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1、10申请公布号CN104212868A43申请公布日20141217CN104212868A21申请号201410451152322申请日20140906C12P33/14200601C12R1/46520060171申请人青岛科技大学地址266061山东省青岛市崂山区松岭路99号72发明人张媛媛宿烽邹慧斌刘均洪54发明名称一种发酵法生产16羟基氢化可的松的工艺57摘要一种发酵法生产16羟基氢化可的松的方法，用产玫瑰色链霉菌在16位羟化氢化可的松，得到产品，生产工艺绿色环保，产率高，有很好的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求。
2、书1页说明书3页10申请公布号CN104212868ACN104212868A1/1页21一种发酵法生产16羟基氢化可的松的方法，其特征在于用产玫瑰色链霉菌羟化氢化可的松，生产16羟基氢化可的松；所用发酵培养基成份葡萄糖1014G/L,酵母浸膏57G/L,麦芽浸膏3040G/L，KH2PO445G/L,K2HPO420G/L,PH70，发酵过程如下种子培养；在带夹套发酵罐加入培养基，装料系数为0708，灭菌，冷却至3035，接种，接入产玫瑰色链霉菌，接种量为58，发酵分为2个阶段（1）细胞生长阶段，接种后2024H,调节PH为6065，加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为0509G/L，通。
3、入洁净空气，使溶氧饱和度为2030，调节温度为3035；（2）微生物转化阶段，从接种后2024H开始,直到发酵结束，全部发酵时间为120140小时；调节PH为7075，流加加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为1520G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为5060，调节温度为3540；发酵结束前4050H停止流加氢化可的松，以消耗剩余的底物氢化可的松；发酵结束，用离心或过滤除去细胞，用乙酸乙酯萃取发酵液，使16羟基氢化可的松转入有机相，蒸出有机相，得到产品，产品收率9095。权利要求书CN104212868A1/3页3一种发酵法生产16羟基氢化可的松的工艺技术领域0001本发明为甾体化合物生产。
4、领域，特别是微生物发酵法生产16羟基氢化可的松的技术。背景技术0002甾体在16位羟基化，可以产生很强的抗炎和糖（肾上腺）皮质激素活性，其中，16羟基氢化可的松是生产丙缩羟强龙等甾体药物的重要中间体，以前采用化学合成，这种生产工艺复杂，步骤繁琐，副产物多，同时生产过程中需要使用一些有毒试剂。0003中国发明专利申请2006100515112X、2013105768499、200710061260X、2007100602025公开了甾体化合物及甾体中间体的生产方法，然而，它们均没有涉及16羟基氢化可的松。0004因此，研究和开发一种收率高、工艺简单、经济实用且尽量避免使用各种有害试剂的生产方法，。
5、对用生物转化法生产16羟基氢化可的松有着非常重要的意义。发明内容0005本发明为甾体化合物生产领域，特别是微生物发酵法生产16羟基氢化可的松的技术。发明内容0006本发明用微生物发酵法生产16羟基氢化可的松，即A，结构式如下已知有多个链霉菌属微生物可以在甾体的16进行羟基化反应，例如银白链霉菌、产玫瑰色链霉菌等，可以自行筛选，也可以从各菌种保藏机构购买。本发明所用菌株为ATCC21895,为产玫瑰色链霉菌，用于发酵生产16羟基氢化可的松。0007发酵培养基成份葡萄糖1014G/L,酵母浸膏57G/L,麦芽浸膏3040G/L，KH2PO445G/L,K2HPO420G/L,PH70。底物为氢化可。
6、的松，在发酵过程中，产玫瑰色说明书CN104212868A2/3页4链霉菌将氢化可的松的16位羟基化，得到16羟基氢化可的松。0008发酵过程如下种子培养，根据需要，可能有1级或多级种子培养。在带夹套发酵罐加入培养基，装料系数为0708，灭菌，冷却至3035，接种，接入产玫瑰色链霉菌ATCC21895,接种量为58，发酵分为2个阶段（1）细胞生长阶段，接种后2024H,调节PH为6065，加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为0509G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为2030，调节温度为3035。0009（2）微生物转化阶段，从接种后2024H开始,直到发酵结束，全部发酵时间为120140。
7、小时。调节PH为7075，流加加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为1520G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为5060，调节温度为3540。发酵结束前4050H，以消耗剩余的底物氢化可的松。0010发酵结束，用离心或过滤除去细胞，用乙酸乙酯萃取发酵液，使16羟基氢化可的松转入有机相，蒸出有机相，得到产品，产品收率9095。0011实施例1发酵培养基成份葡萄糖10G/L,酵母浸膏5G/L,麦芽浸膏40G/L，KH2PO445G/L,K2HPO420G/L,PH70。底物为氢化可的松，在发酵过程中，产玫瑰色链霉菌将氢化可的松的16位羟基化，得到16羟基氢化可的松。0012发酵过程如下1级种子培。
