技术领域
本发明涉及精液保存技术领域，具体为一种猪精液冷冻保存方法。
背景技术
在我国，猪是最主要的饲养家畜，猪肉产量约占全国肉类总量的70％。近几年随着人民生活水平的提高，猪的育种方向从主要着眼于生长速度与瘦肉率的提高，转变为改善猪肉的品质，提高肉的风味。传统的选育方式世代间隔时间长，已不能适应市场需求，而采用猪冷冻精液技术，可充分利用优良种畜，缩短良种选育世代间隔时间，快速建立新的适合市场要求的种猪和商品猪杂交繁育体系。同时，近千年的饲养史，已在我国形成了数百种各具特色的地方品种，这是一份非常宝贵的财产，今后畜牧业的竞争，相当部分是遗传资源，优良基因利用的竞争，但近年国外猪种的引进杂交，已使我国有相当数量的地方品种灭绝或面临灭绝，而采用猪精液冷冻保存技术可有效保存我国地方猪种质资源，具有不可估量的社会意义和效益。现有技术中的猪精液保存方法对猪精液进行保存，再利用冷冻精液进行人工授精的母猪受胎率和产仔率较低而不能广泛应用，严重降低了优质公猪的利用率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪精液冷冻保存方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种猪精液冷冻保存方法,包括以下步骤：
A、采集新鲜猪精液进行预热处理：将新鲜猪精液加入离心管中，并将离心管置于30℃-40℃的温水中进行预热，预热时间为30min-40min；
B、对猪精液进行一次过滤离心处理：将预热后的存储有猪精液的离心管放入离心机中进行离心处理，之后将一次离心后的猪精液经十层无菌纱布过滤，得到猪精液A；
C、对猪精液进行一次稀释：将猪精液A倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入25℃的温水中进行摇匀，之后立即放入3℃的冰箱环境中保存3h；
D、对猪精液进行二次过滤离心处理：将一次稀释后的猪精液再次加入离心管中，并将离心管放入离心机中进行离心处理，之后将二次离心后的猪精液经八层无菌纱布过滤，得到猪精液B；
E、对猪精液进行二次稀释：将猪精液B倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入常温水中进行摇匀，之后立即放入4℃的冰箱环境中保存2h；
F、将稀释后的猪精液进行冷冻保存：将二次稀释后的猪精液装入冷冻管，置于液氮面上2cm，熏蒸10min后，直接投入液氮中，冷冻保存备用。
优选的，所述步骤C、步骤E中的精液稀释剂一致，其组份按重量份数包括葡萄糖20-40份、柠檬酸钠10-15份、椰油单乙醇酰5-12份、甘氨酸8-15份、青霉素2-5份、链霉素1-3份、脱脂乳1-3份、病毒唑2-5份、碳酸氢钠4-10份、三羟基甲基胺基甲烷5-15份以及纳米银离子3-8份。
优选的，所述步骤B中离心机速率为500-800转/分，离心时间为15min-20min。
优选的，所述步骤D中离心机速率为1000-1500转/分，离心时间为30min-40min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明操作简单，采用两次过滤和两次稀释，能够充分过滤掉猪精液中的杂质粒子，进一步提高精液的质量；另外采用的稀释液能够充分稀释猪精液，且不会对猪精液造成损伤，能够提高精液的活力；另外，在稀释液中加入纳米银离子，能够进一步延长了精液的保存时间。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明提供一种技术方案：一种猪精液冷冻保存方法,包括以下步骤：
A、采集新鲜猪精液进行预热处理：将新鲜猪精液加入离心管中，并将离心管置于30℃的温水中进行预热，预热时间为30min；
B、对猪精液进行一次过滤离心处理：将预热后的存储有猪精液的离心管放入离心机中进行离心处理，之后将一次离心后的猪精液经十层无菌纱布过滤，得到猪精液A；
C、对猪精液进行一次稀释：将猪精液A倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入25℃的温水中进行摇匀，之后立即放入3℃的冰箱环境中保存3h；
D、对猪精液进行二次过滤离心处理：将一次稀释后的猪精液再次加入离心管中，并将离心管放入离心机中进行离心处理，之后将二次离心后的猪精液经八层无菌纱布过滤，得到猪精液B；
E、对猪精液进行二次稀释：将猪精液B倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入常温水中进行摇匀，之后立即放入4℃的冰箱环境中保存2h；
F、将稀释后的猪精液进行冷冻保存：将二次稀释后的猪精液装入冷冻管，置于液氮面上2cm，熏蒸10min后，直接投入液氮中，冷冻保存备用。
本实施例中，步骤C、步骤E中的精液稀释剂一致，其组份按重量份数包括葡萄糖20份、柠檬酸钠10份、椰油单乙醇酰5份、甘氨酸8份、青霉素2份、链霉素1份、脱脂乳1份、病毒唑2份、碳酸氢钠4份、三羟基甲基胺基甲烷5份以及纳米银离子3份。
本实施例中，步骤B中离心机速率为500转/分，离心时间为15min。
本实施例中，步骤D中离心机速率为1000转/分，离心时间为30min。
实施例二：
本发明提供一种技术方案：一种猪精液冷冻保存方法,包括以下步骤：
A、采集新鲜猪精液进行预热处理：将新鲜猪精液加入离心管中，并将离心管置于40℃的温水中进行预热，预热时间为40min；
