技术领域
本发明涉及一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，属于微生物生产 利用领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate,EC）被世界卫生组织归为2A类致癌物质， 与丙烯胺同等危险。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等严重性肿瘤疾 病。氨基甲酸乙酯广泛存在于传统发酵食品中，包括酒类、酱油等食品。此前中 国酱油中的氯丙醇超标而被欧盟禁购的事件引起轩然大波。如今酱油中的氨基甲 酸乙酯引起了国际的广泛关注，而国内对酱油中氨基甲酸乙酯的降低方法未见报 道。对此我国的酱油行业应该吸取由于某些品种的酱油中氯丙醇超标引起广泛关 注而带来的被动局面的教训，及早地开展研究，突破国际市场对我国调味品出口 筑起的技术壁垒。
酱油中氨基甲酸乙酯前体物质主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。对中国南方一家 酱油厂的日式酱油研究结果表明：发酵终点时原油中乙醇含量为2.5%、瓜氨酸 含量为2.2g/L、尿素为57mg/L。通过底物反应实验得知，乙醇和瓜氨酸是酱油 中EC的主要前提物质。本研究采用在酱油发酵过程中加入一株嗜盐四联球菌降 解瓜氨酸，从而降低酱油中氨基甲酸乙酯的前体物质。嗜盐四联球菌是食品安全 菌。在酱油发酵过程中加入它会大大提升酱油风味，缩短生产周期。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的 方法，是在酱油酿造过程中添加嗜盐四联球菌，降解酱油酿造过程中氨基甲酸乙 酯的主要前体物质——瓜氨酸的含量。
所述嗜盐四联球菌是在成曲拌盐水时接入，使混曲中的嗜盐四联球菌达到 106～107CFU/mL。
所述嗜盐四联球菌优选嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）BBE R23， 保藏编号为CCTCC NO:M2013480，保藏日期为2013年10月20日，保藏单位 为中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学。
所述方法的具体步骤为：（1）制曲：脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5 min，降温至80℃放气。按比例接入麸皮、面粉，大豆、炒麦、麸皮、面粉的质 量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8x109个/g，恒温箱中30℃培 养，6-8h翻曲一次，培养46-48h后，曲变成嫩绿色，制曲完成。（2）发酵：成 曲与20%（w/v）盐水以体积比为1:1.7的比例混合，并接种嗜盐四联球菌，控温 10-15℃，发酵第7天接种107CFU/mL鲁氏酵母，发酵第14天接种107CFU/mL 鲁氏酵母，常温发酵，第80天结束发酵。
本发明在酱油制作过程中加入一株嗜盐四联球菌，相比未接种嗜盐四联球菌， 酱油中EC的重要前体物质瓜氨酸的含量减少了98%。而且增加了酱油中的游离 氨基酸含量，为将来工厂化降低酱油中EC含量同时提高酱油营养价值打下坚实 基础。
具体实施方式
EC含量的测定方法：
样品处理：将以1mL超纯水配制的含尿素、乙醇、瓜氨酸的95℃30min 热反应后的样品液，用0.22μm滤头过滤。
GC条件：Agilent DB-WAX30m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度： 230℃，柱室温度：初始温度60℃（5min），以3.5℃/min程序升温至150℃（保 持2min），以10℃/min，升到220℃（保持10min）；载气：高纯氦气，柱前压 80kPa，流速1mL/min，不分流，进样2uL。
MS条件：接口温度：220℃；电离方式：EI；电子能量：70Ev；电子源温 度230℃，四级杆温度150℃；调谐方式：标准调谐；SIM模式；定量离子62； 定性离子74,89；外标法定量。
EC标准曲线制作：用超纯水将EC标样配制成40μg/L、60μg/L、80μg/L、 100μg/L。用GC-MS检测，在以EC浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲 线。Y=1662.76x-18902.71,R2=0.997。
酱油中瓜氨酸含量的检测：
样品预处理：取1mL酱油样品，加入25mL容量瓶中。用5%(w/v)的三氯 乙酸定容至25mL，放在超声仪上超脱10min后，放置5min（防止过热），再 超脱10min。静置30min，玻璃棒混匀后在虑纸上过滤。取1mL样品经过0.22 μm虑头过滤后进样检测。
检测条件：安捷伦液相色谱仪Agilent-1100（美国安捷伦公司）；分析方法： 采用邻二甲苯（OPA）、9-怱甲基氯甲酸酯（FMOC）进行柱前衍生；色谱柱： ODS HYPERSIL（250mm×4.6mm×5μm）；柱温：40℃；流速：1.0ml/min； 紫外检测器：激发波长338nm、接收波长262nm(Pro,Hypro)。
