油醚 - 丙 酮进行洗脱， 收集 15 1 的石油醚 - 丙酮洗脱下的组分， 经薄层层析分离用 5 1 的石油 醚 - 乙酸乙酯为展开剂， 收集 Rf 值为 0.6-0.7 的组分， 得式 (I) 所示的二萜生物碱类化合 物。 说 明 书 。