B、对猪精液进行一次过滤离心处理：将预热后的存储有猪精液的离心管放入离心机中进行离心处理，之后将一次离心后的猪精液经十层无菌纱布过滤，得到猪精液A；
C、对猪精液进行一次稀释：将猪精液A倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入25℃的温水中进行摇匀，之后立即放入3℃的冰箱环境中保存3h；
D、对猪精液进行二次过滤离心处理：将一次稀释后的猪精液再次加入离心管中，并离心管放入离心机中进行离心处理，之后将二次离心后的猪精液经八层无菌纱布过滤，得到猪精液B；
E、对猪精液进行二次稀释：将猪精液B倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入常温水中进行摇匀，之后立即放入4℃的冰箱环境中保存2h；
F、将稀释后的猪精液进行冷冻保存：将二次稀释后的猪精液装入冷冻管，置于液氮面上2cm，熏蒸10min后，直接投入液氮中，冷冻保存备用。
本实施例中，步骤C、步骤E中的精液稀释剂一致，其组份按重量份数包括葡萄糖40份、柠檬酸钠15份、椰油单乙醇酰12份、甘氨酸15份、青霉素5份、链霉素3份、脱脂乳3份、病毒唑5份、碳酸氢钠10份、三羟基甲基胺基甲烷15份以及纳米银离子8份。
本实施例中，步骤B中离心机速率为800转/分，离心时间为20min。
本实施例中，步骤D中离心机速率为1500转/分，离心时间为40min。
实施例三：
本发明提供一种技术方案：一种猪精液冷冻保存方法,包括以下步骤：
A、采集新鲜猪精液进行预热处理：将新鲜猪精液加入离心管中，并将离心管置于38℃的温水中进行预热，预热时间为38min；
B、对猪精液进行一次过滤离心处理：将预热后的存储有猪精液的离心管放入离心机中进行离心处理，之后将一次离心后的猪精液经十层无菌纱布过滤，得到猪精液A；
C、对猪精液进行一次稀释：将猪精液A倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入25℃的温水中进行摇匀，之后立即放入3℃的冰箱环境中保存3h；
D、对猪精液进行二次过滤离心处理：将一次稀释后的猪精液再次加入离心管中，并离心管放入离心机中进行离心处理，之后将二次离心后的猪精液经八层无菌纱布过滤，得到猪精液B；
E、对猪精液进行二次稀释：将猪精液B倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入常温水中进行摇匀，之后立即放入4℃的冰箱环境中保存2h；
F、将稀释后的猪精液进行冷冻保存：将二次稀释后的猪精液装入冷冻管，置于液氮面上2cm，熏蒸10min后，直接投入液氮中，冷冻保存备用。
本实施例中，步骤C、步骤E中的精液稀释剂一致，其组份按重量份数包括葡萄糖35份、柠檬酸钠13份、椰油单乙醇酰8份、甘氨酸12份、青霉素3份、链霉素1份、脱脂乳1份、病毒唑5份、碳酸氢钠8份、三羟基甲基胺基甲烷13份以及纳米银离子7份。
本实施例中，步骤B中离心机速率为700转/分，离心时间为18min。
本实施例中，步骤D中离心机速率为1400转/分，离心时间为38min。
实施例四：
本发明提供一种技术方案：一种猪精液冷冻保存方法,包括以下步骤：
A、采集新鲜猪精液进行预热处理：将新鲜猪精液加入离心管中，并将离心管置于35℃的温水中进行预热，预热时间为35min；
B、对猪精液进行一次过滤离心处理：将预热后的存储有猪精液的离心管放入离心机中进行离心处理，之后将一次离心后的猪精液经十层无菌纱布过滤，得到猪精液A；
C、对猪精液进行一次稀释：将猪精液A倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入25℃的温水中进行摇匀，之后立即放入3℃的冰箱环境中保存3h；
D、对猪精液进行二次过滤离心处理：将一次稀释后的猪精液再次加入离心管中，并离心管放入离心机中进行离心处理，之后将二次离心后的猪精液经八层无菌纱布过滤，得到猪精液B；
E、对猪精液进行二次稀释：将猪精液B倒入实验瓶并加入精液稀释剂，再将实验瓶放入常温水中进行摇匀，之后立即放入4℃的冰箱环境中保存2h；
F、将稀释后的猪精液进行冷冻保存：将二次稀释后的猪精液装入冷冻管，置于液氮面上2cm，熏蒸10min后，直接投入液氮中，冷冻保存备用。
本实施例中，
步骤C、步骤E中的精液稀释剂一致，其组份按重量份数包括葡萄糖30份、柠檬酸钠12份、椰油单乙醇酰8份、甘氨酸12份、青霉素3份、链霉素2份、脱脂乳2份、病毒唑3份、碳酸氢钠7份、三羟基甲基胺基甲烷10份以及纳米银离子5份。
本实施例中，步骤B中离心机速率为650转/分，离心时间为18min。
本实施例中，步骤D中离心机速率为1250转/分，离心时间为35min。
实验例：
将采用普通冷冻保存方法保存的猪精液与本发明各实施例得到的猪精液进行质膜完整率和存活率试验，得到数据如下表：
质膜完整率(％) 存活率(％) 普通保存 55.6 68.8 实施例一 91.8 92.6 实施例二 92.4 93.1 实施例三 92.5 91.5 实施例四 94.2 95.2
由以上表格数据可知，实施例四的保存方法得到的猪精液能够达到最佳效果。
本发明操作简单，采用两次过滤和两次稀释，能够充分过滤掉猪精液中的杂质粒子，进一步提高精液的质量；另外采用的稀释液能够充分稀释猪精液，且不会对猪精液造成损伤，能够提高精液的活力；另外，在稀释液中加入纳米银离子，能够进一步延长了精液的保存时间。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。