流动相A相：称取8.0g结晶乙酸钠于1000mL烧杯中，加入1000mL水搅 拌至所有结晶水溶解，再加入225uL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸，将pH调 到7.20±0.05；加入5μL四氢呋喃，混合后备用。流动相B液：称取12.0g结晶 乙酸钠于800mL烧杯中，加入400mL搅拌至所有结晶溶解，滴加5%醋酸将pH 调到7.20±0.05，将此溶液加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合后备用。梯度 洗脱程序见表1。
表1氨基酸分析梯度洗脱表
实施例1酱油中EC前体物质分析
经测定，在工厂获得的日式工艺酱油原油杀菌前含尿素57.7mg/L、瓜氨酸 2.2g/L，杀菌（95℃,30min）后产生氨基甲酸乙酯40μg/L。通过考察EC前体 物质与EC生成反应动力学（见表2），确定了酱油中EC的前体物质有瓜氨酸、 尿素和乙醇。其中瓜氨酸和乙醇是造成日式酱油EC积累的主要前体物质。
根据酱油中尿素、瓜氨酸、乙醇含量设计了产生EC的底物反应实验。具体 如下：
反应1：用纯水配制尿素为0mg/L、瓜氨酸2g/L、乙醇2%（v:v）的混合 体系。
反应2：用纯水配制尿素50mg/L、瓜氨酸0g/L、乙醇2%（v:v）的混合 体系。
反应3：用纯水配制尿素50mg/L、瓜氨酸2g/L、乙醇0%（v:v）的混合 体系。
在95℃下灭菌30min产生EC与酱油原油中EC情况如表3：
表2酱油中前体物质含量和种类与生成EC浓度的关系
注：ND，未检测到。
由表2可知，由瓜氨酸与乙醇反应生成的EC量是尿素和乙醇反应生成量的 8倍；当乙醇含量为0μg/L时，即使有瓜氨酸和尿素也是不能产生EC的。由此 可知瓜氨酸和乙醇是酱油中EC的主要前体物质。
实施例2酱油酿制流程
脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5min，降温至80℃放气。按比例接入 麸皮、面粉（大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比=20:15:1:1，同时接入米曲霉孢 子（接种量为300g每吨成曲），恒温箱中30℃培养，6-8h翻曲一次，培养46-48 h，曲变成嫩绿色时制曲完成。成曲与20%盐水以体积比为1:1.7的比例混合，并 接入嗜盐四联球菌，接种量分别为105、106、107CFU/mL，并以不接种嗜盐四联 球菌的为对照，设置3个平行样，每个体积2000mL。控温10-15℃，第7天接 种鲁氏酵母（107CFU/mL），第14天接种鲁氏酵母（107CFU/mL），常温发酵， 第80天结束发酵。
实施例3酱油中瓜氨酸含量与嗜盐四联球菌接种量的关系
（1）嗜盐四联球菌浓菌液准备
在加入10%NaCl的MRS液体培养基（pH=7.0）中30℃培养嗜盐四联球菌 CCTCC NO:M2013479。在第三天时检OD600等于3.95，达到最大，菌液浓度 达到108CFU/mL。因此在第三天时收集菌体并用1%的生理盐水配置嗜盐四联球 菌浓菌液。
（2）将成曲与20%盐水混合并加入浓菌液
在酱油酿造过程中，成曲与盐水混合时接种嗜盐四联球菌浓溶液使混曲中的 四联球菌分别达到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL，并以不接种嗜盐四 联球菌的为对照。每种添加方式酱油中瓜氨酸含量取3个平行样的平均值。
（3）酱油中瓜氨酸含量的检测
不同嗜盐四联球菌CCTCC NO:M2013480接种量对酱油中瓜氨酸及总游离 氨基酸含量的影响，如表3、4所示。发酵起始时，瓜氨酸含量为0.403g/L。在 接种107CFU/mL嗜盐四联球菌的体系中，80天后酱油中瓜氨酸含量为0.0493g/L， 而不接种嗜盐四联球菌的体系瓜氨酸含量为2.1665g/L。说明接种107CFU/mL 的嗜盐四联球菌能大大降低了酱油中瓜氨酸的含量。接种量为106CFU/mL的体 系中瓜氨酸含量为0.504g/L，而接种量为105CFU/mL的体系中瓜氨酸含量反而 上升到3.099g/L。可见，接种量需达到106CFU/mL以上才能取得降低瓜氨酸含 量的效果。
对80天酱油中游离氨基酸含量的测定结果如表4所示：在嗜盐四联球菌接 种量为106CFU/mL、105CFU/mL、107CFU/mL和不接种嗜盐四联球菌的体系中， 游离氨基酸含量的最高值分别为58.81g/L、53.28g/L、40.85g/L、43.156g/L。 由此可见接种量为106CFU/mL对于提高总游离氨基酸最为有利。而接种量为107CFU/mL时，虽然可以大大降低瓜氨酸含量，但也影响了酱油中另一个重要指标。 因为游离氨基酸是酱油营养成分的检测指标。最终确定既可以降低酱油中瓜氨酸 含量，又可以增加酱油中游离氨基酸含量的接种量为106CFU/mL。
表3不同嗜盐四联球菌接种量时酱油中瓜氨酸含量
表480天酱油中总游离氨基酸含量
注：Control为空白对照，这里的游离氨基酸包括Asp Glu Ser His Gly Thr Cit Arg Ala Tyr Cys Val Met Phe Ile Orn Leu Lys Pro
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉 此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此 本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。