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1、10申请公布号CN104212875A43申请公布日20141217CN104212875A21申请号201410455570X22申请日20140909C12Q1/0620060171申请人四川科伦药业股份有限公司地址610500四川省成都市新都卫星城工业开发区南二路72发明人邓茂林伍丹谭鸿波吴小愚刘文军罗成鑫刘思川程志鹏万阳浴葛均友74专利代理机构成都金英专利代理事务所普通合伙51218代理人袁英54发明名称一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法57摘要本发明公开了一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，包括以下步骤取生物指示剂，加入无菌水得到一次稀释液，分。
2、装到多支无菌试管；水浴热击；取出并迅速冷却至室温，对每一支无菌试管进行以下操作采用10倍递增稀释法逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，取二次稀释液2份分别注入两个无菌平皿内，再分别注入大豆酪蛋白琼脂培养基，凝固后培养；对所有无菌平皿内嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计数结果进行平均计算并再除以上述适宜梯度对应的稀释级，得到初始孢子数量，完成测定。本发明所述方法经过验证稳定可行，解决了以前生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量无法测定的问题，便于推广应用。51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申请公布号CN。
3、104212875ACN104212875A1/1页21一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，其特征在于包括以下步骤1取生物指示剂，加入无菌水并混合均匀后得到一次稀释液，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为1（35），将一次稀释液分别按相同体积装入多个无菌试管，得到供试品，另取1支无菌试管装入同体积的无菌水备用；2将上述供试品和装有无菌水的无菌试管共同进行水浴热击，水浴温度为95100，水浴时间为1020分钟，在此过程中把温度计插入装有无菌水的无菌试管内以测定水浴温度；3水浴热击完成后取出供试品，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无菌试管进行以下操作根据生物指。
4、示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30300CFU/ML，在该适宜梯度对应的稀释级下，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为AML，分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为（1520）AML温度不超过450的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培养，培养温度为5560，培养时间为4060小时；4完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤（3）中所述适宜梯度对应的稀释级，得到最终的初始孢子。
5、数量，完成测定。2根据权利要求1所述的生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，其特征在于所述步骤（1）中，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为14；所述步骤（2）中，水浴时间为15分钟；所述步骤（3）中，培养时间为48小时。3根据权利要求1或2所述的生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，其特征在于所述步骤（1）中，每支所述无菌试管内的一次稀释液的体积为10ML，装有所述稀释液的所述无菌试管的数量为12支；所述步骤（3）中，所述适宜梯度对应的稀释级为104，分别注入两个无菌平皿内的每份二次稀释液的体积为1ML，向每个无菌平皿内注入的大豆酪蛋白琼脂培养基的体积为。
6、1520ML。权利要求书CN104212875A1/6页3一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法技术领域0001本发明涉及一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法。背景技术0002生物指示剂是一类特殊的活微生物制品，通常为细菌的孢子，因其对特定灭菌处理有确定的抗力，可用于确认灭菌设备的性能，灭菌工艺的验证，生产过程灭菌效果的监控等。生物指示剂的使用使得消毒灭菌监测手段更加完善，灭菌效果更加直观、有效，安全性高更，目前已广泛应用于医疗保健产品、卫生检疫、制药企业、医院制剂生产、食品生产等各行业，对各种无菌生产工艺、无菌产品、无菌包装材料等灭菌效果的评估、验证。生物指。
7、示剂中包含一定数量的细菌孢子，形式多样，如芽孢悬液、芽孢条、自含式、工业生物指示剂等。生物指示剂中芽孢含量是生物指示剂的重要质量指标。0003嗜热脂肪芽孢杆菌BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，细菌繁殖体G兰氏染色阳性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。其细菌繁殖体对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。其最低生长温度为28，最高生长温度7077。最适生长繁殖温度为5665，培养24H即可形成菌落，37下24H看不到菌落。0004嗜热脂肪芽孢杆菌作为生物指示剂中的一部分，其初始孢子数量到目前为止还没有一套行之有效的。
8、测定方法，用户只能根据其出厂产品的标示孢子数量了解，无法根据应用需求自主测定，尤其对于未知嗜热脂肪芽孢杆菌孢子数量的生物指示剂更是束手无策。所以，市场需要能够自主测定生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量的方法。发明内容0005本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法。0006为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案0007本发明所述生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，包括以下步骤00081取生物指示剂，加入无菌水并混合均匀后得到一次稀释液，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为135，将一次稀释液分别按相同体。
9、积装入多个无菌试管，得到供试品，另取1支无菌试管装入同体积的无菌水备用；00092将上述供试品和装有无菌水的无菌试管共同进行水浴热击，水浴温度为95100，水浴时间为1020分钟，在此过程中把温度计插入装有无菌水的无菌试管内以测定水浴温度；00103水浴热击完成后取出供试品，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无菌试管进行以下操作根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释说明书CN104212875A2/6页4至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30300CFU/ML，在该适宜梯度对应的稀释级下，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为AM。
10、L，分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为1520AML温度不超过450的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培养，培养温度为5560，培养时间为4060小时；00114完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤3中所述适宜梯度对应的稀释级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。0012作为优选，所述步骤1中，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为14；所述步骤2中，水浴时间为15分钟；所述步骤3中，培养时间为48小时。0013所述步骤1中，每支所述无菌试管内的一次。