8、养；在带夹套100L发酵罐加入培养基，装料系数为07，灭菌，冷却至3035，接种，接入产玫瑰色链霉菌ATCC21895,接种量为8，发酵分为2个阶段（1）细胞生长阶段，接种后20H,调节PH为60，加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为05G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为20，调节温度为30。0013（2）微生物转化阶段，从接种后20H开始,直到发酵结束，全部发酵时间为120小时。调节PH为70，流加加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为15G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为50，调节温度为35。发酵结束前40H，以消耗剩余的底物氢化可的松。0014发酵结束，用离心或过滤除去细胞，用。
9、乙酸乙酯萃取发酵液，使16羟基氢化可的松转入有机相，蒸出有机相，得到产品，产品收率90。0015实施例2发酵培养基成份葡萄糖14G/L,酵母浸膏7G/L,麦芽浸膏30G/L，KH2PO445G/L,K2HPO420G/L,PH70。底物为氢化可的松，在发酵过程中，产玫瑰色链霉菌将氢化可的松的16位羟基化，得到16羟基氢化可的松。0016发酵过程如下2级种子培养；在代夹套1000L发酵罐加入培养基，装料系数为08，灭菌，冷却至35，接种，接入产玫瑰色链霉菌ATCC21895,接种量为5，发酵分为2个阶段（1）细胞生长阶段，接种后24H,调节PH为65，加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为09。
10、G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为30，调节温度为35。0017（2）微生物转化阶段，从接种后24H开始,直到发酵结束，全部发酵时间为140小时。调节PH为75，流加加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为20G/L，通入洁净说明书CN104212868A3/3页5空气，使溶氧饱和度为60，调节温度为40。发酵结束前50H，以消耗剩余的底物氢化可的松。0018发酵结束，用离心或过滤除去细胞，用乙酸乙酯萃取发酵液，使16羟基氢化可的松转入有机相，蒸出有机相，得到产品，产品收率95。0019实施例3发酵培养基成份葡萄糖12G/L,酵母浸膏6G/L,麦芽浸膏35G/L，KH2PO445G/L,K2。
11、HPO420G/L,PH70。底物为氢化可的松，在发酵过程中，产玫瑰色链霉菌将氢化可的松的16位羟基化，得到16羟基氢化可的松。0020发酵过程如下3级种子培养；在代夹套10M3发酵罐加入培养基，装料系数为075，灭菌，冷却至33，接种，接入产玫瑰色链霉菌ATCC21895,接种量为7，发酵分为2个阶段（1）细胞生长阶段，接种后22H,调节PH为63，加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为07G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为25，调节温度为33。0021（2）微生物转化阶段，从接种后22H开始,直到发酵结束，全部发酵时间为130小时。调节PH为73，流加加入底物氢化可的松，使其在发酵液中。
12、浓度为18G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为55，调节温度为37。发酵结束前45H，以消耗剩余的底物氢化可的松。0022发酵结束，用离心或过滤除去细胞，用逆流法连续萃取法，以乙酸乙酯萃取发酵液，使16羟基氢化可的松转入有机相，蒸出有机相，得到产品，产品收率94。0023实施例4发酵培养基成份葡萄糖13G/L,酵母浸膏63G/L,麦芽浸膏37G/L，KH2PO445G/L,K2HPO420G/L,PH70。底物为氢化可的松，在发酵过程中，产玫瑰色链霉菌将氢化可的松的16位羟基化，得到16羟基氢化可的松。0024发酵过程如下3级种子培养；在代夹套30M3发酵罐加入培养基，装料系数为078，灭菌，。
13、冷却至3035，接种，接入产玫瑰色链霉菌ATCC21895,接种量为7，发酵分为2个阶段（1）细胞生长阶段，接种后23H,调节PH为63，加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为08G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为26，调节温度为32。0025（2）微生物转化阶段，从接种后23H开始,直到发酵结束，全部发酵时间为133小时。调节PH为702，流加加入底物氢化可的松，使其在发酵液中浓度为175G/L，通入洁净空气，使溶氧饱和度为55，调节温度为37。发酵结束前47H，以消耗剩余的底物氢化可的松。0026发酵结束，用离心或过滤除去细胞，用逆流法连续萃取法，以乙酸乙酯萃取发酵液，使16羟基氢化可的松转入有机相，蒸出有机相，得到产品，产品收率95。说明书CN104212868A。