11、稀释液的体积为10ML，装有所述稀释液的所述无菌试管的数量为12支；所述步骤3中，所述适宜梯度对应的稀释级为104，分别注入两个无菌平皿内的每份二次稀释液的体积为1ML，向每个无菌平皿内注入的大豆酪蛋白琼脂培养基的体积为1520ML。0014本发明的有益效果在于0015本发明所述方法经过验证稳定可行，解决了以前生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量无法测定的问题，便于用户根据应用需求自主测定生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量，尤其适用于未知嗜热脂肪芽孢杆菌孢子数量的生物指示剂的测定，便于推广应用。具体实施方式0016下面结合具体实施例对本发明作进一步具体描述0017实施例10018。
12、按以下步骤进行试验00191取生产批号为“VM328674”的德国默克的生物指示剂15支，每支2ML，采用漩涡混合仪混合5MIN后，将15支生物指示剂放置于无菌蓝盖瓶中，用玻璃棒把指示剂的安瓿瓶全部捣碎，加入无菌水120ML配成一次稀释液，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为14，边加无菌水边冲洗玻璃棒；待冲洗完成后，将无菌蓝盖瓶内的一次稀释液采用漩涡混合仪混合5MIN后，取13支无菌试管，分别取无菌蓝盖瓶内的10ML一次稀释液转移至12无菌试管内，分别标为A1A12，得到供试品A；另外1支无菌试管一般称为“空白对照管”取10ML无菌水转入，标为I0，做水浴热击时升温计时用。0020。
13、2将上述供试品A和装有无菌水的无菌试管即空白对照管共同进行水浴热击，水浴温度为95100，水浴时间为15分钟，在此过程中把温度计插入空白对照管内以测定水浴温度；00213水浴热击完成后取出供试品A，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无菌试管A1A12进行以下操作根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30300CFU/ML，本例中的适宜梯度对应的稀释级为104，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为1ML，分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为15说明书CN104212875A3/。
14、6页520ML温度不超过450的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培养，培养温度为5560，培养时间为48小时；00224完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤3中所述适宜梯度对应的稀释级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。0023完成测定后，按下面的公式计算初始孢子数量回收率00240025本例中初始孢子数量的实测过程数据及初始孢子数量回收率数据见下文表一所示。0026实施例20027按以下步骤进行试验00281取生产批号为“VM373174”的德国默克的生物指示剂15支，每支2。
15、ML，采用漩涡混合仪混合5MIN后，将15支生物指示剂放置于无菌蓝盖瓶中，用玻璃棒把指示剂的安瓿瓶全部捣碎，加入无菌水120ML配成一次稀释液，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为13，边加无菌水边冲洗玻璃棒；待冲洗完成后，将无菌蓝盖瓶内的一次稀释液采用漩涡混合仪混合5MIN后，取13支无菌试管，分别取无菌蓝盖瓶内的10ML一次稀释液转移至12无菌试管内，分别标为B1B12，得到供试品B；另外1支无菌试管一般称为“空白对照管”取10ML无菌水转入，标为I0，做水浴热击时升温计时用。00292将上述供试品B和装有无菌水的无菌试管即空白对照管共同进行水浴热击，水浴温度为95100，水浴时。
16、间为10分钟，在此过程中把温度计插入空白对照管内以测定水浴温度；00303水浴热击完成后取出供试品B，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无菌试管B1B12进行以下操作根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30300CFU/ML，本例中的适宜梯度对应的稀释级为104，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为1ML，分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为1520ML温度不超过450的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培养，培养温度为5560，培养时间为4。
17、0小时；00314完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤3中所述适宜梯度对应的稀释级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。0032完成测定后，按下面的公式计算初始孢子数量回收率0033说明书CN104212875A4/6页60034本例中初始孢子数量的实测过程数据及初始孢子数量回收率数据见下文表一所示。0035实施例30036按以下步骤进行试验00371取生产批号为“VM373274”的德国默克的生物指示剂15支，每支2ML，采用漩涡混合仪混合5MIN后，将15支生物指示剂放置于无菌蓝盖瓶中，用玻璃棒把指示剂的安瓿。
18、瓶全部捣碎，加入无菌水120ML配成一次稀释液，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为15，边加无菌水边冲洗玻璃棒；待冲洗完成后，将无菌蓝盖瓶内的一次稀释液采用漩涡混合仪混合5MIN后，取13支无菌试管，分别取无菌蓝盖瓶内的10ML一次稀释液转移至12无菌试管内，分别标为C1C12，得到供试品C；另外1支无菌试管一般称为“空白对照管”取10ML无菌水转入，标为I0，做水浴热击时升温计时用。00382将上述供试品C和装有无菌水的无菌试管即空白对照管共同进行水浴热击，水浴温度为95100，水浴时间为20分钟，在此过程中把温度计插入空白对照管内以测定水浴温度；00393水浴热击完成后取出供试。
19、品C，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无菌试管C1C12进行以下操作根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30300CFU/ML，本例中的适宜梯度对应的稀释级为104，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为1ML，分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为1520ML温度不超过450的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培养，培养温度为5560，培养时间为60小时；00404完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计。
20、数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤3中所述适宜梯度对应的稀释级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。0041完成测定后，按下面的公式计算初始孢子数量回收率00420043本例中初始孢子数量的实测过程数据及初始孢子数量回收率数据见下文表一所示。0044表一0045说明书CN104212875A5/6页700460047由上表可知，3批不同批号的德国默克生物指示剂初始孢子数回收率均在70100之间，达到标准所要求的50300，故测定的初始孢子数符合规定，本发明检测生物指示剂初始孢子数量的方法稳定可行，可用于生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始说明书CN104212875A6/6页8孢子数量的测定。说明书CN104212875A。